第10章DNA的生物合成(11采用)课件.ppt

1、目录目录第第10章章DNA的生物合成的生物合成DNA Biosynthesis ( Replication )目录目录复制复制(replication) 是指遗传物质的传代，是指遗传物质的传代，以母链以母链DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNADNA的生物合成有三种方式：的生物合成有三种方式：复制复制逆转录逆转录损伤损伤DNA的修复合成的修复合成目录目录n本章主要内容：本章主要内容： 复制的基本规律复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化 复制的过程复制的过程 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式 DNA损伤（

2、突变）与修复损伤（突变）与修复复制的基本规律复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication第第 一一 节节目录目录复制的方式复制的方式 半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)双向复制双向复制(bidirectional replication)半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) n复制的基本规律复制的基本规律 目录目录一、半保留复制是一、半保留复制是DNA复制的基本特征复制的基本特征 DNA生物合成时，母链生物合成时，母链DNA解开为两解开为两股单链，各自作为模板股单链

3、，各自作为模板(template)按碱基配按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的细胞的DNA都和亲代都和亲代DNA碱基序列一致。碱基序列一致。这种复制方式称为这种复制方式称为半保留复制半保留复制。n半保留复制半保留复制的概念的概念: :AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCA

4、CTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNAn 子链继承母链遗传信息的子链继承母链遗传信息的几种可能方式几种可能方式全全保保留留 半半保保留留 混混合合式式 亲代亲代DNA子代子代DNA细菌可以利用细菌可以利用NH4Cl作氮源合成作氮源合成DNA轻链14N-DNA重链15N-DNA轻、重链DNA混合半保留复制第一代DNA半保留复制第二代DNA半保留复制第三代DNA细菌在含细菌在含NH4Cl 的普通培养液的普通培养液中培养后提取中培养后提取DNA把细菌放在含把细菌放在含

5、15NH4Cl 的培养液中培养的培养液中培养若干代后提取含若干代后提取含15N的的“重重”DNA把含把含15N-DNA的细菌放回含的细菌放回含NH4Cl 的普通的普通培养液中培养培养液中培养20分钟后提取子一代分钟后提取子一代DNA把含把含15N-DNA的细菌在含的细菌在含NH4Cl 的普通培的普通培养液中培养养液中培养40分钟后提取子二代分钟后提取子二代DNA将轻链将轻链DNA和重链和重链DNA混合混合把含把含15N-DNA的细菌在含的细菌在含NH4Cl 的普通的普通培养液中培养培养液中培养60分钟后提取子三代分钟后提取子三代DNA普通培养液培普通培养液培养细菌的轻链养细菌的轻链DNA在密度

6、梯在密度梯度离心时区带度离心时区带在离心管上方在离心管上方子二代子二代DNA密度梯密度梯度离心分析时有介度离心分析时有介于重带与轻带之间于重带与轻带之间的中间带轻带两种的中间带轻带两种将轻链和重链将轻链和重链DNA混合后密混合后密度梯度离心时度梯度离心时在离心管中有在离心管中有与轻、重链对与轻、重链对应的两条区带应的两条区带子三代子三代DNA密度梯度离心分析时仍有中密度梯度离心分析时仍有中间带和轻带两种，间带和轻带两种，以后各代以后各代DNA分子密度梯度离心结果相分子密度梯度离心结果相同，但轻带变浓而中间带逐渐被稀释。同，但轻带变浓而中间带逐渐被稀释。含含15NH4Cl培培养液培养的养液培养的

7、重链重链DNA在在密度梯度离密度梯度离心时区带在心时区带在离心管下方离心管下方子一代子一代DNA密度梯密度梯度离心分析时致密度离心分析时致密带介于重带与轻带带介于重带与轻带之间，没有单独的之间，没有单独的重带和轻带重带和轻带 子一代子一代DNA双链中双链中 一股是一股是15N单链，从亲代接受和保留下来的；单链，从亲代接受和保留下来的； 另一股是另一股是14N单链，完全是新合成的。单链，完全是新合成的。 Messelson和和Stahl的实验支持半保留复制。的实验支持半保留复制。半保留复制的意义半保留复制的意义按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA的的碱碱基序列一致

8、基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的息，体现了遗传的保守性保守性。遗传的保守性是物种遗传的保守性是物种稳定性稳定性的分子基础，但的分子基础，但不是绝对的不是绝对的。在强调遗传恒定性的同时不能忽视其在强调遗传恒定性的同时不能忽视其变异性变异性。目录目录 原核生物复制时，原核生物复制时，DNA从从起始点起始点(origin)向两向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为叉，称为双向复制双向复制。 二、二、DNA复制从起始点向两个方向复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制延伸形成双向复制复制中的放射自显影

9、图像复制中的放射自显影图像（眼睛状图形）（眼睛状图形）（大肠杆菌（大肠杆菌DNADNA经放射性标记后电镜下观察结果）经放射性标记后电镜下观察结果）terA环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点（ origin）B复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉（replication fork）C复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)复制叉复制叉指的是指的是DNA双链分成两双链分成两股各自作为模板，子链沿模板延长形股各自作为模板，子链沿模板延长形成的成的Y字形结构字形结构复制叉复制叉指的是指的是DNA双链分成两双链分成两股各自作为模板，子链沿模板延长形股各自作为模板，子链

10、沿模板延长形成的成的Y字形结构字形结构E.coliorigin目录目录 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个的距离定为一个复制子复制子(replicon) 。复制子是。复制子是独立完成复制的功能单位。独立完成复制的功能单位。 53oriorioriori5353oriorioriori535533553复制复制3目录目录目录目录5 3 解链方向解链方向3 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)3 5 3 3 5

11、5 领头链连续复制，领头链连续复制，随从链不连续复制，随从链不连续复制，这就是复制的半不连续性这就是复制的半不连续性DNA的两股单链走向相反，一股为的两股单链走向相反，一股为5至至3，另，另一股（互补链）为一股（互补链）为3至至5 。复制叉上两股母链。复制叉上两股母链也是走向相反。也是走向相反。子链沿母链模板复制，只能从子链沿母链模板复制，只能从5向向3延伸。延伸。同一个复制叉上只能有一个解链方向。同一个复制叉上只能有一个解链方向。 顺着解链方向生成的子链，复制是连顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为续进行的，这股链称为领头链领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相另一股链因

12、为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为不连续复制的链称为随从链随从链。冈崎片段冈崎片段复制中的不连续片段称为复制中的不连续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。三、三、DNA一股子链复制的方向与解链方向一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制相反导致半不连续复制目录目录 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为这股链称为领头链领头链(leading strand) 。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不另一股链因为复制的方向与解链方

13、向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为链称为随从链随从链(lagging strand) 。复制中的不连。复制中的不连续片段称为续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。制的半不连续性。 目录目录DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化第第 二二 节节The Enzymology and Topology of DNA Replication目录目录n参与参与DNA复制的物质复制的物质: 底物底物(subst

14、rate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，聚合酶，简写为简写为 DNA-pol； 模板模板(template): 解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链； 引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次可以依次聚合；聚合； 其他的酶和蛋白质因子。其他的酶和蛋白质因子。目录目录nDNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。（一）模板（一）模板一、模板、底物、引物一、模板、底物、引物目录目录

15、目录目录n 核苷酸和核苷酸之间生成核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键磷酸二酯键是复制是复制的基本化学反应的基本化学反应(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPin聚合反应的特点聚合反应的特点: :DNA 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板； 新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 3 方向进行。方向进行。目录目录（三）（三）RNA引物引物目录目录3 HO53 5 3 5 引物酶催化合成短链引物酶催化合成短链RNARNA引物分子引物分子 引物引物引物引物酶酶u全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)u简称：简

16、称：DNA-polu活性（作用）有两方面：活性（作用）有两方面：u53 的的聚合聚合活性，活性， 延延53 方向方向延长脱氧核苷酸链。延长脱氧核苷酸链。u核酸核酸外切外切酶活性（两种情况）酶活性（两种情况） u3 5 外切酶活性，外切酶活性，能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。u5 3 外切酶活性，外切酶活性，能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。二、二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合聚合酶催化核苷酸之间聚合核酸外切酶活性核酸外切酶活性3 5 外切酶活性外切酶活性能辨认错配的碱基对，能辨认错配的碱基对，并将其水解。并将其水解。5 3 外切酶外切酶活性能切除突变

17、活性能切除突变的的 DNA片段。片段。 目录目录（一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型聚合酶分为三型 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3

18、 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I三种酶共同点三种酶共同点： 5 3 聚合酶活性聚合酶活性 3 5 外切酶活性外切酶活性目录目录n功能：功能： DNA-pol （109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。中出现的空隙进行填补。目录目录323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基

19、酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 目录目录 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态

20、修复。目录目录n功能：功能： DNA-pol (250kD)是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。(Pol 活性高于活性高于Pol ：每分钟达每分钟达105次聚合反应次聚合反应 。)10个亚基组成的不不对称二聚体对称二聚体滑动夹子滑动夹子（两个亚基）（2围绕双螺旋形成一个 环，模板链从该环通过）稳夹模板并沿模板滑动 复合物复合物 夹子装载核心酶核心酶（、 亚基）亚基有亚基有5 3方向聚合作用（105/分）。亚基亚基具有35核酸外切酶 活性，起校读作用目录目录（ 亚基）亚基）（核心酶）（核心酶）目录目录（二）常见的真核细胞（二）常见的真核细胞DNA聚合酶

21、有五种聚合酶有五种DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在线粒体在线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶填填补补引引物物空空隙隙，切切除除修修复复，重重组组延延长长子子链链的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性线线粒粒体体DNA复复制制低低保保真真度度的的复

22、复制制起起始始引引发发，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD）DNA-pol填填补补引引物物空空隙隙，切切除除修修复复，重重组组延延长长子子链链的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性线线粒粒体体DNA复复制制低低保保真真度度的的复复制制起起始始引引发发，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD）DNA-pol注：五种酶共同点注：五种酶共同

23、点 5 3 外切酶活性外切酶活性目录目录三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据功能是复制保真性的酶学依据 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。准确传代的基本原理。 此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。目录目录（一）（一）核酸外切酶活性核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配在复制中辨认切除错配碱基并加以校正碱基并加以校正目录目录A：DNA-pol的的外切酶活性外切酶活性切除错配碱基；并用其切除错配碱基；并用其聚合活聚合活性性掺入正确配对的底物（错

24、配修复、掺入正确配对的底物（错配修复、即时校读即时校读）。）。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。不表现活性。DNA pol 的校读功能的校读功能目录目录（二）复制的保真性依赖（二）复制的保真性依赖DNA聚合酶聚合酶正确的正确的碱基选择碱基选择 DNA聚合酶聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。 目录目录遵

25、守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。nDNA复制的保真性至少要依赖三种机制：复制的保真性至少要依赖三种机制：目录目录四、复制中的分子解链伴有四、复制中的分子解链伴有DNA 分子拓扑学变化分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。目录目录（一）多种酶参与（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶

26、 (gyrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链DNA结合蛋白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质目录目录E. Coli 基因图基因图目录目录1、解螺旋酶、解螺旋酶目录目录目录目录2、单链、单链DNA结合蛋白结合蛋白目录目录目录目录3. 引物酶引物酶目录目录108局部解链后局部解链后n复制

27、过程复制过程正正超螺旋的形成：超螺旋的形成：（二）（二）DNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、超螺旋状态、理顺理顺DNA链链目录目录 既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键。、又能连接磷酸二酯键。 拓扑异构酶拓扑异构酶（）拓扑异构酶拓扑异构酶（旋转酶）n拓扑异构酶分类：拓扑异构酶分类：n拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶作用特点：目录目录拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股

28、链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。n作用机制：作用机制：目录目录连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。n DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式：作用方式：五、五、DNA连接酶连接连接酶连接DNA双链中的双链中的单链缺口单链缺口目录目录POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连

29、接酶ATPADP5353nDNA连接酶的作用：连接酶的作用：目录目录目录目录 DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。作用。 在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。n功能：功能：目录目录DNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA Replication第第 三三 节节目录目录（一）复制起始：（一）复制起始：DNA解链形成引发体解链形成引发体需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2.

30、 形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3 -OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNA生物合成生物合成目录目录E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1. DN

31、A解链解链目录目录目录目录 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 2. 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。目录目录目录目录3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶目录目录（二）复制的延长过程：领头链连续复制，（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制随从链不连续复制复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下

32、，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目录目录n领头链的合成：领头链的合成：领头链的子链沿着领头链的子链沿着5 5 33 方向可以连续地延长。方向可以连续地延长。n随从链的合成随从链的合成n同一复制叉上领头链和随从链由相同的同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长催化延长 DNADNA聚合酶聚合酶催化领头链和随从链同时合成催化领头链和随从链同时

33、合成复复制制过过程程简简图图目录目录目录目录 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段，双向复制的复制片段在复制的终止点在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）复制的终止过程：切除引物、填补（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口空缺、连接切口目录目录5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶n 随从链上不连续性片段的连接：随从链上不连续性片段的连接：目录目录目录目录目录目录哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合

34、成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两个关期这两个关键点。键点。G1S及及G2M的调节，与蛋白激酶活的调节，与蛋白激酶活性有关。性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。而实施调控作用。 目录目录真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。激活而不是同步起动。 复制起始点比大肠杆菌起始点复制起始点比大肠杆

35、菌起始点OriC短（短（11bp）复制的起始需要复制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）和（引物酶活性）和pol （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子制因子(replication factor, RF)。 （一）真核生物复制的起始与原核基本相似（一）真核生物复制的起始与原核基本相似目录目录增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作在复制起始和延长中起关键作用。用。PCNA为同源三聚体，具有与为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚聚合酶合酶的的亚基

36、相同的功能和相似的构象，即形亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动成闭合环形的可滑动DNA夹子，在夹子，在RFC的作用下的作用下PCNA结合于引物模板链；并且结合于引物模板链；并且PCNA使使pol获得持续合成能力。获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增水平也是检验细胞增殖的重要指标。殖的重要指标。目录目录 DNA-pol 和和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通过通过PCNA的协同作用，逐步取代的协同作用，逐步取代pol ，在，在RNA引物引物的的3 -OH基础上连续合成领头链。随

37、从链引物也基础上连续合成领头链。随从链引物也由由pol 催化合成。然后由催化合成。然后由PCNA协同，协同，pol 置换置换pol ，继续合成，继续合成DNA子链。子链。 （二）真核生物复制的延长发生（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶聚合酶/转换转换目录目录3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体n真核生物复制叉的延长：真核生物复制叉的延长： 真核生物的真核生物的DNA复制与核小体装配同步进行复制与核小体装配同步进行目录目录染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎

38、片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端染色体两端DNA子链上子链上最后复制的最后复制的RNA引物引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题目录目录端粒端粒(telomere) 指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。n端粒的功能：端粒的功能：维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性维持维持DNA复制的完整性复制的完整性n端粒的结构特点：端粒的结构特点：由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C碱基碱基的短序列

39、。的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG目录目录端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) n组成：组成：5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCA AAACAAACCGAC353GTTTTGGGTTTTGG3OH端粒端粒DNA末端末端TGGTTTG3OH1 1、端粒酶靠、端粒酶靠hTR

40、hTR（AnCnAnCn）x x与母链与母链DNADNA端粒结合端粒结合内在模板RNA2 2、以端粒酶、以端粒酶RNARNA为模版，逆转录，延长为模版，逆转录，延长DNADNA母链母链3 3、端粒酶移位、空出、端粒酶移位、空出RNARNA模板，再次延长母链，同时模板，再次延长母链，同时DNADNA母链反摺利于下游复制延伸。母链反摺利于下游复制延伸。TGGTTTGG5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCA AAACAAACCGAC353TTTT3OHTGGTTTGGGGGGGGGTTTTGGTTTT4 4、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以DNA-Po

41、l DNA-Pol 。此时。此时母链母链3 3-OH-OH反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCAAAACAAACCGAC33OH53TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGn3HO53TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGnnCCCCAAAACCCCAAAAAAAADNA-Pol目录目录逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways第四节第四节目录目录 双链双

42、链DNA是大多数生物的遗传物质。某些是大多数生物的遗传物质。某些病毒的遗传物质是病毒的遗传物质是RNA。少数低等生物如。少数低等生物如M13噬菌体，它的感染型只含单链噬菌体，它的感染型只含单链DNA。原。原核生物的质粒，真核生物的线粒体核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的都是染色体外存在的DNA。这些非染色体。这些非染色体基因组，采用特殊的方式进行复制。基因组，采用特殊的方式进行复制。目录目录逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录逆转录(reverse transcription) 逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒的基因组是一、逆转录病毒的基因

43、组是RNA，其复制方式是逆转录其复制方式是逆转录目录目录n逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象:RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA目录目录 RNA病毒在细胞内复制成双链病毒在细胞内复制成双链DNA的的前病毒前病毒(provirus)。前病毒保留了。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过病毒基因组通过基因重组基因重组(recombination)，参加，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复

44、制和表达到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为。这种重组方式称为整合整合(integration)。前病毒。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。 目录目录分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。 n试管内合成试管内合成cDNA:cDNA complementary DNA 逆转录酶逆转录酶

45、A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目录目录二、逆转录的发现发展了中心法则二、逆转录的发现发展了中心法则逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同同样兼有遗传信息传代与表达功能。样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注世纪初已注意到的病毒致癌理论。意到的病毒致癌理论。 DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复DNA Damage (Mu

46、tation) & Repair第五节第五节目录目录 DNA突变具体指个别突变具体指个别dNMP残基以至片段残基以至片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为也称为DNA损伤损伤(DNA damage)。 从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基分子上碱基的改变。的改变。 目录目录一、突变在生物界普遍存在一、突变在生物界普遍存在（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础 从长远的生物史看，进化过程是突变的不断从长远的生物史看，进化过程是突变的不断发生所造成的。发生所造成的。 大量的突变都是属于这种类型，只是

47、目前还大量的突变都是属于这种类型，只是目前还未能认识其发生的真正原因，因而名为自发未能认识其发生的真正原因，因而名为自发突变或自然突变突变或自然突变(spontaneous mutation)。目录目录（二）只有基因型改变的突变形成（二）只有基因型改变的突变形成DNA的多态性的多态性 这种突变没有可察觉的表型改变，例如在简这种突变没有可察觉的表型改变，例如在简并密码子上第三位碱基的改变，蛋白质非功并密码子上第三位碱基的改变，蛋白质非功能区段上编码序列的改变等。这些现象也相能区段上编码序列的改变等。这些现象也相当普遍。当普遍。 多态性多态性(polymorphism)一词用来描述个体之一词用来描

48、述个体之间的基因型差别现象。间的基因型差别现象。 目录目录（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡（四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础目录目录二、多种化学或物理因素可诱发突变二、多种化学或物理因素可诱发突变大量的突变属于自发突变，发生频率只不过在大量的突变属于自发突变，发生频率只不过在10-9左右。但由于生物基因组庞大，细胞繁殖速度快，左右。但由于生物基因组庞大，细胞繁殖速度快，因此它的作用是不可低估的。因此它的作用是不可低估的。实验室用来诱发突变，也是生活环境中导致突变实验室用来诱发突变，也是生活环境中导致突变的因素，主要有物理

49、和化学因素。的因素，主要有物理和化学因素。 目录目录n物理因素：物理因素：紫外线紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射、各种辐射 UVn化学因素：化学因素：常见的化学诱变剂常见的化学诱变剂化合物类别化合物类别作作 用用 点点分子改变分子改变碱基类似物碱基类似物如：如：5-BUA 5-BU G- A - T - G - C -羟胺类（羟胺类（NH2OH）T C- T - A - C - G -亚硝酸盐（亚硝酸盐（NO2）C U- G - C - A - T -烷化剂烷化剂如：氮芥类，如：氮芥类，NitrominsG mGG mGDNA缺失缺失G目录目录三、引起突变的分子改变类型有多

50、种三、引起突变的分子改变类型有多种错配错配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement) 框移框移(frame-shift) 目录目录 DNA分子上的碱基错配称点突变分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。 自发突变和不少化学诱变都能引起自发突变和不少化学诱变都能引起DNA上某一碱基上某一碱基的置换。的置换。 点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸改变。点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸改变。 （一）错配可导致编码氨基酸的改变（一）错配可导致编码氨基酸的改变目录目录镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫