第13章-DNA的生物合成-复制-课件.ppt

1、第第13章章 DNA的生物合成的生物合成复制复制DNA Biosynthesis：Replication本章主要内容本章主要内容v 中心法则中心法则v DNA的半保留复制的半保留复制v 复制系统的特征复制系统的特征v DNA复制的机制复制的机制v DNA结构的完整性结构的完整性重点与难点：重点与难点：大肠杆菌大肠杆菌 DNA复制的复制的过程、真核过程、真核 生物生物DNA复制特点、复制特点、 DNA的损的损伤和修复。伤和修复。 Watson and Crick， 1953人类科学发展历史人类科学发展历史上的伟大里程碑。上的伟大里程碑。中心法则揭示了遗传信息的传递方向。中心法则揭示了遗传信息的传

2、递方向。1958年年F. Crick提出中心法则提出中心法则从从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则中心法则。Reverse transcription复制：复制：亲代亲代DNA或或RNA在一系列酶的作用在一系列酶的作用 下，生成与亲代相同的子代下，生成与亲代相同的子代DNA或或 RNA的过程。的过程。转录：转录：以以DNA为模板，按照碱基配对原则为模板，按照碱基配对原则 将其所含的遗传信息传给将其所含的遗传信息传给RNA，形，形 成一条与成一条与DNA链互补的链互补的RNA的过程。的过程。几个重要概念几个重要概念DNA的的复制复制 (replicatio

3、n)复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA 由亲代由亲代DNA合成两个相同的子代合成两个相同的子代DNA的过程。的过程。 翻翻 译：译：以以mRNA为模板，将为模板，将mRNA的密码的密码解读成蛋白质的解读成蛋白质的AA 顺序的过程顺序的过程。逆转录：逆转录：以以RNA为模板，在逆转录酶的作为模板，在逆转录酶的作 用下，生成用下，生成DNA的过程。的过程。一、一、DNA的半保留复制的半保留复制 由亲代由亲代DNA生成子代生成子代DNA时，每个时，每个新形成的子代新形成的子代DNA中，一条链来自亲代中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留

4、复制。复制方式叫半保留复制。1. 概概 念念(semi-conservative replication)2. 半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据 1958年年Meselson & stahl用用同位素同位素示踪标记示踪标记加加密度梯度离心技术密度梯度离心技术，证明，证明了了DNA是采取半保留的方式进行复制。是采取半保留的方式进行复制。 15N DNA14N- 15N DNA14N DNA14N- 15N DNA亲代亲代DNA分子分子第一代第一代DNA 分子分子第二代第二代DNA 分子分子3. 半保留复制的意义半保留复制的意义 使亲代使亲代DNA所含的信息以极高的准确所含的信息以极高的准

5、确 度传递给子代度传递给子代DNA分子。分子。 DNA通过复制和基因表达这两种主要通过复制和基因表达这两种主要 功能，决定了功能，决定了生物的特性和类型生物的特性和类型并体并体 现了遗传过程的现了遗传过程的相对保守性相对保守性。二、复制系统的特征二、复制系统的特征nDNA的复制开始于一个特定的位点，称为的复制开始于一个特定的位点，称为复复制起始点制起始点（原点，（原点，Ori）。在原核生物只有一）。在原核生物只有一个起始点，而在真核生物有多个起始点。个起始点，而在真核生物有多个起始点。n从原点开始将从原点开始将DNA链解开，在复制的部分同链解开，在复制的部分同时进行解链与合成，形成一个分叉，称

6、为时进行解链与合成，形成一个分叉，称为复复制叉制叉（replication fork）。）。 两个起始点，两个复制叉两个起始点，两个复制叉 一个起始点，一个复制叉一个起始点，一个复制叉 双向复制：双向复制：从一个起始点开始，沿两个相从一个起始点开始，沿两个相反方向各生长出两条链，形成两个复制叉。反方向各生长出两条链，形成两个复制叉。复制的方向：复制的方向：三、三、DNA复制的机制复制的机制4 原核细胞原核细胞DNA的复制的复制4 真核细胞真核细胞DNA的复制的复制（一）原核细胞（一）原核细胞DNA的复制的复制n DNA复制起始的酶类复制起始的酶类及蛋白及蛋白n DNA聚合酶聚合酶n RNA引物

7、引物n DNA连接酶连接酶n DNA复制的过程复制的过程1. DNA复制起始的酶类复制起始的酶类及蛋白及蛋白 解螺旋酶解螺旋酶（Helicase)：在复制的起在复制的起始点上解开双螺旋。始点上解开双螺旋。n 解螺旋酶解螺旋酶n 解螺旋酶解螺旋酶 n Rep蛋白蛋白 解链过程中，解链过程中，DNA分子会过度拧紧、分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，出现超螺旋。打结、缠绕、连环等现象，出现超螺旋。 拓扑异构酶拓扑异构酶 (DNA topoisomerase)作用作用：解除由解链酶造成的拓扑张力，：解除由解链酶造成的拓扑张力，能够松解能够松解DNA超螺旋结构，兼具有内超螺旋结构，兼具有内切酶和连

8、接酶活力，能迅速使切酶和连接酶活力，能迅速使DNA链链断开又接上。断开又接上。 拓扑异拓扑异构酶构酶使使DNA的一条的一条链链断裂和再连接，断裂和再连接，使使DNA解链旋转不致打结解链旋转不致打结DNA变变为松弛状态为松弛状态，反应不需反应不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶有称旋转酶，有称旋转酶，DNA分子分子两两条条链断链断裂和再连接裂和再连接，通过切口使超螺旋通过切口使超螺旋松弛，反应需要松弛，反应需要ATP 。单链单链DNA结合蛋白结合蛋白 （single stranded DNA binding protein, SSB） 稳定已经解开成两股的稳定已经解开成两股的DNA单链，单链，与解开

9、的单链与解开的单链 DNA 结合，防止其重结合，防止其重新配对形成双链新配对形成双链 DNA 或被核酸酶降或被核酸酶降解。解。SSB的生理作用的生理作用1. 稳定单链稳定单链DNA，便于其作为模板复，便于其作为模板复 制子代制子代DNA；2. 保护单链保护单链DNA，避免核酸酶的降解。，避免核酸酶的降解。2. DNA聚合酶聚合酶n有从有从53 延伸多核苷酸链的聚合酶的活性；延伸多核苷酸链的聚合酶的活性；n有从有从35 外切酶的活性，以切除可能错配的外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸；核苷酸；n有从有从53 外切酶的活性，其作用是切除引物。外切酶的活性，其作用是切除引物。DNA聚合酶聚合酶 I

10、 ： 用于切除引物用于切除引物RNA，并填补留下的空隙，并填补留下的空隙DNA聚合酶聚合酶II：n活性弱活性弱, 作用与聚合酶作用与聚合酶III相似相似n5 3 聚合酶功能聚合酶功能n3 5 外切酶活性，外切酶活性，n无无5 3 外切酶活性外切酶活性。可能在修复。可能在修复紫外光引起的紫外光引起的DNA损伤中起作用。损伤中起作用。DNA聚合酶聚合酶III 主要的复制酶，兼有校读、纠错的功能主要的复制酶，兼有校读、纠错的功能n由由10种亚基组成。有从种亚基组成。有从53 延伸多核苷酸链的延伸多核苷酸链的聚合酶聚合酶活性活性，有模板依赖性，其延伸的方式是依据碱基互补配，有模板依赖性，其延伸的方式是

11、依据碱基互补配对的原则，将原料对的原则，将原料dNTP与末端核苷酸游离的与末端核苷酸游离的3 OH以以3, 5磷酸二酯键连接，同时释出一个磷酸二酯键连接，同时释出一个PPi 。DNA聚合酶延聚合酶延伸多核苷酸链的方向总是伸多核苷酸链的方向总是5 3；n有有从从35 外切酶的活性外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸；，以切除可能错配的核苷酸；n有有53 外切酶活性外切酶活性。 以四种脱氧核糖核苷酸（以四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）作底物。）作底物。三种聚合酶的共性三种聚合酶的共性: 反应需要接受模板的指导，可以利用反应需要接受模板的指导，可以利用DNA双链作为模板，亦可以单链双链作为模板，亦可以

12、单链DNA作为模板。作为模板。N3 5 5 OOH OH PPP-O-CH2OH 反应需要有游离的反应需要有游离的3-羟基作为引物。羟基作为引物。 聚合方向总是聚合方向总是5 3。PPi5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性（聚合酶外切酶活性（聚合酶I , III）?切除复制时合成的切除复制时合成的RNA引物。引物。 能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 外切酶活性外切酶活性DNA聚合酶聚

13、合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶不同种类亚基数目不同种类亚基数目1710相对分子质量相对分子质量103 00088 000900 000 5 3 核酸聚合酶核酸聚合酶活性活性+3 5 核酸外切酶核酸外切酶活性活性+5 3 核酸外切酶核酸外切酶活性活性+-+聚合速度（核苷酸聚合速度（核苷酸/分）分）1 0001200240015 00060 000持续合成能力持续合成能力32001500500 000分子数分子数/细胞细胞4001001020功能功能切除引物，修复切除引物，修复修复修复复制复制3. RNA引物引物n所有的所有的 DNA 聚合酶都要求一个有自由聚合酶都要求一个有自由 3-O

14、H 的引物来起始的引物来起始 DNA 的合成。这段的合成。这段 RNA 长长 510 个核苷酸，由一种特异的个核苷酸，由一种特异的 RNA 聚合酶聚合酶合成，此酶称为合成，此酶称为引物酶引物酶（primerase）。）。n引物酶只有复制起始的一些蛋白质形成引发引物酶只有复制起始的一些蛋白质形成引发体体（primosome）才能催化引物合成。）才能催化引物合成。3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3 3 5 先导链先导链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)引物引物引物引物引物引物 DNA聚合酶校对复制中的错误核苷酸，导致在形聚合酶校对复制中的错误核苷酸

15、，导致在形成新的磷酸二酯键前检测前一个碱基是否正确，成新的磷酸二酯键前检测前一个碱基是否正确，决定了不能从头合成。决定了不能从头合成。先合成一段低忠实性的多核苷酸来开始先合成一段低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合的合成，并以核糖核苷酸来标记是成，并以核糖核苷酸来标记是“暂时暂时”的。当的。当DNA开始聚合以后在以开始聚合以后在以53核酸外切酶的功能核酸外切酶的功能切除，以脱氧苷酸代替。切除，以脱氧苷酸代替。为何先合成为何先合成RNA引物，然后切除？引物，然后切除？增加了复制的复杂性，但保证了复制的忠实性。增加了复制的复杂性，但保证了复制的忠实性。4. DNA连接酶（连接酶（DNA ligase

16、） 连接连接DNA链链3-OH末端和相邻末端和相邻DNA链的链的5-P末端，末端，使二者生成磷酸二酯键使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻，从而把两段相邻的的DNA链连成完整的链。原核生物通过分解链连成完整的链。原核生物通过分解NAD为为NMN和和Pi提供能量，真核生物则消耗提供能量，真核生物则消耗ATP。DNA连接酶的作用连接酶的作用n DNA连接酶在复制中起最后接合缺连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。口的作用。n在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。缺口作用。n是基因工程的重要工具酶之一。是基因工程的重要工具酶之一。 复制的起始复制的起始5. DNA复制

17、过程复制过程 由解螺旋酶解链，形成复制叉，由解螺旋酶解链，形成复制叉，SSB结合并结合并稳定解开的单股稳定解开的单股DNA链；引物酶与上述因子、酶链；引物酶与上述因子、酶构成引发体，并合成构成引发体，并合成RNA引物。解链造成的超螺引物。解链造成的超螺旋，由拓扑异构酶实现超螺旋的转型，即把正超旋，由拓扑异构酶实现超螺旋的转型，即把正超螺旋转变为有利于复制的负超螺旋。螺旋转变为有利于复制的负超螺旋。 复制的延伸复制的延伸在在DNA-pol III催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是质是磷酸二酯键磷酸二酯键

18、的不断生成。的不断生成。 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33DNA-pol复制叉起点复制叉延伸延伸起点前导链前导链后随链后随链3535半不连续复制半不连续复制在在DNA复制时，前导链是连续合复制时，前导链是连续合成的，而后随链的合成是不连续的，这种复制成的，而后随链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。方式称为半不连续复制。前导链连续复制前导链连续复制前导链前导链（leading chain）：为连续合成，）：为连续合成，合成方向与解链方向一致合成方向与解链方向一致。后随链不连续复制后随链不连续复制 后随链后随链的复制必须等待模板链解开

19、至足的复制必须等待模板链解开至足够长度，才能从够长度，才能从53 方向生成引物然后复制，方向生成引物然后复制，为不连续合成，合成方向与复制叉移动的方为不连续合成，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的成一条完整的DNA链。链。后随链的合成后随链的合成冈崎片段：冈崎片段：在在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而复制过程中，前导链能连续合成，而后随链只能是断续的合成后随链只能是断续的合成53 的多个短片段，的多个短片段，这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。冈崎片段。真核

20、生物中真核生物中100-200个核苷酸（核小体的个核苷酸（核小体的DNA单位）。原核生物中单位）。原核生物中1000-2000个核苷酸（相个核苷酸（相当于一个顺反子）。当于一个顺反子）。复复制制延延长长简简图图 复制的终止复制的终止n由由DNA聚合酶聚合酶I完成切除引物，并且填补空完成切除引物，并且填补空隙，由隙，由DNA连接酶连接酶将将DNA片段连接起来。片段连接起来。n原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复，双向复制的复制片段在复制的终止点制片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。n复制的起始点和终止点刚好把环复制的起始点和终止点刚好把环DNA分为分为两个半圆，两个方

21、向各进行两个半圆，两个方向各进行180，同时在终，同时在终止点汇合。止点汇合。 最末端冈崎片断的最末端冈崎片断的RNA引物切除后可引物切除后可求助于另半圈求助于另半圈DNA链向前延伸来填补链向前延伸来填补 1. 真核生物的双向复制真核生物的双向复制 真核生物染色体有真核生物染色体有多个起始点多个起始点，是，是多复制子的复制。多复制子的复制。 由一个起始点控制的复制由一个起始点控制的复制DNA单位单位称为一个称为一个复制子复制子 (replicon) ，复制子是独复制子是独立完成复制的功能单位。立完成复制的功能单位。 （二）真核细胞（二）真核细胞DNA的复制的复制2. 真核生物的真核生物的DNA

22、聚合酶聚合酶参与参与DNA的修复的修复 线性线性DNA的末端复制的问题的末端复制的问题3. 端粒端粒 (telomere) 的复制的复制 端粒端粒: 是指真核是指真核生物染色体线性生物染色体线性DNA分子末端结构部分，分子末端结构部分，通常膨大成粒状。通常膨大成粒状。末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含T、G碱基碱基的短序列的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒的功能端粒的功能:n补偿补偿RNA引物切除后造成的空缺，引物切除后造成的空缺，保证染色体复制的完整性。保证染色体复制的完整性。n 稳定染色体的末端结构。稳定染色体的末端结构。n 防止染色体间末端连接。防止染色体

23、间末端连接。端粒酶端粒酶 (telomerase) 含有含有RNA链的逆转录酶，能以链的逆转录酶，能以RNA为为模板合成端粒区的模板合成端粒区的DNA片段。片段。端粒酶的端粒酶的爬行模型爬行模型当端粒长度下降到当端粒长度下降到某一临界值某一临界值时，细胞终止时，细胞终止分裂：衰老、死亡分裂：衰老、死亡“多莉多莉”的衰老的衰老 研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命 研究推测端粒酶与肿瘤的关系研究推测端粒酶与肿瘤的关系真核生物中真核生物中DNA的复制特点的复制特点n真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。

24、呈双向复制，多复制子。n冈崎片段长约冈崎片段长约200bp.n真核生物真核生物DNA复制速度比原核慢。复制速度比原核慢。n真核生物有多种真核生物有多种DNA聚合酶。聚合酶。n真核生物线性染色体两端有真核生物线性染色体两端有端粒端粒结构，防止结构，防止染色体间的末端连接。由染色体间的末端连接。由端粒酶端粒酶负责新合成负责新合成链链5 RNA引物切除后的填补，亦保持引物切除后的填补，亦保持端粒端粒的的一定长度一定长度。四、四、DNA结构的完整性结构的完整性1. DNA复制的忠实性复制的忠实性至少依赖三种机制至少依赖三种机制:n遵守严格的碱基配对规律遵守严格的碱基配对规律n聚合酶在复制延长中对碱基的

25、选择功聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能（按模板要求选择底物）能（按模板要求选择底物）n复制出错时有即时的校读功能复制出错时有即时的校读功能2. DNA的损伤（的损伤（DNA damage） 个别脱氧核糖核苷酸残基甚至片个别脱氧核糖核苷酸残基甚至片段段在在DNA的构成、复制或表型功能上的构成、复制或表型功能上的异常变化，称为的异常变化，称为DNA损伤。也称为损伤。也称为突变突变（Mutation）。）。 引发损伤引发损伤的因素的因素: :n环境中的理化因素，如指紫外线和各种辐射环境中的理化因素，如指紫外线和各种辐射及许多化学诱变剂，常常导致及许多化学诱变剂，常常导致DNA突变。突变。 如紫外线

26、可引起如紫外线可引起DNA链上相邻的两个嘧啶链上相邻的两个嘧啶 碱基发生共价结合，生成嘧啶二聚体。碱基发生共价结合，生成嘧啶二聚体。 如如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的体由于形成了共价键连接的环丁烷结构环丁烷结构，因而，因而会引起复制障碍。会引起复制障碍。 突变的分子改变类型突变的分子改变类型:点突变点突变 (错配错配, mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement)镰刀形红细胞贫血病人镰刀形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基亚基N-val his leu thr

27、pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因由基因重排引起的两种地中海贫血基因型由基因重排引起的两种地中海贫血基因型3. DNA损伤的修复（损伤的修复（DNA repairing） 修复的主要类型：修复的主要类型： 光修复光修复(light repairing) 暗修复暗修复: 切除修复切除修复(excision repairing) 重组修复重组修复(recombination repairing) SOS修复修复 （1）光修复）光修复 光修复过

28、程是通过光修复过程是通过光修复酶光修复酶催化催化而完成，可见光（而完成，可见光（300400nm）激活此）激活此酶活性，可使嘧啶二聚体分解为原来的酶活性，可使嘧啶二聚体分解为原来的非聚合状态，非聚合状态，DNA完全恢复正常。完全恢复正常。光修复酶光修复酶(photolyase) UV分解环丁基分解环丁基的的CC键键（2）切除修复（）切除修复（excision repairing） 又称复制前修复。在一系列酶的作又称复制前修复。在一系列酶的作用下，将用下，将DNA分子中分子中受损伤部分切除受损伤部分切除掉掉，并以，并以完整的那一条链为模板完整的那一条链为模板，合成，合成出切去的部分，然后使出切去

29、的部分，然后使DNA恢复正常结恢复正常结构的过程。构的过程。 E.coli的切除修复方式的切除修复方式UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHPDNA连接酶连接酶ATP（3）重组修复（）重组修复（recombination repairing） 复制后通过分子内重组，从复制后通过分子内重组，从完整的亲完整的亲代链上把相应碱基顺序的片段移至子代链代链上把相应碱基顺序的片段移至子代链缺口处缺口处，使之成为完整的分子。亲链上的，使之成为完整的分子。亲链上的缺口由聚合酶缺口由聚合酶和连接酶填补完整，称为和连接酶填补完整，称为重组修复。重组修复。 重组修复重组修复DNA示意图示意图（4）SO

30、S修复（产生差错的修复）修复（产生差错的修复）nDNA严重受损时复杂的应急反应。既有避免差错严重受损时复杂的应急反应。既有避免差错的修复又有引起差错的修复，后者有高变异率但也的修复又有引起差错的修复，后者有高变异率但也增加了生存机会。增加了生存机会。n反应特异性低，对碱基的识别和反应特异性低，对碱基的识别和选择能力差选择能力差，DNA得到了修复但导致变异。得到了修复但导致变异。DNA保留的错误会较多，保留的错误会较多，引起较广泛、长期的突变。引起较广泛、长期的突变。n致癌因素致癌因素X射线、紫外线和黄曲霉素导致射线、紫外线和黄曲霉素导致SOS修复。修复。4. DNA重组重组n在体外，将一种外源

31、在体外，将一种外源DNA和载体和载体DNA重新组重新组合连接，形成杂交合连接，形成杂交DNA，然后将其转入宿主，然后将其转入宿主细胞，最终使外源细胞，最终使外源DNA在宿主细胞中随着宿在宿主细胞中随着宿主细胞的繁殖而增殖和表达，从而改变生物主细胞的繁殖而增殖和表达，从而改变生物原有遗传性状的过程，称为原有遗传性状的过程，称为重组重组DNA技术技术。n它是按生物科学规律，在体外人为的改造基它是按生物科学规律，在体外人为的改造基因，最终往往使生物的遗传性状获得改变，因，最终往往使生物的遗传性状获得改变，故又称为故又称为“遗传工程遗传工程” ，亦即，亦即“基因工程基因工程” 。n限制性核酸内切酶限制

32、性核酸内切酶n DNA聚合酶聚合酶nTaq DNA聚合酶聚合酶n 逆转录酶逆转录酶n T4 DNA连接酶连接酶n 碱性磷酸酶碱性磷酸酶n 末端转移酶末端转移酶 工具酶工具酶重组重组DNA技术的基本操作过程技术的基本操作过程:n目的基因的获取目的基因的获取n选择目的基因载体选择目的基因载体n将外源基因与载体的连接将外源基因与载体的连接n将重组体导入受体细胞将重组体导入受体细胞n阳性克隆（重组体）的筛选和鉴定阳性克隆（重组体）的筛选和鉴定nDNA重组体的扩增、表达等研究重组体的扩增、表达等研究n化学合成基因化学合成基因n从基因组从基因组DNA中切割、分离目的中切割、分离目的基因片段基因片段n构建构

33、建cDNA文库，调取目的基因文库，调取目的基因nPCR体外特异扩增体外特异扩增 （1）目的基因的获得）目的基因的获得多聚酶链式反应多聚酶链式反应 (PCR) 20世纪世纪80年代末发展起来年代末发展起来的一种的一种 DNA 特定片段体外特定片段体外快速合成扩增的方法。称多快速合成扩增的方法。称多聚酶链式反应（聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）微量离心管，微量离心管，适量的缓冲液，模板适量的缓冲液，模板DNA，2个个DNA引物，引物，4种种dNTP，Taq DNA聚合酶和聚合酶和Mg2+。（2）载体的选择和制备）载体的选择和制备 原核生物常用的载体：原核生

34、物常用的载体：质粒和噬菌体；质粒和噬菌体； 真核生物常用的载体：真核生物常用的载体：动物病毒、酵母；动物病毒、酵母； 穿梭载体：穿梭载体：通常是指那些既能在真核细胞通常是指那些既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。 能将外源能将外源DNA带入宿主细胞，进行带入宿主细胞，进行复制扩增或最终使外源基因得以表达的复制扩增或最终使外源基因得以表达的自主自主 DNA，称为，称为载体（载体（vector）。目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接 （3）(4) 重组重组DNA导入宿主细胞导入宿主细胞大肠杆菌、酵母、真菌大肠杆菌、酵母、真菌及各种真核细胞、受精及各

35、种真核细胞、受精卵细胞都可用于重组。卵细胞都可用于重组。 转化转化 转染转染 （5）重组体的筛选和鉴定）重组体的筛选和鉴定n遗传学方法遗传学方法n核酸杂交法核酸杂交法nPCR方法方法 n酶切鉴定酶切鉴定五、特殊复制机制五、特殊复制机制n 线粒体线粒体DNA复制复制n 单链单链DNA复制复制n 病毒病毒RNA复制复制v 逆转录也称反转录，是以逆转录也称反转录，是以RNA为模板合成为模板合成DNA的特殊复的特殊复制方式（在某些生物如鸡的肉瘤病毒等）。制方式（在某些生物如鸡的肉瘤病毒等）。v 这个过程由逆转录酶催化，它具有以单链这个过程由逆转录酶催化，它具有以单链RNA为模板合为模板合成与其互补的成

36、与其互补的DNA（cDNA），再水解杂交链上的），再水解杂交链上的RNA以及以以及以cDNA为模板合成双链为模板合成双链DNA三种酶活性。三种酶活性。v 逆转录现象和逆转录现象和逆转录酶逆转录酶（reverse transcriptase）（）（H. Temin，1976）是分子生物学研究中的重大发现，是对）是分子生物学研究中的重大发现，是对经典中心法则重要补充。经典中心法则重要补充。单链单链DNA复制复制 逆转录作用（逆转录作用（reverse transcription）逆转录作用图逆转录作用图R RN NA A模模板板A AA AA AA A杂杂化化双双链链T TT TT TT T单单链

37、链D DN NA A反反转转录录酶酶R RN Na as se eH H碱碱水水解解整整合合T TD DN NA A聚聚合合酶酶S SI I核核酸酸酶酶反反转转录录酶酶A AA AA AA AT TT TT T思考题思考题1. DNA聚合酶的功能。聚合酶的功能。2. 半保留复制、半不连续复制、冈崎片段。半保留复制、半不连续复制、冈崎片段。3. 参与参与DNA复制的主要酶及蛋白的作用。复制的主要酶及蛋白的作用。4. 原核生物复制的过程。原核生物复制的过程。5. 在在DNA复制过程中，遗传信息的忠实性如何复制过程中，遗传信息的忠实性如何得到保证？得到保证？6. DNA的损伤和修复系统。的损伤和修复系统。7. DNA重组的概念及一般过程重组的概念及一般过程