1、紫外可见分光光度法目 录w紫外可见光谱学原理和应用w仪 器w样品处理及测定w方 法w二极管分光光度计的特性1.基本原理w电磁波谱：无线电波、红外线、宇宙射线、x射线、紫外线、可见光w波长范围：200-800nmw波长和频率： E=h =c / 越短，E越高短波长的紫外光能量高，这种成份导致了皮肤晒黑。w紫外可见光谱的来源： 辐射作用于物质，发生反射、散射、吸收、荧光、磷光、光化学反应。通常测量紫外可见光谱时我们希望只发生吸收。w分子内电子跃迁导致谱带变宽，产生吸收光谱适用含量范围: 10-5%50% 2. 定性分析：w 鉴定谱图和结构w 同一性的认证 w 颜 色 w 其他定性信息 蛋白质的熔点
2、测定 酶活性 3. 定量分析： w朗伯比尔定律： A = b c (为摩尔吸光系数)w多组分的分析 叠加性原理：一种混合物在任何波长下的吸光率 等与混合物中各组分在该波长下的A之和。 浓溶液的不适用性 化学偏离与仪器偏离w几乎所有金属元素的定量分析 0.01 mol/L时, 粒子相互影响 电荷分别改变. 也改变. 浓电解质中有类似效应.化学:缔合,离解,溶剂化,PH变化等仪器:单色光不纯. 峰值处测量可改善w该方法能分析复杂的混合物和图谱相似的简单混合物。w用最小二乘法计算的偏差表明了标准光谱和样品光谱的拟合程度，同时也说明了分析结果的准确性。w简单联立方程式 w最小二乘法 w偏最小二乘法（P
3、LS）,关键组分的回归法（PCR）,多重最小二乘法（MLS） 多组分分析方法4. 间接测量： w化学衍生法w分光广度滴定w酶动力学分析1.仪器设计分光光度计的组成w产生一定光谱宽度的电磁辐射光源w色散装置：从光源发射宽的电磁波中选择特定的波长w样品区域w检测器:测量辐射强度传统的分光光度计适用于测量光谱中单点吸光度二极管阵列分光光度计比较：样品和色散元件的相对位置次序相反，称为反向光路按构型分 单光束设计：提供高的光通量，灵敏度高；但光源漂移产生较大误差 双光束设计：矫正漂移。斩光器以一定速度旋转，使空白和样品的交替测量每秒进行数次。缺点，降低了光的能量和灵敏度 分光束设计：分裂器将光分成两束
4、，同时穿过参比和空白，到达两个分开但一样的检测器，可同时测定样品和空白 双波长设计：同时测定两个波长，如样品中两个同时发生的反应2.主要仪器参数（可能影响吸光度测量值准确度及精确度的一些仪器参数）w光谱分辨率w波长准确度及精确度 w线性动态范围 w漂移 SBW/NBW0.1影响测光准确度和精确度的因素：杂散光和噪声杂散光：检测到选定波长带宽以外的任何波长 光。 T =( I + I s ) / ( I 0 + I s )噪声w光子噪声：在测量低浓度低吸光率样品时，影响精确测量两束高强度的光之间的微小差别。w电子噪声：是固有的，与测定的光强度无关。在高吸光度样品的信号很小时影响大 w 液体样品w
5、 固体样品w 弱吸收w 强吸收w 干扰w 光化学问题w动力学光谱法w固相光谱法w多元校正多组分测定w导数光谱法Beer定律：A=abc)/lg(lg0IITA)30. 2exp(0abcII一阶导数：ddaabcbcIddIabcddII)30. 2exp(30. 2)30. 2exp(00如果控制I0不变，则 ,而00ddIddaIbcI30.2ddabcddA结论：A信号也正比于c， 在原拐点处灵敏度最大 高阶导数光谱同样适用导数光谱的特点： 随着导数阶数的增加，峰越来越尖锐，灵敏度提高信噪比随导数的阶数增加而降低原谱一阶导数二阶导数二极管阵列分光光度计的特点w二极管阵列光谱学的优点w二极管阵列光谱学的缺点 快速采集，多波长同时测定，灵敏度高，有统计学意义，很高的稳定性和可靠性，敞开式的样品室 分辨率较低，散射光严重，样品会分解参考文献：Tony owen著, 现代紫外可见光谱学基础，1997，12-5965-5123E张剑荣，戚苓,方惠群编，仪器分析试验，科学出版社，1999曾永昌，向立人，周在德编，仪器分析，四川大学出版社，1992G.W.尤因著，华东化工学院分析化学教研组译，化学分析的仪器方法，1986罗国安，邱家学，王义明编，可见紫外定量分析及微机应用，上海科学技术文献出版社，1988
