四讲RNA生物合成（精品PPT）课件.ppt

1、第四讲第四讲 RNA的生物合成的生物合成RNA代谢代谢一、一、RNA合成的特征合成的特征二、原核生物二、原核生物RNA合成合成三、真核生物三、真核生物RNA的合成的合成四、原核与真核生物四、原核与真核生物mRNA的比较的比较目录五、内含子的剪接、编辑、再编码及化学修饰五、内含子的剪接、编辑、再编码及化学修饰RNA代谢代谢 除了某些除了某些RNA病毒之外，所有病毒之外，所有RNA分子都来自于分子都来自于DNA。基因。基因组组DNA通过一个被称为转录的过程把贮存在双链通过一个被称为转录的过程把贮存在双链DNA分子中分子中的遗传信息转换到与模板的遗传信息转换到与模板DNA链相互补的链相互补的RNA单

2、链上。单链上。mRNA，编码了一个或多个蛋白质序列。，编码了一个或多个蛋白质序列。 tRNA，把，把mRNA上的遗传信息变为多肽中的氨基酸信息；上的遗传信息变为多肽中的氨基酸信息；rRNA，是合成蛋白质的工厂核糖体中的主要成份。，是合成蛋白质的工厂核糖体中的主要成份。 一、RNA合成的特征1、RNA的前体是四种核糖核苷三磷酸（的前体是四种核糖核苷三磷酸（rNTP）：）：ATP、GTP、CTP和和UTP。2、RNA链的生长方向也是从链的生长方向也是从5 3 ，核苷三磷酸加到新，核苷三磷酸加到新生链的生链的3 端，同时除去一分子焦磷酸而生成磷酸二酯键。端，同时除去一分子焦磷酸而生成磷酸二酯键。3、

3、转录必需以一条、转录必需以一条DNA链作为模板，按照碱基互补原则链作为模板，按照碱基互补原则进行转录，因此进行转录，因此DNA中的中的A、G、C、T将被分别转录为将被分别转录为U、C、G、A。 有义链（或编码链）有义链（或编码链）：与：与mRNA序列相同的那条序列相同的那条DNA链。链。反义链（或模板链）反义链（或模板链）：指根据碱基互补配对原则指导：指根据碱基互补配对原则指导RNA合成的合成的DNA链。链。4、RNA聚合酶与聚合酶与DNA聚合酶不同，聚合酶不同， RNA聚合酶能起始聚合酶能起始一条新链的合成，起始的核苷酸一般是嘌呤核苷三磷酸。一条新链的合成，起始的核苷酸一般是嘌呤核苷三磷酸。

4、5、转录有一定的起始、终止位点。、转录有一定的起始、终止位点。转录起始点及有关位置表示方法：转录起始点及有关位置表示方法：转录起始点是指转录起始点是指mRNA开始转录的第一个碱基，此点通常开始转录的第一个碱基，此点通常用用+1表示，由此与转录方向相一致的下游序列的碱基位置表示，由此与转录方向相一致的下游序列的碱基位置用正值表示；与转录方向相反的上游序列的碱基位置用负值用正值表示；与转录方向相反的上游序列的碱基位置用负值表示。表示。-30 -20 -10 +1 +10 +20 +30 +40上游上游 下游下游 1. RNApol的结构的结构 表表4-1 RNApol的结构的结构亚基亚基 亚基数亚

5、基数 WM（KD） 功能功能 编码基因编码基因 全酶全酶 2 40 P识别、核心酶装配识别、核心酶装配 rpoA 465KD。 1 155 rpoB 1 160 rpoC 催化中心催化中心 32-90 启动子特异选择启动子特异选择 rpoD核心酶核心酶全酶全酶二、原核生物RNA合成（一）（一） 原核生物原核生物RNA聚合酶（聚合酶（RNA polymerase) 因子不仅增加聚合酶对启动子的亲和力，还降低了它对非因子不仅增加聚合酶对启动子的亲和力，还降低了它对非专一位点的亲和力。专一位点的亲和力。 1. 定义定义 启动子是一段位于结构基因启动子是一段位于结构基因5端上游区的端上游区的DNADN

6、A序列，能活序列，能活化化RNARNA聚合酶，使之与模板聚合酶，使之与模板DNADNA准确地结合并具有转录起始的特准确地结合并具有转录起始的特异性。异性。 启动子的位置，可在启动子的位置，可在+1上游，也可在上游，也可在+1下游（个别）。下游（个别）。（二）启动子（二）启动子（promoter) 2. Promoter的结构的结构 可被可被RNA全酶保护的区域全酶保护的区域 -50 +20。 同源性序列：同源性序列： - 10 区、区、-35区区 有有同源性同源性；强启动子更保守。；强启动子更保守。 Pribnow box -10区区， 100个测定启动子中个测定启动子中T46 T41 T40

7、 T43 G43 N T80 A95 T45 A60 A50 T96 G37 富含富含A/T。此序列突变，导致启动受阻或活力下降。此序列突变，导致启动受阻或活力下降。 - 35 区，区， 识别区识别区T82 T84 G78 A65 C54 A54 TTGACA16 19bpTATAAT5 9bp+1-35-10图图4 6 一个典型的启动子含有三个部分，由在一个典型的启动子含有三个部分，由在-35、-10 和和起始原点的共有序列组成。起始原点的共有序列组成。在原核生物中，35区与10区之间的距离大约是1619bp。下降突变：如果把PribnowPribnow区区从TATAAT变成AATAAT就会

8、大大降低其结构基因的转录水平。上升突变：即增加区共同序列的同一性。如：乳糖操纵子的启动子中，将其PribnowPribnow区从TATGTT变成TATATT，就会提高启动子的效率。图图4 4 启动子的共有序列和启动子的共有序列和RNA聚合酶的结合部位。聚合酶的结合部位。 表表4-2 E.coli 不同不同 的识别序列（的识别序列（promote区）区） rpoD 70 通常通常 TTGACA 16-18bp TATAAT rpoH 32 热休克热休克 CCCTTGAA 13-15bp CCCGATNT rpoE E 热休克热休克 未知未知 未知未知 未知未知 rpoN 54 N利用利用 CTG

9、GNA 66bp TTGCA fliA F 鞭毛鞭毛 CCAAA 15bp GCCGATAA Gene 因子因子 用途用途 - 35区区 间隔区间隔区 -10区区 1 RNA合成的起始合成的起始（1） RNApol全酶识别。全酶识别。 RNApol酶与启动子酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过双链相互作用并与之相结合的过程。聚合酶与启动子结合形成封闭复合物。此时，程。聚合酶与启动子结合形成封闭复合物。此时，DNA仍处仍处于双链状态。伴随着于双链状态。伴随着DNA构象上的重大变化，构象上的重大变化，封闭复合物封闭复合物变变为为开放复合物开放复合物。（2） pppA或或pppG起始。起始。

10、 开放复合物与最初两个开放复合物与最初两个NTP相结合并在这两个核苷酸之相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后转变为包括间形成磷酸二酯键后转变为包括RNA聚合酶、聚合酶、DNA和新生和新生RNA的三元复合物。第一个碱基通常为嘌呤。的三元复合物。第一个碱基通常为嘌呤。 通过启动子阶段（合成通过启动子阶段（合成6-9个核苷酸）。个核苷酸）。（3） 因子脱落因子脱落（三）（三） RNA的酶促合成的酶促合成Figure 4 12 RNA polymerase passes through several steps prior to elongation. A closed binary comp

11、lex is converted to an open form and then into a ternary complex. 图图4 12 在延伸以前，在延伸以前，RNA聚合聚合酶要通过若干步。一个紧密的二酶要通过若干步。一个紧密的二聚体复合物被转变成一种开放形聚体复合物被转变成一种开放形式，然后变成三聚体复合物。式，然后变成三聚体复合物。v RNA-DNA杂交区约杂交区约12bpv RNApol解链的解链的DNA的长度为的长度为17bp（1.6个螺旋）个螺旋）v 因子脱落后，因子脱落后，NusA蛋白（防止转录终止的调节因子）蛋白（防止转录终止的调节因子）与与RNApol结合作用（不牢固

12、）。结合作用（不牢固）。 2 RNA链的延长链的延长图图4 16 RNA延伸的图解延伸的图解3 RNA合成的终止合成的终止 一旦一旦RNA聚合酶启动了基因转录，它就会沿着模板聚合酶启动了基因转录，它就会沿着模板53方向不停地移动，合成方向不停地移动，合成RNA链，直到遇到终止信号时链，直到遇到终止信号时才释放新生的才释放新生的RNA链，并与模板链，并与模板DNA脱离。脱离。 研究研究RNA链终止时遇到最常见的问题是链终止时遇到最常见的问题是3端核苷酸的定端核苷酸的定位，因为活细胞内部根据终止信号正确终止的位，因为活细胞内部根据终止信号正确终止的RNA与一个经与一个经过剪接的过剪接的RNA在在3

13、端没有两样，都是端没有两样，都是-OH基团。模板基团。模板DNA上上都有终止转录的特殊信号都有终止转录的特殊信号-终止子，每个基因或操纵子都有终止子，每个基因或操纵子都有一个启动子，一个终止子。在新生一个启动子，一个终止子。在新生RNA中出现发卡式结构会中出现发卡式结构会导致导致RNA聚合酶的暂停，破坏聚合酶的暂停，破坏RNA-DNA杂合链杂合链5端的正常端的正常结构。寡聚结构。寡聚U的存在使杂合链的的存在使杂合链的3端部分出现不稳定的端部分出现不稳定的rUdA区域区域。 （1） 依赖于依赖于因子的终止因子的终止 因子是一个相对分子质量为因子是一个相对分子质量为2.0105的六聚体蛋白，的六聚

14、体蛋白，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶酶，同时具有，同时具有解螺旋酶的活性。解螺旋酶的活性。 有人认为，在有人认为，在RNA合成起始以后，合成起始以后，因子即附着在新生因子即附着在新生的的RNA链上，靠链上，靠ATP水解产生的能量，沿着水解产生的能量，沿着53 方向方向朝朝RNA聚合酶移动，到达聚合酶移动，到达RNA的的3 -OH端后取代暂停在终端后取代暂停在终止位点上的止位点上的RNA聚合酶，它所具有的聚合酶，它所具有的RNA-DNA解螺旋酶活解螺旋酶活性使转录产物性使转录产物RNA从模板从模板DNA上释放，随后，转录复合体上释放，随后，转录

15、复合体解体，完成转录过程。终止过程需要消耗能量。解体，完成转录过程。终止过程需要消耗能量。 Figure 4 19 A rho-dependent terminator has a sequence rich in C and poor in G preceding the actual site(s) of termination. RNApol识别终止子，在转录此终止后合成速度减慢，识别终止子，在转录此终止后合成速度减慢，从从RNA5 移动至移动至RNApol处，使处，使RNA释放。释放。（图（图4 19 ）图图4 19 依赖依赖rho的一种终止子在终止作用的实际位点前方有的一种终止子在终

16、止作用的实际位点前方有一段富含一段富含C而极少含而极少含G的序列。的序列。RNA聚合酶沿模板移动聚合酶沿模板移动因子依附在因子依附在RNA的的5端端因子沿因子沿RNA链运动，跟踪聚合酶链运动，跟踪聚合酶因子赶上在终止位点暂停的聚合酶因子赶上在终止位点暂停的聚合酶终止终止 三元复合体解体三元复合体解体聚合酶在终止位点暂停聚合酶在终止位点暂停（2）不依赖于不依赖于 因子的终止因子的终止 若终止点上游存在一个富含若终止点上游存在一个富含GC碱基的二重对称区，碱基的二重对称区，由这段由这段DNA转录产生的转录产生的RNA容易形成容易形成发卡式结构发卡式结构；在终；在终止点前面有一段由止点前面有一段由4

17、-8个个A组成的序列组成的序列，导致转录产物的，导致转录产物的3端为寡聚端为寡聚U。这两种结构特征的存在同样决定了转录。这两种结构特征的存在同样决定了转录的终止。的终止。 在新生在新生RNA中出现发卡式结构会导致中出现发卡式结构会导致RNA聚合酶的聚合酶的暂停，破坏暂停，破坏RNA-DNA杂合链杂合链5端的正常结构。寡聚端的正常结构。寡聚U的的存在使杂合链的存在使杂合链的3端部分出现不稳定的端部分出现不稳定的rUdA区域。区域。 图图4 18 RNA合成合成时的发卡终止结构。时的发卡终止结构。（3）抗终止）抗终止破坏终止位点RNA的茎环结构依赖于蛋白因子的转录抗终止 噬菌体中由N基因编码产生的

18、N蛋白具有抗转录终止作用，但是其功能的发挥依赖于宿主所产生的NusA、NusB、S10、2.5104等几种蛋白质，这些蛋白质结合到终止子附近的DNA位点是实现抗终止的必要条件（图3-21）。DNA与RNA合成的不同点： 从从DNA合成反应的化学本质、极性和模板的使用合成反应的化学本质、极性和模板的使用这三方面来说，转录与复制是相同的。但是，也存这三方面来说，转录与复制是相同的。但是，也存在三个主要不同点：在三个主要不同点： A 转录中不需要转录中不需要RNA引物；引物； B转录反应一般只用一小段转录反应一般只用一小段DNA做模板；做模板； C在转录区，一般都只有一条在转录区，一般都只有一条DN

19、A链可以作为链可以作为模板。模板。 表表4-3 真核生物真核生物RNA聚合酶聚合酶 种类种类 存在存在 功能（合成产物）功能（合成产物） 结构结构 对对-鹅蕈碱敏感性鹅蕈碱敏感性 RNApol 核仁核仁 5.8S、18S、28S rRNA 2个大亚个大亚 不敏感不敏感 - 基、基、4-8 个小亚基个小亚基RNApol 核质核质 mRNA 敏感敏感 +RNA pol 核质核质 tRNA、5S rRNA、SnRNA 存在物种特异性存在物种特异性线粒体线粒体叶绿体叶绿体RNApol(核基因编码）核基因编码）三、真核生物三、真核生物RNA的合成的合成1. 真核生物真核生物RNA聚合酶聚合酶 真核生物的

20、真核生物的RNA聚合酶一般由聚合酶一般由816个亚基个亚基所组成，相对分子质量超过所组成，相对分子质量超过5x105 。 虽然不同生物虽然不同生物3类类RNA聚合酶的亚基种类和聚合酶的亚基种类和大小各异，但具有相似性。存在两个普遍遵循的大小各异，但具有相似性。存在两个普遍遵循的原则：一、聚合酶有两个相对分子质量超过原则：一、聚合酶有两个相对分子质量超过1x105的大亚基；二是同种生物的大亚基；二是同种生物3类聚合酶有共享小亚基类聚合酶有共享小亚基的倾向。（见下表）的倾向。（见下表）RNA聚合酶聚合酶I RNA聚合酶聚合酶II RNA聚合酶聚合酶IIIRPA1 RPB1 RPC1RPA2 RPB

21、2 RPC2RPC5 RPB3 RPC5RPC9 RPB11 RPC9RPC6 RPB6 RPB6其它其它9个亚基个亚基 其它其它7个亚基个亚基 其它其它11个亚基个亚基真核生物真核生物RNARNA聚合酶的亚基聚合酶的亚基2. 真核生物启动子的主要部位真核生物启动子的主要部位 位于位于-25-35区，其共有序列为区，其共有序列为TATA A ，TATA框主要框主要决定转录的决定转录的精确起始精确起始，RNA聚合酶同聚合酶同TATA框牢固结合之后框牢固结合之后才能开始转录。才能开始转录。（1）TATA框框（2）CAAT框框位于位于-70 -80区，共有序列区，共有序列GG CAATCT。（3）G

22、C框框ATATCT位于位于-80-110区，共有序列区，共有序列GCCACACC或或 GGGCGGG。CAAT区和区和GC区主要控制转录起始频率，基本不参与起始区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。位点的确定。（4）增强子）增强子（4）增强子）增强子增强子是一类远程调控序列。增强子是一类远程调控序列。远距离效应远距离效应 它们可调控的基因有相当远的距离，甚至它们可调控的基因有相当远的距离，甚至相距相距10kb也能发挥作用。也能发挥作用。无方向性无方向性 可处于被转录序列的上游，下游，甚至处于转可处于被转录序列的上游，下游，甚至处于转录序列中。录序列中。顺势调节顺势调节 只调节位于同

23、一染色体上的靶基因。只调节位于同一染色体上的靶基因。具有组织特异性具有组织特异性 增强子在行使功能时可具有组织特异性增强子在行使功能时可具有组织特异性或给定细胞中特定的分化阶段发挥作用。或给定细胞中特定的分化阶段发挥作用。有相位性有相位性 其作用与其作用与DNA的构象有关。的构象有关。无物种和基因特异性无物种和基因特异性 可以连接到异源基因上发挥作用。可以连接到异源基因上发挥作用。有的增强子可以对外部信号产生反应。有的增强子可以对外部信号产生反应。3. 真核生物真核生物RNA的转录的转录（1）起始起始：转录因子（反式作用因子）。：转录因子（反式作用因子）。（2）延伸：合成速度延伸：合成速度30

24、 50 nt/s, 速度不恒定。速度不恒定。（3） 终止终止 对于真核生物转录的终止信号和机制了解很少。爪蟾对于真核生物转录的终止信号和机制了解很少。爪蟾5SRNA的的3-末端为末端为4个个U，而这而这4个个U的前后均为富含的前后均为富含G/C的序的序列，在列，在G/C序列中分布着寡聚序列中分布着寡聚T（4个以上）是所有真核生物个以上）是所有真核生物RNA聚合酶聚合酶III的终止信号。的终止信号。表表3-4 真核生物真核生物RNA聚合酶聚合酶II所形成的转录起始复合物所形成的转录起始复合物蛋白质蛋白质 亚基数亚基数 亚基的相对分子量亚基的相对分子量/103 功能功能RNA聚合酶聚合酶II 12

25、 10220 催化催化RNA的生物合成的生物合成TBP 1 38 与启动子上的与启动子上的TATA区结合区结合TFIIA 3 12、19、35 使使TBP及及TFIIB启动子的结合比较稳定启动子的结合比较稳定 TFIIB 1 35 与与TBP相结合，吸引相结合，吸引RNA聚合酶和聚合酶和TFIID 12 15 250 与各种调控因子相互作用与各种调控因子相互作用TFIIE 2 34、57 吸引吸引TFIIH，还有还有ATP酶及解链酶活性酶及解链酶活性 TFIIF 2 30、74 结合结合RNA聚合酶聚合酶II并在并在TFIIB帮助下阻帮助下阻TFIIH 12 35 89 在启动子区解开在启动子

26、区解开DNA双链，使双链，使RNA聚合聚合TFIIF到启动子上到启动子上止聚合酶与非特异性止聚合酶与非特异性DNA序列相结合序列相结合酶酶II磷酸化，接纳核苷酸切除修复系统磷酸化，接纳核苷酸切除修复系统RNA聚合酶II及转录因子在启动子上的装配TBP（orTFIID and/orTFIIA）TFIIBTFIIF-RNA polymerase IITFIIETFIIH转录的抑制转录的抑制第一类：DNA模板功能抑制剂，通过与DNA结合而改变模板的功能。第二类：RNA聚合酶的抑制物，它们与RNA聚合酶结合而抑制其活力。 抑制剂抑制剂 靶酶靶酶 抑制作用抑制作用利福霉素 细菌全酶 和亚基结合，抑制起始

27、利迪链霉素 细菌核心酶 和亚基结合，抑制起始放线菌素D 真核生物RNA聚合酶I 与DNA结合，阻止延伸鹅膏蕈碱 真核生物RNA聚合酶II 与RNA聚合酶II 结合常见的转录抑制剂1.原核生物原核生物mRNA的特征的特征（1）原核生物）原核生物mRNA的半衰期短。的半衰期短。（2）许多原核生物）许多原核生物mRNA可能以多顺反子的形式存在。可能以多顺反子的形式存在。 后面几个顺反子的翻译起始会受到其上游顺反子结构的调后面几个顺反子的翻译起始会受到其上游顺反子结构的调控（图控（图3-14）（3）原核生物）原核生物mRNA的的5端无帽子结构，端无帽子结构，3 端没有或端没有或只有较短的只有较短的po

28、lyA结构。结构。 原核生物起始密码子原核生物起始密码子AUG上游上游7-12个核苷酸处有一个被个核苷酸处有一个被称为称为SD序列序列的保守区，因为该序列与的保守区，因为该序列与16S rRNA 3端反向互端反向互补，所以被认为在核糖体补，所以被认为在核糖体mRNA的结合过程中起作用。的结合过程中起作用。 四、原核与真核四、原核与真核mRNA特征比较特征比较帽子帽子结构结构有三种有三种v 0类帽子：类帽子：m7GpppX，真核单细胞生物，如；酵母。真核单细胞生物，如；酵母。v 1类帽子类帽子： m7GpppXm , 真核普遍存在。真核普遍存在。v 2类帽子类帽子： m7GpppXmpYm ，1

29、0 15%的真核有此结构。的真核有此结构。 形成：形成：帽子结构在剪切前已形成。帽子结构在剪切前已形成。2.真核生物真核生物mRNA特征特征（1）5 端存在端存在 帽子结构帽子结构（1）使）使mRNA免遭核酸酶的破坏。免遭核酸酶的破坏。 （2）有帽子结构的）有帽子结构的mRNA更容易被蛋白质合成的起更容易被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质的合成。始因子所识别，从而促进蛋白质的合成。作用作用：图图4 25 （2）绝大多数真核生物）绝大多数真核生物3端端具有多聚具有多聚A尾巴形式尾巴形式 mRNApoly(A)+ 示有示有poly; mRNApoly(A)- 示无示无poly polyA

30、是在是在polyA合成酶合成酶作用下逐个凑加的。作用下逐个凑加的。15-30bpAAUAAA+ nATPmRNApolyA合成酶合成酶PPiAAUAAAAAAAA AAAA AAUAAA为为poly(A)附加的识别序列。附加的识别序列。poly A的作用：的作用：（1）是）是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的由细胞核进入细胞质所必需的形式，它大大提高了形式，它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。在细胞质中的稳定性。 （2）可用于）可用于cDNA的合成。的合成。五、内含子的剪接、编辑、再编码及化学修饰五、内含子的剪接、编辑、再编码及化学修饰1. RNA中的内含子内含子：内含子：在在RNA原初转

31、录本中被切除，而最终不表达的片段。原初转录本中被切除，而最终不表达的片段。外显子：外显子：在在RNA原初转录本中剪接中保留并连在一起最终表原初转录本中剪接中保留并连在一起最终表达的片段。达的片段。部分人类基因中内含子序列所占的比例分析部分人类基因中内含子序列所占的比例分析基因基因 长度长度/kb 内含子数量内含子数量 内含子所占比例内含子所占比例胰岛素 1.4 2 67-球蛋白 1.4 2 69血清蛋白 18 13 89 胶原蛋白组分 31 117 71因子 186 25 95萎缩性肌强直因子 2400 78 99RNA加工过程及其生理功能 加帽反应加帽反应 mRNAmRNA从细胞核向细胞质转

32、运，翻译起始从细胞核向细胞质转运，翻译起始 加工过程加工过程 推测的生理功能推测的生理功能 加加polyApolyA反应反应 转录终止，翻译起始和转录终止，翻译起始和mRNAmRNA降解降解 RNA RNA的剪接的剪接 从从mRNA, tRNAmRNA, tRNA和和rRNArRNA分子中切除内含子分子中切除内含子 RNA RNA的切割的切割 从前体从前体RNARNA中释放成熟中释放成熟tRNAtRNA和和rRNArRNA5ABCDEFG3DNAmRNA(cDNA)卵清蛋白基因与卵清蛋白基因与cDNA的杂交。的杂交。 2. mRNA前体中的内含子的保守序列前体中的内含子的保守序列（1） GU-

33、AG法则，法则，Chambon法则法则多数细胞核多数细胞核mRNA前体中内含子的前体中内含子的5边界序列为边界序列为GU，3边界边界序列为序列为AG。因此，。因此，GU表示供体衔接点的表示供体衔接点的5端，端，AG代表接代表接纳体衔接点的纳体衔接点的3端。这种宝石序列模式称为端。这种宝石序列模式称为GU-AG法则，法则，又称为又称为Chambon法则。法则。（2）外显子与内含子交界处的序列，内含子内部的部分）外显子与内含子交界处的序列，内含子内部的部分序列也可能参与内含子的剪接。序列也可能参与内含子的剪接。A/CAG GUPuAGU A Py rich AG G535剪接位点 分支点 3剪接位

34、点外显子 内含子 外显子图图 脊椎动物脊椎动物mRNAmRNA前体中常见的内含子剪接所必需的保守序列前体中常见的内含子剪接所必需的保守序列许多发生分叉剪接的核许多发生分叉剪接的核mRNAmRNA内含子内含子3 3端上游端上游18-5018-50个核个核苷酸处，存在一个序列苷酸处，存在一个序列PyPy8080NPyNPy8787PuPu7575APyAPy9595，其中，其中A A为百分为百分之百保守。之百保守。 3.剪接体进行的剪接体进行的mRNA的剪接的剪接 核内核内mRNA原始转录产物的剪辑方式可能是最常见的。原始转录产物的剪辑方式可能是最常见的。在这一模式中，在这一模式中，RNA的剪辑需

35、要特异性的剪辑需要特异性RNA-protein-复合复合物物small nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和）和small nuclear RNAs（snRNAs）。已经发现至少有）。已经发现至少有5种种snRNAs-U1，U2，U4，U5，U6。 剪切位点特征：剪切位点特征： b. 无互补。无互补。 c. 位于内含子和外显子交界处。位于内含子和外显子交界处。 d. 以以GU开始，以开始，以AG告终。告终。AG上游上游外显子外显子GUAAGUA分支点分支点UACUAAC（酵母）酵母）(PY)nNCAG G下游下游外显子外显子5剪接位点剪接位点3剪接位点剪接位点

36、剪接信号：剪接信号：v 分支点序列。分支点序列。v 5和和 3剪切位点序列。剪切位点序列。a. 是保守序列，有共同的结构基元：是保守序列，有共同的结构基元：5AGGUAAGU。 免疫球蛋白免疫球蛋白1内含子内含子 UCAG GUCAGC UUGCAG GGGC表表4-3 剪接区序列剪接区序列 基因区域基因区域 外显子外显子 内含子内含子 外显子外显子卵清蛋白内含子卵清蛋白内含子2 UAAG GUGAGC UUACAG GUUG卵清蛋白内含子卵清蛋白内含子3 UCAG GUACAG AUUCAG UCUG 珠蛋白内含子珠蛋白内含子1 GCAG GUUGGU CCUUAG GCUG 珠蛋白内含子珠

37、蛋白内含子2 CAGG GUGAGU CCACAG UCUC起始起始 终止终止SV40病毒早期病毒早期T-抗原抗原 UAAG GUAAAU UUUUAG AUUCU1U2AFsU1 snRNPU2 snRNPU2没有SXL蛋白的合成SXL蛋白合成2 3 4SXL1 21 212U2AF651 21 Part of 2没有TRA蛋白的合成TRA蛋白的合成果蝇中与性别分化相关基因产物的特异性剪接过程3 4 53 54雄性特异的DSX蛋白雌性特异的DSX蛋白3 5Sxl pre-mRNAtra pre-mRNAdsx pre-mRNA 核酶的发现核酶的发现 最早认为最早认为RNA的剪接由蛋白质（酶）

38、进行。的剪接由蛋白质（酶）进行。实验实验1： 材料，材料， 四膜虫四膜虫26S rRNA6.4kb的的RNA前体前体（rRNA)（rRNA加工过程慢）加工过程慢） 分析：是否分析：是否RNA前体中混有某种蛋白？前体中混有某种蛋白？细胞提取液（未加）细胞提取液（未加）414nt（内含子）内含子）GTP4. I类和类和II类内含子的剪接类内含子的剪接 实验实验2：用重组用重组DNA制备制备RNA前体前体重组重组DNAin vitro 转录转录RNA前体前体GTP414nt26S rRNA结论：结论：RNA具有自我剪接能力，称之为具有自我剪接能力，称之为Ribozyme.1986年获诺贝尔奖年获诺贝

39、尔奖 I类内含子的剪切机制类内含子的剪切机制 剪接反应由剪接反应由2个转酯反应完成（四膜虫、细菌）。个转酯反应完成（四膜虫、细菌）。 a. 第一个转酯反应由第一个转酯反应由 一一个游离的鸟苷或鸟苷酸介导，个游离的鸟苷或鸟苷酸介导，鸟鸟苷或鸟苷酸苷或鸟苷酸3-OH 作为亲核基团攻击内含子作为亲核基团攻击内含子5的磷酸二酯键，的磷酸二酯键，从上游切开从上游切开RNA链。链。 b. 上游外显子上游外显子3-OH 攻击内含子攻击内含子3位核苷酸上的位核苷酸上的磷酸二酯磷酸二酯键，使外显子键，使外显子1和外显子和外显子2联结。联结。 c. 释放内含子环。释放内含子环。Group I内含子切除体系 II类

40、内含子的剪切机制类内含子的剪切机制细胞内定位细胞内定位：存在于真核生物的线粒体和叶绿体：存在于真核生物的线粒体和叶绿体rRNA基因中基因中特点特点：转酯反应无需游离鸟苷酸或鸟苷。：转酯反应无需游离鸟苷酸或鸟苷。过程：过程：a. 由内含子本身的靠近由内含子本身的靠近3端的腺苷酸端的腺苷酸2 OH作为亲核基团攻作为亲核基团攻击内含子击内含子5 端的磷酸二酯键，从上游切开端的磷酸二酯键，从上游切开RNA链后形成套索链后形成套索结构。结构。b. 再由上游外显子的自由再由上游外显子的自由3 OH作为亲核基团攻击内含子作为亲核基团攻击内含子3 位核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子被完全切开。位核苷酸上的磷酸二

41、酯键，使内含子被完全切开。c. 上下两个外显子通过磷酸二酯键相连。上下两个外显子通过磷酸二酯键相连。 Group II内含子切除体系 剪接体形成剪接体形成锤头状构象锤头状构象 已经发现有几类已经发现有几类RNA的自我剪切类型。的自我剪切类型。 四膜虫的四膜虫的rRNA剪接属剪接属类。类。 酵母酵母A- 2-OH 攻击属攻击属类。类。 无论哪一类，均要形成一定的无论哪一类，均要形成一定的催化构象催化构象，如已确定的锤头，如已确定的锤头型构象型构象。4-284-29 剪切位点突变导致地中海贫血症（剪切位点突变导致地中海贫血症（thalassemia) 地中海贫血症起因于血红蛋白合成缺陷。地中海贫血

42、症起因于血红蛋白合成缺陷。 此类贫血症中有一类是异常剪接引起。此类贫血症中有一类是异常剪接引起。mRNA前体中的内含子（前体中的内含子（intron)必须精确的剪切掉，必须精确的剪切掉，剪切位置发生一个核苷酸的差异，即会导致阅读框剪切位置发生一个核苷酸的差异，即会导致阅读框（reading frame)的改变，从而合成非功能蛋白。的改变，从而合成非功能蛋白。-珠蛋白的第一内含子发生突变，突变位点发生在正常珠蛋白的第一内含子发生突变，突变位点发生在正常3剪剪接位点上游，离位点接位点上游，离位点20个个N处。处。 正常人是正常人是G，病人是病人是A，即即G A。从而导致产生了一从而导致产生了一个新

43、的个新的3剪接位点（原位点上游），新剪切位点剪切，使剪接位点（原位点上游），新剪切位点剪切，使mRNA中密码子变化。在新剪切点后的第中密码子变化。在新剪切点后的第7个密码子是蛋白个密码子是蛋白质合成的终止密码。质合成的终止密码。结果是合成不正常的血红蛋白结果是合成不正常的血红蛋白-亚基，亚基，导致贫血症。导致贫血症。贫血病人贫血病人 5CCTATTAGTCTATTTTCCACCCTTAGGCTGCTG 3 正常人正常人 5CCTATTGGTCTATTTTCCACCCTTAGGCTGCTG 3内含子区内含子区 外显子外显子核酶发现的意义核酶发现的意义a. 生命的最初形式可能是生命的最初形式可能是

44、RNA，其兼有其兼有DNA和蛋白质的和蛋白质的功能。功能。b. 在进化过程中在进化过程中 作为遗传模板的功能让位于作为遗传模板的功能让位于DNA（RNA不稳定）不稳定） 作为催化剂的功能让位于蛋白质。作为催化剂的功能让位于蛋白质。 c. 利用其机制，设计合成特异性切割病毒利用其机制，设计合成特异性切割病毒RNA或其它或其它RNA的核酶，以便于治疗包括爱滋病、癌症在内的疾的核酶，以便于治疗包括爱滋病、癌症在内的疾病。病。 核酶的类型：核酶的类型：a.剪切型剪切型b.剪接型剪接型2. RNA的编辑、再编码及化学修饰的编辑、再编码及化学修饰（1） RNA的编辑的编辑RNARNA的编辑的编辑是某些mR

45、NA前体的一种加工方式，如插入、删除或取代一些核苷酸残基，导致DNA所编码的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。类型位点特异性脱氨基作用引导RNA指导的尿嘧啶插入或删除哺乳动物载脂蛋白mRNA的编辑CAAUAA肝中剪接的mRNA编码含4563个残基的蛋白质肠中mRNA有密码子在第2153位密码子终止合成第2153位密码子编码GlnCAA哺乳动物中RNA编辑的实例 组织组织 靶标靶标RNA 所改变的碱基所改变的碱基 结果结果 肝脏、肠肝脏、肠 载脂蛋白载脂蛋白 C U 谷氨酰胺密码子谷氨酰胺密码子终止子终止子肌肉肌肉 半乳糖苷酶半乳糖苷酶 U A 苯丙氨酸密码

46、子苯丙氨酸密码子酪氨酸酪氨酸睾丸、肿瘤等睾丸、肿瘤等 Wilms肿瘤因子肿瘤因子1 U C 亮氨酸密码子亮氨酸密码子脯氨酸脯氨酸肿瘤肿瘤 神经纤维瘤基因神经纤维瘤基因1 C U 精氨酸密码子精氨酸密码子终止子终止子脑脑 谷氨酸受体蛋白谷氨酸受体蛋白 A I 多个谷氨酸密码子多个谷氨酸密码子精氨酸精氨酸利什曼原虫属细胞色素利什曼原虫属细胞色素b mRNA的编辑的编辑AAAUAUAAUAGAAA G G C AAA UAUAA UAGAAUUUAUGUUGUCUU 与指导RNA配对U插入释出mRNAUUUAUGUUGUCUU 指导RNAmRNAmRNARNARNA编辑的生物学意义编辑的生物学意义（

47、1）校正作用（2）调控翻译（3）扩充遗传信息2. RNA2. RNA的再编码的再编码mRNA在某些情况下不是以固定的方式翻译，而是可以改变原来的编码信息，以不同的方式进行翻译，科学上把RNA编码和读码方式的改变称为RNA的再编码。核糖体1/-1移位核糖体跳跃3.RNA的化学修饰的化学修饰有些RNA，特别是rRNA和tRNA，还可能有特异性化学修饰。图3-31例如：人细胞内rRNA分子就存在106种甲基化和95种假尿嘧啶产物。2. rRNA转录后的加工转录后的加工 真核生物有真核生物有4种种rRNA。 大亚基（大亚基（60S）rRNA: 28S(4700nt); 5S(120nt); 5.8S(

48、160nt)。 小亚基（小亚基（40S）rRNA ： 18S（1900nt)。 其中其中5.8S rRNA 、18S rRNA 、28 S rRNA 为一个转录单为一个转录单位，前体为位，前体为45S RNA，其加工过程其加工过程如图如图。 5S rRNA与与tRNA在一个转录单位中。在一个转录单位中。 4-30 转录后加工步骤：转录后加工步骤： 切除成熟切除成熟 tRNA 5、3序列：序列： 5- ：RNaseP。 3 ：核酸内切酶和外切酶。：核酸内切酶和外切酶。 3-末端末端CCA凑加：凑加： tRNA核苷酸转移酶。核苷酸转移酶。 修饰：修饰： 甲基化：甲基化：甲基转移酶。甲基转移酶。 氢化：氢化： DHU 转位：转位： 3. tRNA转录后加工转录后加工4-31