14临本(查)第十四章 DNA的生物合成.ppt课件.ppt

1、次级卵母细胞完成第二次成熟分裂次级卵母细胞完成第二次成熟分裂雌、雄原雌、雄原核形成核形成雌、雄原雌、雄原核融合核融合受精卵受精卵形成形成二细胞期二细胞期 四细胞期四细胞期 八细胞期八细胞期桑椹胚桑椹胚 早期胚泡早期胚泡 晚期胚泡晚期胚泡滋养层滋养层内细胞群内细胞群胚泡腔胚泡腔植入植入胚外体腔胚外体腔子宫腔子宫腔丛密绒毛膜丛密绒毛膜平滑绒毛膜平滑绒毛膜壁蜕膜壁蜕膜包蜕膜包蜕膜底蜕膜底蜕膜脐带脐带羊膜腔羊膜腔绒毛分部绒毛分部2 2个月个月胚体各期的外形特征胚体各期的外形特征3 3个月个月胚体各期的外形特征胚体各期的外形特征4 4个月个月胚体各期的外形特征胚体各期的外形特征5 5个月个月胚体各期的外

2、形特征胚体各期的外形特征6 6个月个月胚体各期的外形特征胚体各期的外形特征8 8个月个月胚体各期的外形特征胚体各期的外形特征遗传信息的传递遗传信息的传递分子生物学分子生物学 DNA RNA 蛋白质遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则复制复制转录转录翻译翻译逆转录逆转录执行生物学执行生物学功能（包括功能（包括参与复制、参与复制、转录及翻译转录及翻译等过程。等过程。DNA 是生物遗传的主要物质基础，生物机体的是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信遗传信息息以密码的形式编码在以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过核苷酸排列顺序，并通过DNA

3、的的复制复制由亲代传递给由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录转录给给RNA,然后然后翻译翻译成特异的蛋白质，以执行各种成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。DNA生物合成生物合成第第 十四十四 章章本章内容本章内容第一节第一节 DNADNA复制的基本特征（掌握）复制的基本特征（掌握） 第二节第二节 DNADNA复制的酶学和拓扑学变化（熟悉）复制的酶学和拓扑学变化（熟悉） 第三节第三节 原核生物原核生物DNADNA复制过程（掌握）复制过程（掌握） 第四节第

4、四节 真核生物真核生物DNADNA复制过程（掌握）复制过程（掌握） 第五节第五节 逆转录和其他复制方式（了解）逆转录和其他复制方式（了解） DNA DNA复制的基本特征复制的基本特征第一节第一节一、半保留复制一、半保留复制二、双向复制二、双向复制三、半不连续复制三、半不连续复制DNA复制的基本特征复制的基本特征（掌握）（掌握）DNA复制时，亲代复制时，亲代DNA双螺旋双螺旋解开解开成为两条成为两条单链单链，各自作，各自作模板模板，按照，按照碱基配对规律碱基配对规律合成一条与模板互补的新链，形合成一条与模板互补的新链，形成两个子代成两个子代DNA，每一个子代，每一个子代DNA分子中都分子中都保留

5、有一条保留有一条来来自亲代自亲代DNA的的 链，这种链，这种DNA复制的方式称为复制的方式称为 DNA的半保留复制的半保留复制(semi-conservative replication)。 一、一、DNA以半保留方式进行复制以半保留方式进行复制AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGG+母链母链DNADNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNADNA 目目 录录TCCATG

6、ACGGTGACCn子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 DNA以半保留方式进行复制，是在以半保留方式进行复制，是在1958年由年由M. Meselson 和和 F. Stahl 所完成的实验所证明。所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约的培养基中培养约十五代，使其十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为中的碱基氮均转变为15N。然后。然后将大肠杆菌移至只含将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取二代、三代。

7、分别提取DNA，作，作密度梯度离心密度梯度离心，将具有不同密度的将具有不同密度的DNA分离开。分离开。（一）（一）DNADNA半保留复制的实验证明半保留复制的实验证明密度梯度实验密度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果半保留复制的实验依据和意义半保留复制的实验依据和意义 按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA的的碱基碱基序列一致序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体，即子

8、代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的现了遗传的保守性保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是不是绝对的，绝对的，自然界还普遍存在自然界还普遍存在变异变异现象。现象。（二）半保留复制的意义（二）半保留复制的意义二、二、DNA复制从起点向两个方向延复制从起点向两个方向延伸伸 原核生物复制时，原核生物复制时，DNA从从复制起始点复制起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为制叉，称为双向复制双向复制。复制中的放射自显影图复制中的放射自显影图像像oriterA B CA B

9、CA. A. 环状双链环状双链DNADNA及复制起始点及复制起始点B. B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, (termination, terter) )DNADNA的双向复制示意图的双向复制示意图 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个的距离定为一个复制子复制子( (repliconreplicon) ) 。复制子。复制子是独立完成复制的功能单位。是独立完成复制的功能单位。 53oriorio

10、riori5353oriorioriori535533553复制子复制子3复制起始点与复制子示意图复制起始点与复制子示意图复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领头链随后链随后链3535DNADNA的双向复制的双向复制复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）DNA聚合酶聚合酶只能以只能以53方向聚合方向聚合子代子代DNA链链，即即模板模板DNA链链的方向必须是的方向必须是35。由于由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代链作为模板聚合子代DNA链时，链时，子代链的聚合方向也是不同的

11、。子代链的聚合方向也是不同的。三、三、DNA的半不连续复制的半不连续复制55前导链前导链后随链后随链半不连续复制半不连续复制解链方向解链方向以以35方向的亲代方向的亲代DNA链作模板的子代链在复链作模板的子代链在复制时基本上是制时基本上是连续连续进行的，其子代链的聚合方向进行的，其子代链的聚合方向为为53，这一条链被称为，这一条链被称为前导链前导链(leading strand)。以以53方向的亲代方向的亲代DNA链为模板的子代链在复链为模板的子代链在复制时则是制时则是不连续不连续的，其链的聚合方向也是的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为这条链被称为后后随随链链(lagging stran

12、d)。DNA复制时，前导链是连续的，而后随链是不连复制时，前导链是连续的，而后随链是不连续的，这种模式称续的，这种模式称半不连续复制半不连续复制。 由于亲代由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因双链在复制时是逐步解开的，因此，后随链的合成也是一段一段的。此，后随链的合成也是一段一段的。DNA在复在复制时，由后随链所形成的一些子代制时，由后随链所形成的一些子代DNA短链称短链称为为冈崎片段冈崎片段(Okazaki fragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为个核苷酸，而在真核生物中约为100200个核苷酸，相

13、当于一个核小体个核苷酸，相当于一个核小体DNA的大小。的大小。 1.底物底物：四种脱氧三磷酸核苷（：四种脱氧三磷酸核苷（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP) 2.模板模板：以：以DNA的解开两条链为模板链的解开两条链为模板链 3.引物引物：一小段：一小段RNA(或或DNA）为引物，提供）为引物，提供3-OH作为新链延伸的起点。作为新链延伸的起点。 4.酶和蛋白因子：酶和蛋白因子：DNA聚合酶、解螺旋酶。聚合酶、解螺旋酶。第二节第二节 DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化一、一、DNA聚合酶聚合酶(DNA-pol；DDDP):依赖依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶

14、。其催化反应的特点其催化反应的特点 （1 1）反应需要有模板的指导；）反应需要有模板的指导；（2 2）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物: :（3 3）反应需要有）反应需要有3 3 -OH-OH存在；存在；（4 4）DNADNA链的合成方向为链的合成方向为5 5 3 3 ；（5 5）新生）新生DNADNA链与模板链之间遵循碱基互补原则；链与模板链之间遵循碱基互补原则；DNA聚合酶的催化聚合酶的催化活性活性1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性DNADNA聚合酶的催化聚合酶的催化活性活性(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1

15、+ ppiMg2+DDDPN355OOHOH PPP-O-CH2OH 生物大分子合成：生物大分子合成：底物、酶、底物、酶、能量、模板能量、模板553DNA3DNA聚合酶聚合酶活性活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。n核酸核酸外切酶活性外切酶活性: : （一）原核生物有（一）原核生物有3种种

16、DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol n功能：功能： DNA-pol (250kD)是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。n功能：功能： DNA-pol （109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。中出现的空隙进行填补。323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Kle

17、now片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复损伤的应急状态修复。原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶 5有有有有有有3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性催化复制合成催化复制合成应急修复应急修复主

18、要作用主要作用多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I 有有 有有 有有聚合酶活性聚合酶活性 3无无无无有有5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性参与校对、修复参与校对、修复多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I（二）常见的（二）常见的真核细胞真核细胞DNADNA聚合酶有五种聚合酶有五种: :DNA-DNA-polpol 引物酶引物酶DNADNA修复修复 DNA-DNA

19、-polpol 线粒体线粒体DNADNA合成合成DNA-DNA-polpol 前导链和后随链合成，错配修复前导链和后随链合成，错配修复DNA-DNA-polpol 错配修复错配修复DNA-DNA-polpol 2.2.在在真核生物真核生物中，目前发现的中，目前发现的DNADNA聚合酶有五种聚合酶有五种: :DNA-DNA-polpol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。DNA-DNA-polpol 在在线粒体线粒体DNADNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-DNA-polpol 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶

20、，有解螺旋酶活性。DNA-DNA-polpol 在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。DNA-DNA-polpol 真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶 为了保证遗传的稳定，为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：复制时的保真性主要与下列因素有关： 1遵守严格的遵守严格的碱基配对规律碱基配对规律； 2DNA聚合酶在复制时对碱基的聚合酶在复制时对碱基的正确选择正确选择10-5； 3对复制过程中出现的错误及时进行对复制过程中出现的错误及时进行校正校正10-10。 二、复制

21、的保真性二、复制的保真性-有序而精确有序而精确（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择 DNADNA聚合酶聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型。与式构型。与相应相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切

22、酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。（二）聚合酶中的核酸（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正除错配碱基并加以校正DNA-DNA-polpol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读A A：DNA-DNA-polpol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。活性掺入正确配对的底物。B B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-DNA-polpol不表现外切酶活

23、性。不表现外切酶活性。理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (gyrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链DNA结合蛋白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质( (一）多种酶参与一）多种酶参与DNADNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态三、复制中的解链伴有三、复制中的解链伴有DNADN

24、A分子拓扑学变化分子拓扑学变化解螺旋酶（解螺旋酶（DnaB)(helicase) ，是将，是将DNA双螺旋结构解除。双螺旋结构解除。每解开一对碱基，需每解开一对碱基，需消耗消耗2分子分子ATP。 Dna B、 Dna C3 5 3 5 解螺旋酶的作用解螺旋酶的作用 Dna Aori单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（single strand DNA- binding protein, SSB），），是选择性结合并覆盖在单链是选择性结合并覆盖在单链DNA上上的一类蛋白，以防止解开的的一类蛋白，以防止解开的DNA单链被酶水解及重新单链被酶水解及重新结合成双链。结合成双链。 单链单链DNADNA结合

25、蛋白结合蛋白 稳定并保护稳定并保护DNADNA单链单链3 HO3 HO553 3 5 5 3 3 5 5 单链结合蛋白（单链结合蛋白（SSB)SSB)引物引物引物引物酶酶1010 8 8 局部解链后局部解链后DNADNA复制过程中正超螺旋的形成复制过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成（二）（二）DNADNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNADNA超螺旋状态超螺旋状态人类拓扑异构酶人类拓扑异构酶的分子结构的分子结构能够松解能够松解DNA超螺旋结构的酶。超螺旋结构的酶。拓扑异构酶的作用特点：拓扑异构酶的作用特点：既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二

26、酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶分分 类类拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。DNA拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶的作用机制 n拓扑酶拓扑酶II的作用方式：的作用方式：DNADNA连接酶连接酶(DNA (D

27、NA ligaseligase) ) 可连接可连接DNADNA链的链的3-OH3-OH末端和相邻末端和相邻DNADNA链链5-P5-P末端末端, ,使二者生成使二者生成33，5-5-磷酸二酯键磷酸二酯键，从而，从而把两段相邻的把两段相邻的DNADNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。四、四、DNADNA连接酶连接复制中产生的单链缺口连接酶连接复制中产生的单链缺口DNA连接酶连接酶ATP（NAD+）ADP+Pi（NMN+AMP）HO5POO-O-O353POO-O-O3553DNADNA连接酶的连接作用连接酶的连接作用DNA连接酶催化的条件是：连接酶催化的条件是： 需一段需一段DNA片

28、段具有片段具有3-OH，而另一段，而另一段DNA片段具有片段具有5-Pi基；基； 未封闭的未封闭的缺口位于双链缺口位于双链DNA中中，即其中有，即其中有一条链是完整的；一条链是完整的； 需要消耗能量，在原核生物中需要消耗能量，在原核生物中由由NAD+供供能能，在真核生物中，在真核生物中由由ATP供能供能。DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之是基因工程的重要工具酶之一。一。DNA连接酶的作用连接酶的作用提供核糖提供核糖3 3 -OH-OH提供提供5

29、5 -P-P结果结果DNADNA聚合酶聚合酶引物或延长中的新链引物或延长中的新链游离游离dNTPdNTP去去PPiPPi(dNTP)(dNTP)n+1n+1连接酶连接酶复制中不连续的两条单链复制中不连续的两条单链不连续不连续连续链连续链拓扑酶拓扑酶切断、整理后的两链切断、整理后的两链改变拓扑状态改变拓扑状态DNADNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3 3 ,5,5 - -磷酸二酯键生成的比较磷酸二酯键生成的比较复复 制制 过过 程程 动动 画画 第三节第三节 原核生物原核生物 DNA DNA复制过程复制过程- -起始、延长、终止起始、延长、终止一、复制的起始：一、复制的起

30、始：DNADNA解链形成引发体解链形成引发体准备工作：准备工作：1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3 -OH末端。末端。1.1.复制有固定起始点复制有固定起始点v DNADNA的复制有特定的起始位点，叫做的复制有特定的起始位点，叫做复制原点复制原点。常。常用用oriori( (或或o o）表示。许多生物的复制原点都是）表示。许多生物的复制原点都是富含富含A A、T T的区段的区段。v大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNADNA以及真核生物的细胞器以及真核生物的细胞器DNADNA为为双双链环状链环状，只有，只有一个一个复

31、制原点，而真核生物染色体复制原点，而真核生物染色体DNADNA是是线性双链分子线性双链分子，含有，含有许多许多复制起点。复制起点。（一）（一）DNADNA的解链的解链E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重

32、复序列5 3 5 3 复制有固定起始点复制有固定起始点2. DNA解解链需多种蛋白质参与链需多种蛋白质参与理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (gyrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链DNA结合蛋白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质 Dna B、 Dna C3 5 3 5 解螺旋

33、酶的作用解螺旋酶的作用 Dna Aori单链单链DNA结合蛋白结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。上，形成复制叉。3.解链过程中需要解链过程中需要DNA拓扑异构酶拓扑异构酶由由拓扑异构酶和解链酶拓扑异构酶和解链酶作用，使作用，使DNA的超螺旋的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链两条单链DNA。（二）引物合成和引发体形成：（二）引物合成和引发体形成： 由解螺旋酶由解螺旋酶(DnaB蛋白蛋白) 、DnaC蛋白、引蛋白、引物酶物酶(DnaG蛋白蛋白)和和DNA复制起始区域复制起始区域（TTATCCA

34、CA)形成形成引发体引发体； 在在引物酶引物酶的催化下，以的催化下，以DNA为模板，合成为模板，合成一段短的一段短的RNA片段，从而获得片段，从而获得3端自由羟端自由羟基（基（3-OH）。）。 引物酶引物酶(primase)本质上是一种本质上是一种依赖依赖DNA的的RNA聚合酶（聚合酶（DDRP），该酶以，该酶以DNA为模板，为模板，聚合一段聚合一段RNA短链引物短链引物(primer)，以提供自由，以提供自由的的3-OH，使子代，使子代DNA链能够开始聚合。链能够开始聚合。 DnaDna A A DnaDna B B、 DnaDna C CDNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSBS

35、SB33553 35 5. .引发体和引物引发体和引物含有解旋酶含有解旋酶DnaBDnaB 、DnaCDnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNADNA复制起始区域的复合结构称为复制起始区域的复合结构称为引发体引发体。 3 HO3 HO553 35 53 35 5引物酶催化合成短链引物酶催化合成短链RNARNA引物分子引物分子 引物引物引物引物酶酶二、二、DNADNA链的延长链的延长 复制中复制中DNA链的延长指在链的延长指在DNA聚合酶聚合酶催化下，催化下，以以35方向的亲代方向的亲代DNA链为模板，从链为模板，从53方方向聚合子代向聚合子代DNA链。其化学本质是链。其化学本质是dNTP以以d

36、NMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。磷酸二酯键不断生成。 在原核生物中，参与在原核生物中，参与DNA复制延长的是复制延长的是DNA聚聚合酶合酶；而在真核生物中是；而在真核生物中是DNA聚合酶聚合酶。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 3OH 33 3 DNA-DNA-polpolDNADNA复制的延长过程复制的延长过程n同一同一复制叉上前导链和后随链复制叉上前导链和后随链由相同由相同的的DNA-pol催化催化延长延长 前导链的合成过程前导链的合成过程后随链的合成过程后随链的合成

37、过程DNADNA聚合酶聚合酶催化前导链和后随链同时合成催化前导链和后随链同时合成复复制制过过程程简简图图目目 录录 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNADNA，双向复制的复制片段，双向复制的复制片段在复制的终止点在复制的终止点( (terter) )处汇合。处汇合。orioriterterE.coliE.coli82823232 oriori terterSV40SV4050500 0三、复制的终止三、复制的终止三、复制的终止三、复制的终止 在复制过程中形成的在复制过程中形成的RNA引物，需由引物，需由RNA酶酶来来水解去除；水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由引物水解后遗留的缺口，

38、由DNA聚合酶聚合酶（原核生物）或（原核生物）或DNA聚合酶聚合酶 （真核生物）催化（真核生物）催化延长缺口处的延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。键的缺口。切除引物，填补空缺和连接切口：切除引物，填补空缺和连接切口：在在DNA连接酶连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。长链。 连接冈崎片段：连接冈崎片段：5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶n 后随链上不连续性片段的连接：后随

39、链上不连续性片段的连接：切除引物切除引物填补空缺填补空缺连接切口连接切口第四节第四节 真核生物真核生物DNA生物合成过程生物合成过程（一）（一）DNA的复制速度慢、酶种类多的复制速度慢、酶种类多（二）（二）DNA复制过程涉及复制过程涉及核小体核小体分离与重新组装分离与重新组装（三）（三）多个复制子多个复制子（四）（四） DNA的复制发生在的复制发生在S期、冈崎片段短。期、冈崎片段短。（五）（五）端粒复制端粒复制 染色体染色体两端两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。引物，去除后留下空隙。哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生

40、物二、真核生物的的DNA生物合成生物合成细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两个关期这两个关键点。键点。G1S及及G2M的调节，与蛋白激酶活的调节，与蛋白激酶活性有关。性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。而实施调控作用。 真核生物每个染色体有多个起始点，是真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制多复制子子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。激活而不是同步起动。 复制的起始需要复制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）和（引物酶活性）和p

41、ol （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子制因子(replication factor, RF)。 一、真核生物一、真核生物复制的复制的起始：起始： 与原核生物基本与原核生物基本相似相似增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigenproliferation cell nuclear antigen，PCNAPCNA）在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。PCNAPCNA为同源三为同源三聚体，具有与聚体，具有与E.coliE.coli DNA DNA 聚合酶聚合酶的的亚基相同亚基

42、相同的功能和相似的构象，即形成的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动闭合环形的可滑动DNADNA夹子夹子，在，在RFCRFC的作用下的作用下PCNAPCNA结合于引物模板链结合于引物模板链；并且；并且PCNAPCNA使使polpol获得持续合成能力。获得持续合成能力。PCNAPCNA水平水平也是检验细胞增殖的重要指标。也是检验细胞增殖的重要指标。 DNA-pol DNA-pol 和和pol pol 分别兼有解螺旋酶和引物分别兼有解螺旋酶和引物酶酶活性。活性。 在在复制叉及引物生成后，复制叉及引物生成后，DNA-pol DNA-pol 通过通过增殖细增殖细胞核抗原（胞核抗原（PCNAPCNA

43、）的的协同作用，逐步取代协同作用，逐步取代pol pol ，在，在RNARNA引物的引物的3 3 -OH-OH基础上连续基础上连续合成前导链。合成前导链。 后随链后随链引物也由引物也由pol pol 催化合成。然后由催化合成。然后由PCNAPCNA协协同，同，pol pol 置换置换pol pol ，继续合成，继续合成DNADNA子链。子链。 二、真核生物二、真核生物复制的复制的延长：延长： 发生发生DNA聚合酶聚合酶/转换转换3 5 5 3 前导链前导链3 5 3 5 亲代亲代DNA后随链后随链引物引物核小体核小体三、真核生物三、真核生物DNADNA合成后立即组装成核小体合成后立即组装成核小

44、体 染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题线性线性DNA在复制完成后，其末端由于引物在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。）的催化下，进行延长反应。5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3

45、3 3 5 5 +5 3 3 3 3 5 5 5 n线性线性DNA复复制的末端制的末端 端粒（端粒（telomere）是是指真核生物染色体线指真核生物染色体线性性DNA分子末端的结分子末端的结构部分，通常膨大成构部分，通常膨大成粒状粒状。端粒的结构特点端粒的结构特点 由末端单链由末端单链DNADNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 末端末端DNADNA序列是多次重复的富含（序列是多次重复的富含（TnGnTnGn）x x重复序列。重复序列。TTTTTTTTGGGGGGGGTTTTTTTTGGGGGGGG功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNADNA复制的完整性复制的完整

46、性端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶是一种端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可蛋白质复合体，它可以其以其RNA为模板，通为模板，通过逆转录过程对末端过逆转录过程对末端DNA链进行延长。链进行延长。端粒酶的分子结构端粒酶的分子结构 人端粒酶人端粒酶RNA (human telomerase RNA, RNA (human telomerase RNA, hTRhTR) ) 人端粒酶协同蛋白人端粒酶协同蛋白1(human telomerase 1(human telomerase associated protein 1, hTP1)associated protein 1, hTP1)

47、 人端粒酶逆转录酶人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse (human telomerase reverse transcriptase, transcriptase, hTRThTRT) ) 端粒酶的组成端粒酶的组成端粒酶的爬行模型（动画演示）端粒酶的爬行模型（动画演示）DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工五、真核生物染色体五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期在每个细胞周期中只能复制一次中只能复制一次真核生物染色体真核生物染色体DNA细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S S期及期及M M期这两个关期这两个关键点。键点。G1S

48、G1S及及G2MG2M的调节，与蛋白激酶活性的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。相关的激酶都有调节制因子而实施调控作用。相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白亚基即细胞周期蛋白( (cyclincyclin) )，和催化亚基即，和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶细胞周期蛋白依赖激酶( (cyclincyclin dependent dependent kinasekinase，CDK)CDK)。 CDKCDK相匹配的周期蛋白相匹配的周期蛋白 作用点作用点CDK2CDK2CyclinCyclin D1, D2,

49、D1, D2, D3D3G1G1期期CyclinCyclin E EG1SG1S期期CyclinCyclin A AS S期期CDK3CDK3和和CDK4CDK4CyclinCyclin D1, D2, D1, D2, D3D3G2G2期期CDK1CDK1（CDC2CDC2）CyclinCyclin A, B A, BG2MG2M期期哺乳类动物的周期蛋白和哺乳类动物的周期蛋白和CDK哺乳类动物细胞内还发现天然抑制哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDKCDK的蛋白质的蛋白质，例如锚蛋白，例如锚蛋白( (ankyninankynin) )是是CDK4CDK4的特异性抑制物，的特异性抑制物，P21P2

50、1蛋白能抑制多种蛋白能抑制多种CDKCDK。锚蛋白和。锚蛋白和P21P21蛋白的抑制蛋白的抑制/ /活化可使细胞周期开放活化可使细胞周期开放/ /关闭，因此被形容为细关闭，因此被形容为细胞周期的检查点胞周期的检查点(check point)(check point)蛋白。蛋白。 逆转录的定义：逆转录的定义： 以以RNARNA为模板合成双链为模板合成双链DNADNA的过程。的过程。一、逆转录酶和逆转录一、逆转录酶和逆转录逆转录酶：依赖逆转录酶：依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。RDDPRDDP逆转录酶是逆转录酶是多功能酶多功能酶，兼有，兼有3 3种酶的活性：种酶的活性：催化三种反应