DNA的生物合成1课件.ppt

1、第三章第三章DNADNA的生物合成的生物合成Biosynthesis of DNABiosynthesis of DNA(Replication of DNA)(Replication of DNA)第一节第一节 DNADNA复制的一般特征复制的一般特征 一、一、DNADNA的生物学功能的生物学功能 1 1、储存遗传信息、储存遗传信息 2 2、复制遗传信息、复制遗传信息 3 3、表达遗传信息、表达遗传信息 4 4、遗传变异、遗传变异Watson(Nature) :Watson(Nature) :我们假设的特异的（碱基）配对方式提示了遗传物我们假设的特异的（碱基）配对方式提示了遗传物质可能的复制

2、机制：每一条链均可作为合成一条新链的模板，就使质可能的复制机制：每一条链均可作为合成一条新链的模板，就使子代双螺旋与母本完全一致子代双螺旋与母本完全一致。他们在另一篇论文中：由此产生了在他们在另一篇论文中：由此产生了在当时难于解决的解开双链结构的困难。当时难于解决的解开双链结构的困难。许多科学家难于接受许多科学家难于接受WatsonWatson提出的机制。提出的机制。二、二、 DNADNA复制方式复制方式 全保留全保留半保留半保留分散式分散式DNA如何进行复制？如何进行复制？可能的三种方式可能的三种方式N15N14N15N15N15N14N14N14N14一一条条带带一条带一条带两条带两条带两

3、条带两条带重带重带中带中带中带中带 和轻带和轻带轻带轻带 和中带和中带轻带轻带一条带一条带根据实验结果：第一代的根据实验结果：第一代的DNADNA仅有一条带否定了仅有一条带否定了全保留复制的可能，第二代出现两条带，一条完全保留复制的可能，第二代出现两条带，一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能，证明全轻带一条中带否定了分散式复制的可能，证明DNADNA只能是半保留方式进行复制只能是半保留方式进行复制 1 1 、 DNA DNA的半保留复制的半保留复制 SemiconservativeSemiconservative Replication Replication DNA DNA双链解开，以

4、单链做模板，碱基互双链解开，以单链做模板，碱基互补原则，各自合成一条链。在新合成的补原则，各自合成一条链。在新合成的DNADNA双链分子中，双链分子中，一条是原来的老链，一一条是原来的老链，一条是新链条是新链。如果是半保留复制，必须解决解开双螺旋的问题。如果是半保留复制，必须解决解开双螺旋的问题。250Mb的的1 1号染色体，需要旋转号染色体，需要旋转250250万次。万次。 DNADNA拓扑异构酶解决了拓扑异构酶解决了 解开解开DNADNA双螺旋的问题双螺旋的问题DNADNA复制速率复制速率 大肠杆菌完成复制需大肠杆菌完成复制需4040分钟。分钟。 大肠杆菌基因组有大肠杆菌基因组有40040

5、0万万bpbp，复制速率：，复制速率：1700 bp1700 bp/ /秒。秒。 真核生物复制速率：真核生物复制速率：60 bp60 bp/ /秒。但完成整秒。但完成整个基因组复制所需的时间比大肠杆菌短。个基因组复制所需的时间比大肠杆菌短。 原因是大肠杆菌基因组仅有一个复制起原因是大肠杆菌基因组仅有一个复制起始位点，而真核基因组有多个起始位点。始位点，而真核基因组有多个起始位点。2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性复制时复制时DNA链延伸可能有三种方式：链延伸可能有三种方式：12 3 日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生1001000bp的短片段，

6、然后又消失的短片段，然后又消失没有从没有从3 5 延长延长DNA链链的聚合酶的聚合酶2 DNA2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性 一条链连续合成一条链连续合成，称主导链称主导链，Leading Leading Strand Strand 另一条链分段合成另一条链分段合成，称，称随从链随从链（随后链）（随后链）Lagging Strand Lagging Strand 。 原因：原因：DNADNA双螺旋分子两条链方向相反，双螺旋分子两条链方向相反，新链合成的方向只能新链合成的方向只能5 53 3一个方向合成。一个方向合成。3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行，形成两个复

7、制叉在两个方向同时进行，形成两个复制叉 Replication Fork .复制子复制子 RepliconReplicon RepliconReplicon 基因组中能独立进行复制的结构单基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子位称复制子, , 或者说单个复制起始点控制的或者说单个复制起始点控制的DNADNA。 复制的起始位点复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点。控制并起始复制的特定位点。 终止位点终止位点 终止复制的位点终止复制的位点 复制子包含起始位点和终止位点，从起始位点复制子包含起始位点和终止位点，从起始位点至终止位点的全部至终止位点的全部DNADNA。第二节第二节 DNA DNA

8、 复制的基本过程复制的基本过程 一一 复制的起始复制的起始 （一） 起始部位起始部位的序列特征的序列特征 复制在特定部位起始。复制在特定部位起始。 原核生物仅有一个起始部位。原核生物仅有一个起始部位。 真核生物有多个起始部位。真核生物有多个起始部位。 1 1、 M M1313噬菌体的起始部位顺序特征噬菌体的起始部位顺序特征 59bp 59bp的发夹结构。的发夹结构。 2 2、大肠杆菌的起始部位顺序特征、大肠杆菌的起始部位顺序特征 2 2个区个区域：起始蛋白识别区：域：起始蛋白识别区：4 4个个9bp9bp重复顺序重复顺序和邻近的和邻近的ATAT富含区富含区3 3个个13bp13bp重复顺序重复

9、顺序。 大肠杆菌基因组复制起始部位大肠杆菌基因组复制起始部位3 3、酵母、酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征酵母酵母4 4、 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征5211 5220 5230 5240 1 10 20 30CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTAGTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT 反转重复序列反转重复序列 大大T抗原结合部位抗原结合部位 II A/T 富含区富含区 图图

10、3-7 SV40 复制起始部位结构复制起始部位结构5 5、起始部位的顺序特征、起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物） 多个复制起始点，有人发现任何大于多个复制起始点，有人发现任何大于15kb15kb的的DNADNA就能自主复制就能自主复制。 起始不是随机的，但未发现起始位点的特征序起始不是随机的，但未发现起始位点的特征序列。列。（二）（二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与 1 噬菌体噬菌体（ X174X174） priApriA 识别起始位点，识别起始位点，ATPATP酶活性酶活性 priB priB 起始引发起始引发 priC priC 起始引发起始引发 Dna

11、T DnaT 起始引发起始引发 DnaB DnaB 起始引发起始引发 DnaC DnaC 起始引发起始引发, ,与与DnaBDnaB一起作用一起作用 DnaG DnaG RNA RNA引物合成引物合成 2 2 大肠杆菌大肠杆菌 DnaADnaA 结合于结合于oriCoriC区区，有，有ATPATP酶活性，使酶活性，使ATAT富含富含 区区解链，促进解链，促进DnaBDnaB结合形成起始复合物结合形成起始复合物。 DnaBDnaB DNA DNA螺旋酶，有解旋和解链作用。螺旋酶，有解旋和解链作用。 DnaCDnaC 运输运输DnaBDnaB，形成起始复合物，形成起始复合物。 DnaGDnaG D

12、NA DNA复制引发酶，合成引物。复制引发酶，合成引物。 HuHu 促进复制复合物的形成促进复制复合物的形成。 回旋酶回旋酶 松弛正超螺旋，促进单链松弛正超螺旋，促进单链DNADNA产生。产生。 单链结合蛋白单链结合蛋白 促进促进DNADNA解链，稳定单链解链，稳定单链DNADNA。3 3、真核细胞（真核细胞（SV40） 真核细胞（真核细胞（SV40）的）的DNA复制至少需要复制至少需要6个蛋白因子参与。个蛋白因子参与。 T抗原抗原：N端为端为DNA结合区，识别起始位点，结合区，识别起始位点， C端具有螺旋端具有螺旋 酶活性，在酶活性，在RFA的协助下解开双链。的协助下解开双链。 RFA：人单

13、链结合蛋白人单链结合蛋白 拓补异构酶拓补异构酶I或或II：解开超螺旋。：解开超螺旋。 复制因子复制因子C（replication facter C, RFC）：形成起始复合物。）：形成起始复合物。 DNA聚合酶聚合酶-引物酶复合物引物酶复合物：合成引物，起始：合成引物，起始DNADNA合成。合成。4、真核细胞（真核细胞（Yeast） （1） ORC（ Origin Recognition Complex） 6 6个亚基组成个亚基组成 在真核生物中相当保守在真核生物中相当保守 特异识别特异识别ARS ARS （Autonomously replicating sequenceAutonomous

14、ly replicating sequence） ORC1pORC1p，ORC2pORC2p，ORC4p ORC4p 与与A A 元件结合，元件结合， ORC5pORC5p与与B B元件结合元件结合 结合过程需要结合过程需要ATPATP （2） Cdc6/Cdc18 （3 3）微染色体支持蛋白（）微染色体支持蛋白（Minichromosome Minichromosome maintenance proteinsmaintenance proteins，MCMpMCMp） （4） Cdc45 （三）（三） 复制的起始引发（复制的起始引发（PrimingPriming）SSB的作用的作用无无SS

15、B结合非特异引发结合非特异引发有有SSB结合特异引发结合特异引发1、M13噬菌体噬菌体 pppGGGCGAAAAACCGUCUAUCAGGGCGAUGG单链结合蛋白单链结合蛋白SSB与与M13噬菌体单链噬菌体单链DNA结结 合，在发夹结构前合，在发夹结构前6 bp处，处，RNA聚合酶合成聚合酶合成 2030个碱基的个碱基的RNA. 破坏发夹结构；破坏发夹结构；SSB结合；结合；DNA聚合酶聚合酶III在在3OH延长延长DNA链。链。 DNA聚合酶聚合酶I水解水解RNA，并，并补补平缺口，连接酶连接平缺口，连接酶连接。SSB与与DNA结合结合priA,priB,priC识别起始点识别起始点在在D

16、naT帮助下帮助下DnaB,DnaC复合物结复合物结合形成前引发体合形成前引发体引发体引发体引发体可沿着引发体可沿着DNA链移动，在链移动，在合适的位点起始合适的位点起始引物引物RNA的合成的合成引发体的装配只能在起始点，引发体的装配只能在起始点，引物合成可在多处。引物合成可在多处。引发体移动的方向与引发体移动的方向与DNA链延链延长的方向相反。长的方向相反。类似冈崎片段的合成类似冈崎片段的合成2、 X174DNA 复制叉前进方向复制叉前进方向 3ATCGGAATCGGAACCTGCGTTAAGCAAAC-53ATCGGAATCGGAACCTGCGTTAAGCAAAC-5 链延长方向链延长方向

17、 TTCGTTTG-3TTCGTTTG-3 GACGCAA GACGCAA TAGCCTTG TAGCCTTG 5 TAGCCT 55 TAGCCT 5 3 3 3、大肠杆菌大肠杆菌DnaA与起始位点与起始位点OriC结合形成起始复合物结合形成起始复合物DnaA与与A-T富含区作用，解富含区作用，解 链，形成开放复合物链，形成开放复合物SSB与单链与单链DNA结合结合DnaA指导指导DnaB-DnaC复合物结合到解链复合物结合到解链 区，形成前引发复区，形成前引发复合物合物。DnaB 引导引导DnaG引物合成酶的结合形成引发复合物，合成引物合成酶的结合形成引发复合物，合成RNA引引物物Hu因子

18、促进引发过程因子促进引发过程4 SV404 SV40T抗原识别起始点和解链抗原识别起始点和解链RFA结合到单链结合到单链DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体拓扑异构酶参与下形成前引发体DNApol -引物酶结合形成引发体引物酶结合形成引发体首先，在复制起始位点形成前复制复合物首先，在复制起始位点形成前复制复合物（pre-replicative complex,Pre-RC） 。） 。其次，其次，Pre-RC 被激活，从而启动被激活，从而启动DNA 的复制，并的复制，并防止一个细胞周期中复制的再次发生。防止一个细胞周期中复制的再次发生。最后，最后，Pre-RC 的激活主要依赖于两种促的激活主要依赖

19、于两种促 S 期激酶期激酶（S phase promoting kinases）ORC：Origin Recognition Complex5、真核生物复制的起始、真核生物复制的起始二二 DNA DNA链的延长链的延长 （一）一） 原核生物原核生物DNADNA链的延伸链的延伸 延伸延伸反应：反应： 在在RNARNA引物的引物的OHOH端由端由DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII，按碱基互补，按碱基互补规则延伸规则延伸。 主导链的延长主导链的延长： 3 35 5方向这条链做模板链的方向这条链做模板链的新链合成可以随着复制叉向前移动，连续合成新链合成可以随着复制叉向前移动，连续合成（5 5 3 3

20、）。 随从链的延长随从链的延长 5 5 3 3 方向这条链做模板链的新链合成则不能方向这条链做模板链的新链合成则不能随着复制叉向前移动随着复制叉向前移动进行连续合成，只能分段进行连续合成，只能分段合成一小段，这一小段新合成的合成一小段，这一小段新合成的DNADNA链称冈奇链称冈奇片段。每一段新合成的一小段中有片段。每一段新合成的一小段中有RNARNA，由，由RNARNA酶水解，酶水解，DNADNA聚合酶聚合酶I I补平，最后由连接补平，最后由连接酶连接。酶连接。DNADNA链延长的要点链延长的要点 1) DNA1) DNA聚合酶不能从头合成新链，只能在聚合酶不能从头合成新链，只能在3-OH3-

21、OH羟基端延长。复制起始时的羟基端延长。复制起始时的3-OH3-OH羟基端是羟基端是RNARNA。 2) 2) 按照碱基互补原则合成新链按照碱基互补原则合成新链。 3) 3) 两条链同时复制，新链的延伸方向是两条链同时复制，新链的延伸方向是5 53 3，一条链连续合成，称主导链，另一条链不连续一条链连续合成，称主导链，另一条链不连续合成，称随从链（后随链）。合成，称随从链（后随链）。 4) 复制以双向进行，复制正在进行的部位称复制以双向进行，复制正在进行的部位称复制叉（复制叉（ReplicationReplication fork fork）, , 复制叉从起始点沿复制叉从起始点沿着着DNAD

22、NA移动。复制能够发生的移动。复制能够发生的DNADNA单位称复制子单位称复制子（RepliconReplicon）.（二）（二）SV40SV40的的DNADNA延伸延伸 1、前导链的延伸前导链的延伸 PolPol 合成一段新链合成一段新链 在在RFCRFC和和PCNAPCNA协助下，协助下， PolPol Pol Pol 转转换换 由由PolPol 完成全部前导链的合成完成全部前导链的合成 2 2、后随联的延伸、后随联的延伸三三 复制的终止复制的终止 对于线性对于线性DNADNA复制例如复制例如 噬菌体等比较简噬菌体等比较简单，复制到单，复制到分子末端终止。分子末端终止。 对于环状的大肠杆菌

23、对于环状的大肠杆菌DNADNA复制和真核生物复制和真核生物的的DNADNA复制就比较复杂。复制就比较复杂。复制叉到达终止区，完成复制前，复制暂停。两个子代复制叉到达终止区，完成复制前，复制暂停。两个子代DNADNA缠绕在一起，缠绕在一起，需要分开。需要分开。 在大肠杆菌：在大肠杆菌： 有复制起始点，也有复制终止点。有复制起始点，也有复制终止点。终止子（终止子（Terminator)）含）含22bpTus: Terminus utilization substance复制叉到达终止区，完成复制前，复制叉到达终止区，完成复制前，复制暂停。两个子代复制暂停。两个子代DNA缠绕在缠绕在一起，需要分开。

24、一起，需要分开。第三节第三节 参与参与DNADNA复制的酶类复制的酶类 参与参与DNADNA复制的酶或蛋白因子主要有以下几种：复制的酶或蛋白因子主要有以下几种： 1 DNA1 DNA聚合酶聚合酶 催化催化DNADNA的合成。的合成。 2 2 引物酶引物酶 起始起始DNADNA的合成的合成 3 3 连接酶连接酶 连接岗奇片段连接岗奇片段 4 DNA4 DNA解链，解旋酶解链，解旋酶 5 DNA5 DNA结合蛋白。结合蛋白。一一 DNADNA聚合酶聚合酶(Polymerase)(Polymerase) （一）（一） 作用机制作用机制 以以DNADNA做模板，碱基互补配对，催化做模板，碱基互补配对，

25、催化4 4种种dNTPdNTP 之间形成磷酸二酯键，从而延长之间形成磷酸二酯键，从而延长DNADNA链。链。 在模板链上进行在模板链上进行 不能从头合成，在引物的不能从头合成，在引物的3OH3OH端上延长端上延长 新链延长方向为新链延长方向为5 53 3延长延长 （二）二） 原核生物原核生物DNADNA聚合酶聚合酶 有有3 3种：种：DNADNA聚合酶聚合酶 I I，II II，IIIIII。 多功能酶：合成多功能酶：合成DNADNA的活性的活性 聚合酶作用聚合酶作用, , 延长延长DNADNA链。链。 水解水解DNADNA的活性的活性 外切核酸酶活性。切除不配外切核酸酶活性。切除不配对碱基，

26、起校读作用对碱基，起校读作用1 DNA1 DNA聚合酶聚合酶 I I 5-3 5-3延长延长DNADNA链（链（DNADNA聚合酶活性）聚合酶活性） 从从3 3端水解水解端水解水解DNADNA（ 5 53 3外切酶活性外切酶活性） 从从5 5端水解水解端水解水解DNADNA（ 5 53 3外切酶活外切酶活性），性）， 只作用于双链只作用于双链 DNADNA。 大片段（大片段（KlenowKlenow 片段）：含片段）：含 、 活活性性 小片段：含小片段：含 活性活性 DNA DNA聚合酶聚合酶 I I 在在DNADNA复制中所起的作用复制中所起的作用 不是主要的复制酶不是主要的复制酶 RNAR

27、NA引物的切除引物的切除 DNADNA损伤的修复：紫外线作用形成的损伤的修复：紫外线作用形成的TTTT二二 聚体的切除聚体的切除 链置换：链置换： 可能参与遗传重组可能参与遗传重组 切口平移（切口平移（nick translationnick translation） 探针标记探针标记切口平移切口平移( (NickNick Translation) Translation)2 DNA2 DNA聚合酶聚合酶 II II 不是复制酶，主要在不是复制酶，主要在DNADNA修复中起作用，无修复中起作用，无5 53 3外切酶活性。外切酶活性。3 DNA3 DNA聚合酶聚合酶 IIIIII 催化效率高，主

28、要复制酶。由催化效率高，主要复制酶。由1010种亚基组成：种亚基组成： （1 1）核心聚合酶：）核心聚合酶： ：DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 ：3-53-5外切酶活性，控制复制忠外切酶活性，控制复制忠 实性实性 ： （2 2） 二聚体：二聚体： 构成滑动钳，将全酶固定在构成滑动钳，将全酶固定在 DNADNA模板上，提高合成速率（模板上，提高合成速率（20/20/秒秒- 750/ 750/秒。秒。 （3 3） 复合物复合物 ： 2 2 协助协助 二聚体结合二聚体结合到到DNADNADNADNA聚合酶聚合酶 IIIIII 形成不对称的二聚体，与形成不对称的二聚体，与DNADNA双链结合，后随双

29、链结合，后随链折叠链折叠1801800 0，使后随链的物理方向，使后随链的物理方向与主导链与主导链一一致，同时催化两条链的复制致，同时催化两条链的复制。（三）（三） 真核生物真核生物DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 的作用的作用 DNADNA聚合酶聚合酶 : : 多亚基、多功能酶。多亚基、多功能酶。 大亚基：大亚基：DNADNA聚合酶活性。聚合酶活性。 100nt/100nt/次次 小亚基：引物酶活性，合成小亚基：引物酶活性，合成RNARNA。 起始起始DNADNA的合成：合成的合成：合成RNARNA引物和在引物和在RNA3RNA3羟基端合成一段羟基端合成一段DNADNA。D

30、NADNA聚合酶聚合酶 的作用的作用 DNADNA聚合酶聚合酶 的的结构结构 多亚基组成：多亚基组成： P125 P125 大亚基，催化亚基，含聚合酶和大亚基，催化亚基，含聚合酶和 外切酶活性外切酶活性 P50 P50 小亚基小亚基 与与PCNAPCNA结合相关结合相关 P66P66 P12P12DNADNA聚合酶聚合酶 的的功能功能 主要主要DNADNA复制酶：复制酶：DNADNA聚合酶活性，延伸聚合酶活性，延伸DNADNA链。链。 与与RFCRFC和和PCNAPCNA形成形成“全酶全酶”，在，在RFCRFC和和PCNAPCNA等的等的协同下，促使协同下，促使DNADNA聚合酶聚合酶 的解离

31、，的解离， DNADNA聚合酶聚合酶 接替接替DNADNA聚合酶聚合酶 继续继续DNADNA链的合成链的合成- - DNADNA聚合聚合酶酶 向向DNADNA聚合酶聚合酶 的转换。的转换。 复制校正功能：复制校正功能： 3-53-5外切核酸酶活性外切核酸酶活性 在在DNADNA修复、重组、细胞周期调控、修复、重组、细胞周期调控、DNADNA损伤检测中也起重要作用损伤检测中也起重要作用。 DNADNA聚合酶聚合酶 、 、 主要功能：主要功能：DNADNA修复。修复。 二、真核生物DNA聚合酶附属蛋白 1 1、RFCRFC：复制因子：复制因子C(C(R Replication eplication

32、 F Factor actor C C) )。多亚基复合物，多亚基复合物，DNADNA聚合酶的附属蛋白，聚合酶的附属蛋白，识别引物末端识别引物末端,参与链的延长。类似参与链的延长。类似 复合复合物。物。 2 2、PCNAPCNA：增殖细胞核抗原：增殖细胞核抗原（P Proliferating roliferating C Cell ell N Nuclearuclear A Antigen)ntigen)， DNADNA聚合酶的附属蛋白，参与聚合酶的附属蛋白，参与DNADNA的合成，的合成，类似类似 二聚体。二聚体。 3、PRP1和PRP2 Primer Recognition Protein

33、 增加增加DNADNA聚合酶聚合酶 与模板引物末端的亲和力，与模板引物末端的亲和力，增加增加DNADNA聚合酶聚合酶 的活性。的活性。三三 引物酶引物酶 primaseprimase DNADNA聚合酶不能引发聚合酶不能引发DNADNA新生链的合成，只能新生链的合成，只能 在已存在的在已存在的DNADNA链链或或RNARNA链上延长链上延长DNADNA。引物酶。引物酶催化引物催化引物RNARNA的合成。的合成。四四 连接酶连接酶 ligaseligase 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成，二个片段催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成，二个片段必须都与完整的模板链结合必须都与完整的模板链结合。 大肠杆菌

34、的连接酶需大肠杆菌的连接酶需NAD+NAD+，真核细胞的连接酶，真核细胞的连接酶需要需要ATPATP。 可连接双链可连接双链DNADNA中的单链切口，中的单链切口，RNA-DNARNA-DNA杂交体杂交体双链单链切口，不能连接双链双链单链切口，不能连接双链RNARNA中的单链切中的单链切口。口。五五 与与DNADNA解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶 （一）（一） DNADNA螺旋酶（螺旋酶（HelicaseHelicase） 催化双螺旋解旋和解链催化双螺旋解旋和解链 需消耗需消耗ATPATP （二）（二） 拓扑异构酶（拓扑异构酶（TopoisomeraseTopoisomerase) )

35、促进促进DNADNA双链的解开。需消耗双链的解开。需消耗ATPATP。（三）（三） 复制蛋白复制蛋白 A A（Replication Protein A Replication Protein A ，RPARPA） 也称也称DNADNA单链结合蛋白（单链结合蛋白（Single Strand Binding proteinSingle Strand Binding protein，SSBSSB） 主要功能：主要功能： 与单链亲和力大，稳定单链结构，保护单与单链亲和力大，稳定单链结构，保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成，有利复制进行。链免受核酸酶水解和阻止双链形成，有利复制进行。在复制起始阶段在

36、复制起始阶段,在细胞周期的调节信号作用下在细胞周期的调节信号作用下,起始复合物被激起始复合物被激活活,解螺旋酶解开解螺旋酶解开DNA双链双链, RPA特异地结合到暴露的特异地结合到暴露的DNA单链上单链上促进促进DNApol/引发酶复合物合成第一引发酶复合物合成第一个个RNA引物和引物和DNA短链短链;在延长阶段在延长阶段, RPA解开双链维持解开双链维持DNA模板处于单链状态模板处于单链状态,并保护单并保护单链的完整性链的完整性,使使DNA连续复制。连续复制。DNADNA复制的忠实性复制的忠实性 保证复制忠实性的因素保证复制忠实性的因素： 1 1 碱基之间的氢键配对作用碱基之间的氢键配对作用

37、 10 10-4 -41010-5-5 2 DNA 2 DNA聚合酶选择正确碱基的作用聚合酶选择正确碱基的作用 3 DNA 3 DNA聚合酶的校正作用和聚合酶的校正作用和3 35 5外切酶外切酶活性。活性。 延长之前先校正，切除延长之前先校正，切除3-3-末端错末端错配的碱基配的碱基。Poly III 和 Poly . 4 4、错配修复、错配修复(mismatch repair)(mismatch repair)半甲基化半甲基化DNA。新合成链未甲基化。新合成链未甲基化。箭头所指处为错配碱基起始位点箭头所指处为错配碱基起始位点外切酶切除错配碱基外切酶切除错配碱基DNA聚合酶聚合酶III等修复等

38、修复甲基化酶甲基化甲基化酶甲基化人类细胞中存在类似的错配修复人类细胞中存在类似的错配修复机制机制 第四节 DNA复制的调控复制的调控 DNADNA复制是细胞增殖的一个关键事件，因此，复制是细胞增殖的一个关键事件，因此，DNADNA复制与细胞分裂是互相协调、互相调控的。复制与细胞分裂是互相协调、互相调控的。 无论原核还市真核细胞中无论原核还市真核细胞中DNADNA复制都只发生在复制都只发生在细胞周期中特定时期，在一个细胞周期中，细胞周期中特定时期，在一个细胞周期中，DNADNA必须也只能复制一次必须也只能复制一次。一一 大肠杆菌复制的调节大肠杆菌复制的调节 1，起始体起始体 （ orisomeo

39、risome，起始复合物，蛋白质，起始复合物，蛋白质-ori-ori C C复合物）的装配复合物）的装配 参与形成参与形成orisomeorisome的组分：的组分： Dna A, Hu, IHF，Fis，Dpi， Ici A， Cnu，Hha，Rob，Seq A，Arc A 相互作用相互作用 ：Fis, IHF 调节调节 DnaA-ATP与与oriCoriC 的结的结合，合，HU HU 调节调节DnaADnaA, IHF , IHF 结合到结合到oriCoriC, , 并增强并增强DnaADnaA解解链能力。链能力。 2 2，防止复制再次起始，防止复制再次起始 (1) Dna(1) Dna

40、A A活性的抑制活性的抑制 Dna A-ADP DnaDna A-ADP Dna A-ATP A-ATP 无活性无活性 RIDA RIDA 有活性有活性 ori C(2) 降低游离形式的降低游离形式的Dna A水平水平Dna A结合位点结合位点 dat A区区在复制后极短时间内降低在复制后极短时间内降低 Dna A 水平水平可以结合可以结合300分子的分子的Dna A(3)(3) 隔离隔离 oriori C C ori CGATCCTAG甲基化甲基化未甲基化未甲基化摸板链摸板链新合成链新合成链Seq A 特异识别特异识别,并结合于半甲基化并结合于半甲基化ori C 的的GATC序列序列,使使o

41、ri C被隔离被隔离,防止复制再次发生防止复制再次发生二二 真核生物复制起始调空真核生物复制起始调空 1 1、DNADNA复制起始的调控复制起始的调控 2 2、细胞周期监控点机制、细胞周期监控点机制( (一一) )、DNADNA复制起始的调节复制起始的调节 1 1、复制起始点的选择复制起始点的选择 复制起始点数量的调控复制起始点数量的调控 真核细胞有多个复制起始点，起用多少起始真核细胞有多个复制起始点，起用多少起始点决定于点决定于S S期的长短。期的长短。 S S期短，起始点多。期短，起始点多。S S期长，起始点少。期长，起始点少。 遗传性起始点：遗传性起始点： DNADNA上的起始元件上的起

42、始元件 功能性起始点：功能性起始点： 实际起始点实际起始点 遗传性起始点遗传性起始点 多于多于 功能性起始点功能性起始点 酵母细胞酵母细胞3 3号染色体上有号染色体上有1414个遗传性复制起始个遗传性复制起始点，只有点，只有6 6个功能性复制起始点。个功能性复制起始点。 将将Ura3Ura3基因处的强复制起始点突变后，在其附基因处的强复制起始点突变后，在其附近的弱复制起始点就成为强复制起始点。近的弱复制起始点就成为强复制起始点。高等真核生物细胞至今未发现遗传性复制起始点高等真核生物细胞至今未发现遗传性复制起始点的序列特征，但确实存在功能性的复制起始点。的序列特征，但确实存在功能性的复制起始点。

43、CHOCHO细胞核细胞核 蟾蜍卵细胞抽提物蟾蜍卵细胞抽提物 损坏损坏CHOCHO细胞核或细胞核或 裸露裸露DNA DNA 非随机起始，同正常非随机起始，同正常 随机起始随机起始CHOCHO细胞细胞 复制起始点的选择与细胞核或染色体结构密切相关复制起始点的选择与细胞核或染色体结构密切相关2 2、 复制起始调控机制复制起始调控机制 （1 1） 复制的允许机制（复制的允许机制（Licensing modelLicensing model） （2）蛋白激酶的调控）蛋白激酶的调控 （1 1） 复制的允许机制（复制的允许机制（Licensing modelLicensing model） 一个细胞周期中一

44、个细胞周期中DNADNA复制发生一次且只能发生一次复制发生一次且只能发生一次 蟾蜍卵细胞蟾蜍卵细胞 外源细胞核外源细胞核 Licensing controlLicensing control 复制复制复制机制如何识别复制机制如何识别已经复制过一次的已经复制过一次的DNA复制起始点？复制起始点？图图 3-23 3-23 蟾蜍卵蟾蜍卵细胞复制系统证明细胞复制系统证明复制只发生一次复制只发生一次 图图 3 -2 4 “ 允允 许许因因 子子 ” 防防 止止 复复 制制再再 次次 发发 生生 的的 机机 制制复制后，复制后，Licensing Factor失活，失活的失活，失活的Licensing F

45、actor不能再次启动复制。核不能再次启动复制。核膜破裂后（细胞分裂后），新的膜破裂后（细胞分裂后），新的Licensing Factor进入核，启动下一周期进入核，启动下一周期的的DNA复制。复制。（2） 蛋白激酶的调控蛋白激酶的调控 真核细胞复制起始绝对必须的蛋白激酶：真核细胞复制起始绝对必须的蛋白激酶： CDK CDK 和和 Cdc7-Dbf4Cdc7-Dbf4激酶激酶 (1)(1)、前复制起始复合物前复制起始复合物的形成的形成 组成成分：组成成分：ORC(Origin Recognition Complex) ORC(Origin Recognition Complex) 含含6 6种

46、蛋种蛋白质，白质，Cdc6Cdc6，RLF RLF （Replication Licensing Factor, Replication Licensing Factor, 复制允复制允许因子）。许因子）。 (2)(2)、CDKCDK激活激活前前复制起始复合物复制起始复合物 复制前复合物复制前复合物受蛋白激酶的调控，或变受蛋白激酶的调控，或变成起始复合物成起始复合物，起始复制，或在复制过程中转变成起始复制，或在复制过程中转变成复制后复合物复制后复合物，就，就再也不能启动复制。再也不能启动复制。 CDKCDK（CyclinDependentCyclinDependent), Cdc7-Dbf4)

47、, Cdc7-Dbf4激酶，激酶， 蛋白激酶蛋白激酶A A，蛋白磷酸，蛋白磷酸酶酶2A2A，都参与复制的起始，在不同阶段起作用。，都参与复制的起始，在不同阶段起作用。 前复制起始复合物（前复制起始复合物（pre-replicativepre-replicative complex complex，pre-RC)pre-RC) （在遗传性复制起始点装配）（在遗传性复制起始点装配） CDKCDK 起始复合物（起始复合物（ReplicativeReplicative Complex,RC) Complex,RC) （在功能性复制起始点形成）（在功能性复制起始点形成） 在在G1G1期向期向S S期过渡

48、期间，期过渡期间，CDKCDK活性很高。活性很高。 CDKCDK同时又是防止在同一细胞周期中同时又是防止在同一细胞周期中DNADNA复制再复制再次发生的因素。阻止复制起始复合物的组装。次发生的因素。阻止复制起始复合物的组装。 CDKCDK对某些起始因子磷酸化。对某些起始因子磷酸化。（二）（二） 复制检查点机制复制检查点机制 识别识别DNADNA损伤或损伤或DNADNA复制阻断，通过复杂复制阻断，通过复杂 的信号转导途径，阻断细胞周期，启动修复机的信号转导途径，阻断细胞周期，启动修复机 制，恢复基因组的完整性，修复后再进入细胞制，恢复基因组的完整性，修复后再进入细胞 周期。周期。在长期进化过程在

49、长期进化过程中，细胞形成一中，细胞形成一套保证细胞周期套保证细胞周期中中DNA复制和染复制和染色体分配质量的色体分配质量的检查机制，即细检查机制，即细胞周期检查点胞周期检查点检查点：检查点： (1) G1 S S期检查点期检查点 查看查看DNADNA有无损伤有无损伤 DNA damage checkpointDNA damage checkpoint 细胞周期暂时减慢或停止。细胞周期暂时减慢或停止。 查看查看DNADNA复制的进度复制的进度 DNA replication checkpointDNA replication checkpoint 限制限制DNADNA复制速度复制速度 (2)、G

50、2 M 管理染色体的正确分配管理染色体的正确分配 Spindle assembly Spindle assembly checkpointcheckpoint启动相关基因恢复复制、启动相关基因恢复复制、启动启动DNA修复机制修复机制复制故障、复制故障、DNA损伤损伤中断细胞周期中断细胞周期探测器探测器(Sensor)传感器（传感器（Transducer） 效应器效应器（Effector）当细胞周期进程出现异常事件当细胞周期进程出现异常事件,如如DNA损伤或复制出错受阻时，损伤或复制出错受阻时，这类调节机制就被激活，及时这类调节机制就被激活，及时中断细胞周期的运行，待异常中断细胞周期的运行，待异