生物化学：第九章 DNA生物合成.ppt课件.ppt

1、 第九章第九章 DNA生物合成生物合成 周口师范学院生命科学系周口师范学院生命科学系 (2008. 12) 主要内容主要内容第一节第一节 DNADNA的复制的复制第二节第二节 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复第三节第三节 逆转录和其它复制方式逆转录和其它复制方式第四节第四节 DNADNA的体外复制的体外复制-PCR-PCR基因信息的传递lDNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。列顺序中。 lDNA通

2、过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中中心法则心法则。l在在RNA病毒中，其遗传信息贮存在病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA

3、，再由，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为信息的流向就称为反中心法则反中心法则。DNA dependent DNA polymeraseDDDPDNA dependent RNA polymeraseDDRPRNA dependent RNA polymeraseRDRPRNA dependent DNA polymeraseRDDPDNA复制（复制（DDDP）转录（转录（DDRP）RNA蛋白质蛋白质翻译翻译RNA复制（复制（RDRP）反转录（反转录（RDDP）第一节第一节 DNA的半保留复制的半保留复制一一、概念和实验依据概念和

4、实验依据二二、DNADNA聚合反应的条件聚合反应的条件三、三、DNADNA的复制的起始点和方式的复制的起始点和方式四、原核细胞四、原核细胞DNADNA的复制过程的复制过程五、真核细胞五、真核细胞DNADNA的复制的复制六、六、DNADNA复制的忠实性复制的忠实性 lDNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。 一、概念和实验依据一、概念和实验依据复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA 半保留复制模型半保留复制模型l按半保留复制方式

5、，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。l遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。lDNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明。l该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，将具有不同密度的DNA分离开。 DNA半保留复制的实验证明：半保留复制的实验证明：DNA半保留复制研究实验结果示意图复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图复制

6、中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Cairns实验实验) 将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA 。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分占整个染色体的三分之二，其中一条双链（ B ）仅有一股链是标记的；另外一股双链（ A ）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。ABC环状环状DNA的复制的复制 1 1） 底物底物(substrate(substrate) ) 2 2） 模板模板(template) (template) 3

7、3） 引发体和引发体和RNARNA引物引物4 4） 各种酶系各种酶系5) 5) 单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白 二二 DNADNA复制的条件复制的条件 l以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。1） 底物底物(substrate) (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 +PPiDNADNA复制过程中脱氧核糖核苷酸的聚合反应复制过程中脱氧核糖核苷酸的聚合反应lDNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。 2 ）模板）模板(temp

8、late)l引物酶引物酶(primerase)本质上是一种依赖本质上是一种依赖DNA的的RNA聚合酶（聚合酶（DDRP），），该酶以该酶以DNA为模板，聚合一段为模板，聚合一段RNA短链引物短链引物(primer)，以提供自由的，以提供自由的3-OH，使子代，使子代DNA链能够开始聚合。链能够开始聚合。l引物酶需组装成引发体才能催化引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。引物的合成。3） 引发体和引发体和RNA引物引物 在E.coli中，含有解螺旋酶(DnaB蛋白) 、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域的复合结构被称为引发体(primosome) 。 Dna A D

9、na B Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 含有解螺旋酶含有解螺旋酶(DnaB蛋白蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。 引发体的组装形成引发体的组装形成3 HO53 5 3 5 引物酶催化合成短链引物酶催化合成短链RNARNA引物分子引物分子 引物引物引物引物酶酶4) DNA复制的酶类a.a.引物酶引物酶(peimase(peimase) )和引发体和引发体(primosome(primosome) ) b.DNAb.DNA聚合酶聚合酶 (DNA polymetases(DNA

10、 polymetases) )c.DNAc.DNA连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）d.DNAd.DNA解螺旋酶解螺旋酶 (DNA helicase(DNA helicase) )e.e.拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase(topoisomerase) ) (兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。)解旋酶解旋酶DNA聚合酶聚合酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物酶和引发引物酶和引发体体DNA聚合聚合酶酶ISSB3 3 5 3 5 5 RNA引物引物 DNA复制酶复制酶类作用类作用点模型点模型 DNA聚合酶聚合

11、酶全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 ( DNA-dependent DNA polymerase, DDDP )简称：简称：DNA-pol活性：活性： 1. 1. 5 53 3 的聚合酶活性的聚合酶活性 2. 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNADNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水

12、解。 DNADNA聚合酶的核酸外切酶活性聚合酶的核酸外切酶活性 l在原核生物中，目前发现的在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有聚合酶有三种，分别命名为三种，分别命名为DNA聚合酶聚合酶（pol ），），DNA聚合酶聚合酶（pol ），），DNA聚合酶聚合酶（pol ），这三种酶都属于具有多种酶活），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。性的多功能酶。l参与参与DNA复制的主要是复制的主要是pol 和和pol 。 种类和生理功能种类和生理功能lpol 为具有三种酶活性的单一肽链的大分子蛋白质，可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段保留了两种酶活性,即5 3 聚 合 酶 和35外切酶活性

13、，通常被称为Klenow fragment。 Klenow片段的分子结构片段的分子结构lpol 由十种亚基组成不对称异源二聚体结构，其中亚基具有53聚合DNA的酶活性，具有复制DNA的功能；而 亚 基 具 有35外切酶的活性，与DNA复制的校正功能有关。 pol 的二聚体结构的二聚体结构大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能 延长因子延长因子DNADNA聚合酶聚合酶 两个两个 亚基夹住亚基夹住DNADNADNADNA聚合酶聚合酶异二聚体异二聚体核心酶核心酶校对校对引物的结引物的结合和识别合和识别促使核心促使核心酶二聚化酶二聚化 原核生物三种原核生物三种DNADNA聚合酶比较聚合酶比较polpol

14、 polpol polpol 5353聚合酶活性聚合酶活性+ + + +5353外切酶活性外切酶活性+ +- - -3535外切酶活性外切酶活性+ + + +生理功能生理功能填补缺口填补缺口修复损伤修复损伤校正错误校正错误未知未知复制复制DNADNA校正错误校正错误真核生物五种真核生物五种DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。参与低保真度的复制 。 DNA-pol 在线粒体DNA复制中起催化作用。 DNA-pol 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。 DNA-pol 在复制过程中起校读、修复和填补缺 口的作用。 DNA-pol 真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶D

15、NA-polDNA-pol 分子量分子量(kD)(kD)16.516.54.04.014.014.012.512.525.525.55353聚合酶活性聚合酶活性+? ?+3535外切酶活性外切酶活性- - -+ + + +生理功能生理功能起始引发起始引发引物酶活引物酶活性性低保真低保真度复制度复制线粒体线粒体DNADNA复制复制延长子延长子代链的代链的主要酶主要酶, ,解螺旋解螺旋酶活性酶活性填补缺口填补缺口, ,切除修复切除修复, ,重组重组lDNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。 DNA连接酶连接酶 DNA

16、连接酶连接酶ATP（NAD+）ADP+Pi（NMN+AMP）HO5POO-O-O353POO-O-O3553DNADNA连接酶的连接作用连接酶的连接作用DNA连接酶催化的条件连接酶催化的条件 需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基； 未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的； 需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。 DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 是基因工程的重要工具酶之是基因工程的重要工具酶之一。

17、一。 DNA连接酶的作用连接酶的作用l解螺旋酶解螺旋酶，又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白。l每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。 解螺旋酶解螺旋酶(helicase) DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase)人类拓扑异构酶人类拓扑异构酶的分子结构的分子结构能够松解能够松解DNADNA超螺旋结构的酶超螺旋结构的酶1010 8 8 局部解链后局部解链后DNADNA复制过程中正超螺旋的形成复制过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成拓扑异构酶的作用特点拓扑异构酶的作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键

18、 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶分分 类类拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。DNA拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶的作用机制 l单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（single strand binding pr

19、otein, SSB），），又称螺旋反稳蛋白又称螺旋反稳蛋白(HDP)，是一些能够与单链，是一些能够与单链DNA结合的蛋白质结合的蛋白质因子。因子。5 ）单链）单链DNA结合蛋白结合蛋白SSB的生理作用l使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于其作为模板复制子代DNA；l保护单链DNA，避免核酸酶的降解。 lDNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点复制起始点(origin) 。l在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生在原核生物中，复制起始点通常为一个

20、，而在真核生物中则为多个。物中则为多个。1) 有一定的复制起始点有一定的复制起始点三、三、DNA的复制的起始点和方式的复制的起始点和方式细菌和酵母菌中细菌和酵母菌中DNADNA复制起始点的碱基序列复制起始点的碱基序列大肠杆菌大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的成串排列的三个三个13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点四个四个9bp序列序列DnaADnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSB大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型l习惯上把两个相邻习惯

21、上把两个相邻DNA复制起始点之间的距离（或复制起始点之间的距离（或DNA片段）定为一个片段）定为一个复制子复制子(replicon) 。l复制子是独立完成复制的功能单位。复制子是独立完成复制的功能单位。lDNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为结构称为复制叉复制叉。复制子和复制叉复制子和复制叉53oriorioriori535533553复制子复制子3复制起始点与复制子示意图复制起始点与复制子示意图复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）lDNA复制时，以复制起始点(origin)为中心，向两个方向进行解链，形成两个延伸方向相反的复制

22、叉，称为双向复制。l但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象2) 双向复制双向复制(bidirectional replication)DNA的双向和单向复制的双向和单向复制环状环状 DNA复制时复制时所形成的所形成的结构结构起始点起始点复制叉的推进复制叉的推进复制叉复制叉起始点起始点起始点起始点起始点起始点复制叉复制叉复制叉复制叉未复制未复制DNA单向复制单向复制双向复制双向复制oriterA B CA. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termin

23、ation, ter)DNADNA的双向复制示意图的双向复制示意图l参与参与DNA复制的复制的DNA聚合酶，必须以一段具有聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（端自由羟基（3-OH）的）的RNA作为作为引物引物(primer) ，才能开始聚合子代，才能开始聚合子代DNA链。链。lRNA引物的大小，在引物的大小，在原核原核生物中通常为生物中通常为50100个核苷酸，而在个核苷酸，而在真核真核生物中约为生物中约为10个核苷个核苷酸。酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱的碱基顺序相配对。基顺序相配对。 3) 需要引物需要引物 lDNA聚合酶只能以聚合酶只能以53方向聚合

24、方向聚合子代子代DNA链链，即，即模板模板DNA链链的方向必须是的方向必须是35。l由于由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代条亲代DNA链作为模板聚合子代链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的链时，子代链的聚合方向也是不同的。聚合方向也是不同的。4)半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication)3 5 3 5 3 5 3 5 解链方向解链方向领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)DNADNA的半不连续复制的半不连续复制3 5 l以以35方向的亲代方

25、向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为这一条链被称为领头链领头链(leading strand)。l以以53方向的亲代方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链，这条链被称为被称为随从链随从链(lagging strand)。l领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半半不连续性不连续性。 领头链和随从链领头链和随从链l由于亲代

26、由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从在复制时，由随从链所形成的一些子代链所形成的一些子代DNA短链称为短链称为冈崎片段冈崎片段(Okazaki fragment)。l冈崎片段的大小，在冈崎片段的大小，在原核原核生物中约为生物中约为10002000个核个核苷酸，而在苷酸，而在真核真核生物中约为生物中约为100个核苷酸。个核苷酸。 冈崎片段冈崎片段(Okazaki fragment)四、原核细胞DNA的复制过程1）复制的起始）复制的起始2）复制的延长）复制的延长 3）复制的终止）

27、复制的终止 DNA复制的起始阶段，由下列步骤构成。a. 识别起始点：识别起始点：由解螺旋酶由解螺旋酶(DnaB蛋白蛋白) 、DnaC蛋白、引物酶蛋白、引物酶(DnaG蛋白蛋白)和和DNA复制起始区域形成引发体；复制起始区域形成引发体；b. 解旋解链：解旋解链：由拓扑异构酶和解链酶作用，使由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。 c. SSB结合：结合：单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。上，形成复制叉。d. 合成引物

28、：合成引物：在引物酶的催化下，以在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得片段，从而获得3端自由羟基（端自由羟基（3-OH）。）。 1）复制的起始）复制的起始 Dna A Dna B Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。 引发体的组装形成引发体的组装形成3 HO53 5 3 5 引物酶催化合成短链引物酶催化合成短链RNARNA引物分子引物分子 引物引物引物引物酶酶2 2）复制的延长）复制的延长 l复制的延长指在复制的延长指在D

29、NA聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以35方向的方向的亲代亲代DNA链为模板，从链为模板，从53方向聚合子代方向聚合子代DNA链。链。其化学本质是其化学本质是dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。 l在原核生物中，参与在原核生物中，参与DNA复制延长的是复制延长的是DNA聚合酶聚合酶；而在真核生物中是而在真核生物中是DNA聚合酶聚合酶。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-polDNADNA复制的延长过程复制的延长过程领头链的合成过程

30、领头链的合成过程随从链的合成过程随从链的合成过程DNADNA聚合酶聚合酶催化领头链和随从链同时合成催化领头链和随从链同时合成DNA复制过程简图复制过程简图3 3）复制的终止）复制的终止 l在复制过程中形成的在复制过程中形成的RNARNA引物，需由引物，需由RNARNA酶酶来水来水解去除；解去除；lRNARNA引物水解后遗留的缺口，由引物水解后遗留的缺口，由DNADNA聚合酶聚合酶（原核生物）或（原核生物）或DNADNA聚合酶聚合酶 （真核生物）催化（真核生物）催化延长缺口处的延长缺口处的DNADNA，直到剩下最后一个磷酸酯键，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。的缺口。（a）去除引物，填补缺口：）

31、去除引物，填补缺口：l在在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的双螺酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的双螺旋旋DNA长链后分开。长链后分开。 （2）连接冈崎片段，分开子代）连接冈崎片段，分开子代DNA5 5 5 RNA酶酶OH P5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接五、真核细胞DNA的复制l真核生物真核生物DNADNA复制复制的特点的特点l真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶l端粒和端粒酶端粒和端粒酶（telomer

32、ase） 真核生物真核生物DNADNA复制的特点复制的特点A A、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列（制序列（ARSARS）或复制基因）或复制基因(replicator);(replicator);多复制眼，多复制眼，呈双向复制，多复制子。呈双向复制，多复制子。D D、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物染色体开始复制；而在快速生长的原核生物染色体DNADNA复制复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往

33、往采用更多的复制起点。往往采用更多的复制起点。B B、冈崎片段长约、冈崎片段长约200bp200bp。C C、真核生物、真核生物DNADNA复制速度比原核慢，速度为复制速度比原核慢，速度为100010003000bp/min(3000bp/min(仅为原核生物的仅为原核生物的1/201/201/501/50）。）。真核细胞真核细胞DNA复制的特点复制的特点 多个起点复制多个起点复制起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点G G、RPARPA：真核生物的单链结合蛋白；：真核生物的单链结合蛋白；RNaseHRNaseH1 1和和MF-1MF-1切除切除RNARNA引物；引物；DNADNA聚

34、合酶聚合酶填补缺口。填补缺口。E E、真核生物有多种、真核生物有多种DNADNA聚合酶聚合酶,DNA,DNA聚合酶聚合酶（）是真正的复制酶，在是真正的复制酶，在PCNAPCNA存在下有持续的合成能力。存在下有持续的合成能力。PCNAPCNA称为增殖细胞核抗原，相当于大肠杆菌称为增殖细胞核抗原，相当于大肠杆菌DNADNA聚合聚合酶酶的的- -夹子，夹子，RFCRFC蛋白相当于夹子装配器。蛋白相当于夹子装配器。F F、真核生物线性染色体两端有端粒结构、真核生物线性染色体两端有端粒结构. .它是由许多它是由许多成串的短重复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段成串的短重复序列组成，端粒功能是稳定染色体末

35、段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5-5-末段在消除末段在消除RNARNA引物后造成的空缺，使染色体引物后造成的空缺，使染色体保保持持一定长度一定长度。端粒酶是含一段。端粒酶是含一段RNARNA的逆转录酶的逆转录酶. .真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶 分子量分子量亚基数亚基数细胞内分布细胞内分布酶活力百分比酶活力百分比外切酶活力外切酶活力DNA聚合酶聚合酶 110-23，000多个多个细胞核细胞核80%无无120，000一个一个细胞核和线粒体细胞核和线粒体2 15%无无-400，000一个一个细胞核细胞核+10

36、25% 5 -3 外切酶外切酶DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 45，000一个一个细胞核细胞核10 15%无无真核细胞真核细胞DNADNA复制示意图复制示意图真核和原核真核和原核DNA细胞复制比较细胞复制比较 端粒（端粒（telomere）是指真核生物染色是指真核生物染色体线性体线性DNA分子末分子末端的结构部分，通端的结构部分，通常膨大成粒状。常膨大成粒状。真核生物端粒和端粒酶真核生物端粒和端粒酶 功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 保证保证DNA复制的完整性复制的完整性端粒的结构特点端粒的结构特点 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 末端末端

37、DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、T碱基碱基的短的短 序列。序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒酶（端粒酶（telomerase） DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，实质上是一种逆转录酶，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶 端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hT

38、R) 端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 端粒酶的组成和作用端粒酶的组成和作用l线性线性DNA在复制完成后，其末端由于引物在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。）的催化下，进行延长反应。5 3 3 5 5 3 3 5 端粒酶的作用机制端粒酶的作用机制爬行模型爬行模型端粒酶的爬

39、行模型（动画演示）端粒酶的爬行模型（动画演示）六 DNA复制的忠实性 DNA复制过程是一个高度精确的过程。据估计，大肠杆复制过程是一个高度精确的过程。据估计，大肠杆菌菌DNA复制复制5 109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点原因主要有以下三点: DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，错配率为配对原则，错配率为7 10-6 ） DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5 外切酶切除）外切酶切除） 起始时以起始时以RNA作为引物作为引物复制的保真性和碱基选择lDNA聚合

40、酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。（磷酸二酯键）键的有序形成。l嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。 DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现外切酶活性。不表现外切酶活性。DNA聚合酶的校对功能聚

41、合酶聚合酶错配硷基错配硷基复制方向复制方向正确核正确核苷酸苷酸5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除错配切除错配核苷酸核苷酸起始时以起始时以RNARNA作为引物的作用作为引物的作用 DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA 聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高

42、忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。 第二节 DNA的损伤（突变）与修复 一、一、DNA突变及意义突变及意义二、引起二、引起DNA突变的因素突变的因素三、三、 DNA突变的分子改变类突变的分子改变类型型四、四、 DNA损伤修复机制损伤修复机制l由自发的或环境的因素引起由自发的或环境的因素引起DNADNA一级结构的任何异常的改变称为一级结构的任何异常的改变称为DNADNA的损伤，也称为突变（的损伤，也称为突变（mutationmutation）。）。l常见的常见的DNADNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。组等。 一

43、、一、DNA突变及意义突变及意义l突变是进化、分化的分子基础突变是进化、分化的分子基础l突变导致基因型改变突变导致基因型改变l突变导致死亡突变导致死亡l突变是某些疾病的发病基础突变是某些疾病的发病基础（1）自发因素：）自发因素：自发脱碱基：由于自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。

44、百个核苷酸残基。复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。生频率较低。 二、二、 引起突变的因素引起突变的因素 由紫外线、电离辐射、由紫外线、电离辐射、X射线等引起的射线等引起的DNA损伤。损伤。其中，其中，X射线和电离辐射常常引起射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而链的断裂，而紫紫外线外线常常引起常常引起嘧啶二聚体嘧啶二聚体的形成，如的形成，如TT，TC，CC等二等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。结构，因而会引起复制障碍。 （2）物理因

45、素：）物理因素：嘧啶二聚体的形成 UV 脱氨剂脱氨剂：如：如亚亚硝酸与亚硝酸硝酸与亚硝酸盐盐，可加速，可加速C C脱氨基生成脱氨基生成U U，A A脱氨基生成脱氨基生成H H。 （3）化学因素：）化学因素： 烷基化剂烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。至可引起邻近碱基的交联。 DNADNA加合剂加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。芘，与嘌呤共价结合引起损伤。 碱基类似

46、物碱基类似物：如：如5-FU5-FU， 6-6-巯基嘌呤（巯基嘌呤（6-MP6-MP）等，）等，可掺入到可掺入到DNADNA分子中引起损伤或突变。分子中引起损伤或突变。 断链剂断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNADNA链的断裂。链的断裂。 三、突变的分子改变类型 转转换换相相同同类类型型碱碱基基的的取取代代。 颠颠换换不不同同类类型型碱碱基基的的取取代代。 点点突突变变 插插入入增增加加一一个个碱碱基基。 缺缺失失减减少少一一个个碱碱基基。 插插入入 增增加加一一段段顺顺序序。 缺缺失失 减减少少一一段段顺顺序序。 复复突突变变 倒倒位位 一一段

47、段碱碱基基顺顺序序发发生生颠颠倒倒。 移移位位 一一段段碱碱基基顺顺序序的的位位置置发发生生改改变变。 重重排排 一一段段碱碱基基顺顺序序与与另另一一段段碱碱基基顺顺序序发发生生交交换换。 DNA突变的类型 -T-C-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-G-C-G-A-C-A-T-G-C-转换转换野生型基因野生型基因 -T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-颠换颠换碱基对的置换碱基对的置换(substitution)移码突变移码突变(

48、framesshift mutation) -T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入插入 -T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失缺失ATDNA分子上单一碱基的改变称点突变(point mutation)发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 转换转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。或嘧啶变嘌呤。 颠换颠换点突变点突变(point mutation)镰形

49、红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA) 亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因血红蛋白血红蛋白 -亚基的点突变亚基的点突变 缺失缺失 一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子大分子上消失。上消失。 插入插入 原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到入到DNA大分子中间。大分子中间。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排

50、列顺序发生改变。 缺失或插入都可导致缺失或插入都可导致框移突变框移突变。框移突变框移突变谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引起的框移突变缺失引起的框移突变DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。由基因重排引起的两种地中海贫血基因型由基因重排引起的两种地中海贫血基因型 重排重排(重组重组Recombination) DNA DNA损伤修复损伤修复(repair(repair) ) ：是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态光修复光修复(lig