微生物实验室质量控制2009课件.ppt

1、卫生微生物实验室卫生微生物实验室的质量保证与质量控制的质量保证与质量控制二二0000九年四月九年四月微生物实验室微生物实验室v卫生微生物实验室卫生微生物实验室v病原微生物实验室病原微生物实验室v临床微生物实验室临床微生物实验室v分子微生物实验室分子微生物实验室微生物检测的定义微生物检测的定义v在特定的环境下在特定的环境下( (无菌无菌) )，采用适当的方法对，采用适当的方法对样品中目标微生物进行增殖和培养，并对以样品中目标微生物进行增殖和培养，并对以放大后的目标微生物进行感官、生理、生化放大后的目标微生物进行感官、生理、生化等到方面的特性分析和判定，以确定样品中等到方面的特性分析和判定，以确定

2、样品中目标微生物的量或质的特性的过程。目标微生物的量或质的特性的过程。微生物检测涉及的要素微生物检测涉及的要素v检验人员检验人员v检测经验的判断能力v检测设备检测设备v保证目标菌种的生长的外部环境v菌种试剂菌种试剂v保证目标菌种的生长的内部环境v检测方法检测方法v选择适宜目标菌种检测的方法v测试环境测试环境v保证操作过程不受外界干扰（保护样品和人员）检验人员检验人员v检验人员需经过微生物专业基础知识和无菌检验人员需经过微生物专业基础知识和无菌技术的培训后技术的培训后, ,方可上岗操作方可上岗操作, ,并应了解本专并应了解本专业国内外的最新文献资料、参加专业培训，业国内外的最新文献资料、参加专业

3、培训，不断更新专业知识和提高检验质量，从实践不断更新专业知识和提高检验质量，从实践中不断提高实验室质量管理规范，以保证检中不断提高实验室质量管理规范，以保证检验工作科学、规范、优质、高效，确保数据验工作科学、规范、优质、高效，确保数据准确和报告公正，实现实验室的标准化、规准确和报告公正，实现实验室的标准化、规范化和管理科学化。范化和管理科学化。质量保证和质量控制的目的质量保证和质量控制的目的v质量保证质量保证v为使人们能确信某产品(这里指培养基)能满足规定的质量要求所必须的执行的有计划的和系统的活动。v质量控制质量控制v为达到质量要求所采取的作业技术和活动。v为监测整个检测的过程，排除在具体的

4、技术操作中导致不满意的原因，以取得可靠的检测结果。微生物实验室设施微生物实验室设施v微生物检验必须在无菌环境中进行，保持样微生物检验必须在无菌环境中进行，保持样品的原污染状态，防止二次污染。在未普遍品的原污染状态，防止二次污染。在未普遍采用现代化的无菌隔离器技术之前，无菌室采用现代化的无菌隔离器技术之前，无菌室仍然是最常用的无菌环境之一，无菌室及配仍然是最常用的无菌环境之一，无菌室及配套的相关建筑设计应充分考虑其合理布局，套的相关建筑设计应充分考虑其合理布局，操作安全，使用方便等条件。操作安全，使用方便等条件。微生物实验室布局微生物实验室布局v无菌室应远离交通干道、厕所及污染区，最无菌室应远离

5、交通干道、厕所及污染区，最好在二楼以上，应选上、下水道及其他安装好在二楼以上，应选上、下水道及其他安装适宜的位置。灭菌物品存放和传输、培养间、适宜的位置。灭菌物品存放和传输、培养间、结果观察、阳性对照实验室和办公室等，要结果观察、阳性对照实验室和办公室等，要集中，减少污染，便于管理和使用。集中，减少污染，便于管理和使用。微生物实验室布局微生物实验室布局v无菌操作间应具有单向流空气净化设备，无无菌操作间应具有单向流空气净化设备，无菌操作间面积不小于菌操作间面积不小于5m5m2 2, ,高度不超过高度不超过2.4m,2.4m,温温度控制在度控制在18182626，相对湿度，相对湿度40%40%60

6、%60%。新鲜空气经高效层流过滤后进入操作间。洁新鲜空气经高效层流过滤后进入操作间。洁净度级别为局部百级、周围环境万级。应保净度级别为局部百级、周围环境万级。应保持对环境形成正压，不同级别的洁净室之间持对环境形成正压，不同级别的洁净室之间的压差不低于的压差不低于4.9Pa4.9Pa，洁净区对与其相通的非，洁净区对与其相通的非洁净区的压差不低于洁净区的压差不低于10Pa10Pa。无菌室洁净度要。无菌室洁净度要定期检查沉降菌或浮游菌及悬浮粒子。定期检查沉降菌或浮游菌及悬浮粒子。微生物实验室布局微生物实验室布局v无菌室内应六面光滑、平整、无缝隙、不起无菌室内应六面光滑、平整、无缝隙、不起灰、耐腐蚀、

7、易清洗，墙与地面、台面、墙灰、耐腐蚀、易清洗，墙与地面、台面、墙壁之间连接处应呈凹弧形，不留死角，室内壁之间连接处应呈凹弧形，不留死角，室内不安装上、下水道，进出口应为拉门，出入不安装上、下水道，进出口应为拉门，出入操作间和缓冲间的门不应直对。室内的电源操作间和缓冲间的门不应直对。室内的电源总控制应设在室外。总控制应设在室外。微生物实验室布局微生物实验室布局v无菌室内采光的面积要大，照明灯应嵌装在无菌室内采光的面积要大，照明灯应嵌装在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300300勒克斯，缓冲间和操作间匀应设置紫外灯勒克斯，缓冲间和操作间匀应设置紫外灯（

8、2 22.5w/m2.5w/m3 3) )，距实验台面高度不超过，距实验台面高度不超过1m1m。微生物实验室使用微生物实验室使用v无菌检查、微生物限度检查、微生物效价检无菌检查、微生物限度检查、微生物效价检定应有专用的无菌室，不可混用，以免彼此定应有专用的无菌室，不可混用，以免彼此干扰或交叉污染。干扰或交叉污染。v阳性对照实验阳性对照实验以及具有危险性的毒菌、毒素以及具有危险性的毒菌、毒素等检验，如破伤风梭菌、黄曲霉毒素等检验，等检验，如破伤风梭菌、黄曲霉毒素等检验，必须有必须有单独使用的无菌间或生物安全柜单独使用的无菌间或生物安全柜，以，以便控制，防止传播。便控制，防止传播。微生物实验室使用

9、微生物实验室使用v无菌室一般应设有一更、二更、缓冲间和无无菌室一般应设有一更、二更、缓冲间和无菌操作间。无菌室内应有人净、物净设施，菌操作间。无菌室内应有人净、物净设施，所有实验器材应经过消毒处理后，通过物流所有实验器材应经过消毒处理后，通过物流间无菌传递系统进入无菌室，执行人流和物间无菌传递系统进入无菌室，执行人流和物流分开。流分开。微生物实验室的分级微生物实验室的分级v根据中华人民共和国国家标准根据中华人民共和国国家标准GB19489-2004实验室生物安全通用要求实验室生物安全通用要求把把所有操所有操作的微生物因子的危害程度和采取的防护措作的微生物因子的危害程度和采取的防护措施，将微生物

10、实验室所处理样本的生物危险施，将微生物实验室所处理样本的生物危险性程度将微生物实验室分为四级：性程度将微生物实验室分为四级：v级对生物安全隔离要求最低，级对生物安全隔离要求最低，级最高。级最高。以以BSL-1、 BSL-2、 BSL-3、 BSL-4表示微表示微生物实验室的相应生物实验室的相应生物安全防护水平生物安全防护水平。微生物实验室的分级微生物实验室的分级v级生物安全防护实验室：级生物安全防护实验室：v实验室结构和设施、安全操作规程、安全设实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对健康成年人巳知无致病作用的微备适用于对健康成年人巳知无致病作用的微生物，如用于教学的普通微生物实验室等

11、。生物，如用于教学的普通微生物实验室等。v级生物安全防护实验室：级生物安全防护实验室：v实验室结构和设施、安全操作规程、安全设实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物。生物。微生物实验室的分级微生物实验室的分级v级生物安全防护实验室：级生物安全防护实验室：v实验室结构和设施、安全操作规程、安全设实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重备适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其病毒，的甚至是致死疾病的致病微生物及其病毒，通常巳有预防传染的疫苗。艾滋病病毒的

12、研通常巳有预防传染的疫苗。艾滋病病毒的研究（血清学实验除外）应在究（血清学实验除外）应在级级生物安全防生物安全防护实验室中进行。护实验室中进行。微生物实验室的分级微生物实验室的分级v级生物安全防护实验室：级生物安全防护实验室：v实验室结构和设施、安全操作规程、安全设实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人体具有高度的危险性，通过气备适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及毒素。效的疫苗或治疗方法的致病微生物及毒素。与上述情况类似的不明微生物，也必须在与上述情况类似的不明微生物，也必

13、须在级级生物安全防护实验室中进行。待有充分数生物安全防护实验室中进行。待有充分数据后再决定此种微生物或毒素应在据后再决定此种微生物或毒素应在级级还是还是在较低级别的实验室中处理。在较低级别的实验室中处理。仪器设备仪器设备v所用的各种器械及设备应按计量要求定期检所用的各种器械及设备应按计量要求定期检测，全部设备应满足检测项目的要求，做到测，全部设备应满足检测项目的要求，做到设备档案齐全，每台（件）设备需使用标签设备档案齐全，每台（件）设备需使用标签标识，需检定或校准的设备表明状态和有效标识，需检定或校准的设备表明状态和有效期限，仪器使用作业指导书，手册和使用记期限，仪器使用作业指导书，手册和使用

14、记录，环境监测记录、维修记录等，以保证其录，环境监测记录、维修记录等，以保证其正常使用。正常使用。仪器设备仪器设备v无菌实验室配备的紫外消毒装置，使用前后无菌实验室配备的紫外消毒装置，使用前后进行照射消毒，要定期进行紫外线强度和空进行照射消毒，要定期进行紫外线强度和空气质量监测，高效过滤器应定期进行风速监气质量监测，高效过滤器应定期进行风速监测，根据检测的情况，必要时予以更换处理。测，根据检测的情况，必要时予以更换处理。生物安全实验室，要正常进行管理维护和工生物安全实验室，要正常进行管理维护和工作人员隔离防护。作人员隔离防护。v高压蒸汽灭菌器除定期校验表压和温度外，高压蒸汽灭菌器除定期校验表压

15、和温度外，应定期用生物指示剂对灭菌效果进行验证。应定期用生物指示剂对灭菌效果进行验证。仪器设备仪器设备v其他微生物学检验所用的仪器，如培养箱、其他微生物学检验所用的仪器，如培养箱、电热恒温水浴箱、电热恒温干燥箱、酸度计、电热恒温水浴箱、电热恒温干燥箱、酸度计、电子天平、微量加样器、光学光度计、冰箱、电子天平、微量加样器、光学光度计、冰箱、低温冰箱、光学显微镜、生物安柜等，应严低温冰箱、光学显微镜、生物安柜等，应严格按规定进行检查。格按规定进行检查。v培养箱内保持清洁，要定期进行细菌和霉菌培养箱内保持清洁，要定期进行细菌和霉菌的检查。的检查。实验室维护实验室维护v工作台面：工作台面：v测定样品前

16、或开始工作前，必须用清洁剂测定样品前或开始工作前，必须用清洁剂（消毒剂）彻底消洁台面。（消毒剂）彻底消洁台面。v工作结束（样品制备、接种、转移）或当天工作结束（样品制备、接种、转移）或当天工作结束后，台面要再清洁消毒。工作结束后，台面要再清洁消毒。v处理致病菌性物质时，用处理致病菌性物质时，用75%75%的乙醇，的乙醇，707090%90%的异丙醇或次氯酸盐溶液消毒。的异丙醇或次氯酸盐溶液消毒。实验室维护实验室维护v生物危害性物质：生物危害性物质：v所有物质用后立即置于厂商建议浓度的消毒所有物质用后立即置于厂商建议浓度的消毒液中（如液中（如5%5%的苯酚溶液），或直接扔到危害的苯酚溶液），或直

17、接扔到危害袋中。所有物质在袋中。所有物质在121121持续高压灭菌至少持续高压灭菌至少3030分钟。分钟。v灭菌后按规定丢弃所有具器。遵守废弃物处灭菌后按规定丢弃所有具器。遵守废弃物处理规定。理规定。培养基的质量控制标准培养基的质量控制标准v培养基分类上属于培养基分类上属于体外诊断试剂体外诊断试剂。其质量控。其质量控制的标准有：制的标准有：v中华人民共和国质量监督检验检疫总局中华人民共和国质量监督检验检疫总局商商品化微生物培养基的质量保证品化微生物培养基的质量保证SNCCLS-1996SNCCLS-1996v中华人民共和国卫生部中华人民共和国卫生部商业性微生物养基商业性微生物养基质量检验规程质

18、量检验规程WS/T232-2002(WS/T232-2002(所谓所谓商业性商业性就就是即买即用的一次性培养基是即买即用的一次性培养基) )v中华人民共和国中华人民共和国医药行业标准医药行业标准 YY/T 0577-YY/T 0577-20052005培养基的质量控制标准培养基的质量控制标准v中华人民共和国质量监督检验检疫总局培养中华人民共和国质量监督检验检疫总局培养基制备指南基制备指南 第第1 1部分部分实验室培养基制备和实验室培养基制备和质量保证通则质量保证通则SN/T1538.1-2005SN/T1538.1-2005v中华人民共和国药典中华人民共和国药典20052005年版年版v中国药

19、品标准检验操作规范中国药品标准检验操作规范20052005年版年版v中国合格评定国家认可委员会（中国合格评定国家认可委员会（CNAS-CNAS-CL09:2006)CL09:2006)检测和校准实验室能力认可准检测和校准实验室能力认可准则在微生物领域的应用说明则在微生物领域的应用说明培养基的质量控制标准培养基的质量控制标准v中华人民共和国质量监督检验检疫总局培养中华人民共和国质量监督检验检疫总局培养基制备指南基制备指南 第第2 2部分部分培养基性能测试实用培养基性能测试实用指南指南SN/T1538.2-2007SN/T1538.2-2007v中华人民共和国食品药品监督管理局中华人民共和国食品药

20、品监督管理局 国食药国食药监械监械20085352008535号号 培养基类产品分类界定培养基类产品分类界定等等v综合上述的质量控制标准，下面主要以综合上述的质量控制标准，下面主要以SN/T SN/T 15381538的标准为主要内容简述一下培养基的质的标准为主要内容简述一下培养基的质量保证与质量控制。量保证与质量控制。培养基制备指南培养基制备指南:SN/T1538:SN/T1538vSN/T1538.1-2005(2005-7-1SN/T1538.1-2005(2005-7-1实施实施) )v第第1 1部分：实验室培养基制备质量保证通则部分：实验室培养基制备质量保证通则v提出要求并制定系统的

21、控制计划提出要求并制定系统的控制计划v属于质量保证的范围属于质量保证的范围vSN/T1538.2-2007(2007-10-16SN/T1538.2-2007(2007-10-16实施实施) )v第第2 2部分：培养基性能测试实用指南部分：培养基性能测试实用指南v为保证提出的质量要求所需要采取的技术操作为保证提出的质量要求所需要采取的技术操作v属于质量控制的内容属于质量控制的内容SN/T1538SN/T1538标准制定情况标准制定情况v本部分为本部分为SN/T1538SN/T1538的第的第1 1部分对应于：部分对应于：vISO/TS11133-1:ISO/TS11133-1:食品和动物饲料培

22、养基制备指南食品和动物饲料培养基制备指南- -培养基制备指南培养基制备指南- -实验室培养基制备质量保证通则实验室培养基制备质量保证通则(2000(2000英文版英文版) )与其的一致性程度与其的一致性程度 (2005-07-01 (2005-07-01实施）实施）v本部分为本部分为SN/T1538SN/T1538的第的第2 2部分对应于：部分对应于：vISO/TS11133-2:2003ISO/TS11133-2:2003食品和动物饲料培养基制备食品和动物饲料培养基制备指南指南与其的一致性程度与其的一致性程度 (2007-10-16 (2007-10-16实施）实施）SN/T1538 SN/

23、T1538 标准的作用标准的作用v为培养基质量保证和质量控制标准体系，有为培养基质量保证和质量控制标准体系，有利于对培养基的标准化管理，提高实验室检利于对培养基的标准化管理，提高实验室检测质量。测质量。v第第1 1部分为质量保证和培养基质量基本要求。部分为质量保证和培养基质量基本要求。v第第2 2部分为质量控制技术。部分为质量控制技术。v为中国实验室国家认可委员会（为中国实验室国家认可委员会（CNASCNAS）合格）合格评定微生物实验室认证工作提供参考依据。评定微生物实验室认证工作提供参考依据。培养基的类型培养基的类型v各别成分培养基（自制培养基）：各别成分培养基（自制培养基）：v实验室用不同

24、的化学试剂或生物工程试剂按实验室用不同的化学试剂或生物工程试剂按照一定的配方、比例配置而成的培养基。照一定的配方、比例配置而成的培养基。v即用型培养基（商业培养基）：即用型培养基（商业培养基）：v以即用形式置于容器中（例如：平皿、试管以即用形式置于容器中（例如：平皿、试管、安瓿安瓿或其它容器）供应的培养基。或其它容器）供应的培养基。v脱水合成培养基（干粉培养基）：脱水合成培养基（干粉培养基）：v不立即使用的干粉形式的（如：粉末、颗粒、不立即使用的干粉形式的（如：粉末、颗粒、冻干等形式）培养基冻干等形式）培养基。培养基的分类培养基的分类v培养基是指以液体、半固体或固体形式，培养基是指以液体、半固

25、体或固体形式，包含天然或合成成分，用于促进微生物的包含天然或合成成分，用于促进微生物的繁殖或保持其活力的物质组成。繁殖或保持其活力的物质组成。v培养基分类培养基分类v按状态分类：液体、固体、半固体培养基。按状态分类：液体、固体、半固体培养基。v按用途分类按用途分类v运送培养基：保护和维持微生物活性，不运送培养基：保护和维持微生物活性，不含有使微生物增殖的物质。含有使微生物增殖的物质。培养基的分类培养基的分类v保存培养基；在一定期限内保护和维持微生保存培养基；在一定期限内保护和维持微生物活力，或使微生物在长期保存后容易复苏物活力，或使微生物在长期保存后容易复苏（如卵黄培养基）。（如卵黄培养基）。

26、v复苏培养基：能够使受损或应激的微生物修复苏培养基：能够使受损或应激的微生物修复、使微生物恢复正常生长能力，但不促进复、使微生物恢复正常生长能力，但不促进微生物繁殖的培养基（如缓冲蛋白胨水）。微生物繁殖的培养基（如缓冲蛋白胨水）。v增菌培养基增菌培养基（选择性：如胆盐乳糖增菌液、（选择性：如胆盐乳糖增菌液、非选择性：如营养肉汤）。非选择性：如营养肉汤）。培养基的分类培养基的分类v分离培养基分离培养基v选择性分离培养基：支持特定微生物的生长选择性分离培养基：支持特定微生物的生长而抑制其他微生物生长（如胆盐硫乳琼脂）而抑制其他微生物生长（如胆盐硫乳琼脂）v非选择性分离培养基：对微生物没有选择性非选

27、择性分离培养基：对微生物没有选择性的抑制作用（如营养琼脂）的抑制作用（如营养琼脂）v鉴别培养基：能够进行一项或多项微生物生鉴别培养基：能够进行一项或多项微生物生理学或生化特性鉴定试验（如三糖铁琼脂）理学或生化特性鉴定试验（如三糖铁琼脂）v鉴定培养基：能够产生一个特定的鉴定反应鉴定培养基：能够产生一个特定的鉴定反应而不需要做进一步确认实验的培养基（如而不需要做进一步确认实验的培养基（如MUGMUG培养基）培养基）培养基的质量保证培养基的质量保证v生产企业提供的材料：生产企业提供的材料：v培养基名称、各种成分和增补剂名称、产品培养基名称、各种成分和增补剂名称、产品批号。批号。v培养基使用前的培养基

28、使用前的PHPH值。值。v储藏条件和有效期。储藏条件和有效期。v技术数据清单。技术数据清单。v质控证书（性能评价和所用的测试菌种）。质控证书（性能评价和所用的测试菌种）。v必要的安全及危害数据。必要的安全及危害数据。培养基的质量保证培养基的质量保证v实验室验收：实验室验收：v保存有效的培养基目录清单。保存有效的培养基目录清单。v包装情况和完整性。包装情况和完整性。v培养基的名称和批号。培养基的名称和批号。v接收日期、有效期。接收日期、有效期。v首次开封日期。首次开封日期。v内容物的感官检查内容物的感官检查( (粉末的流动性、均匀性、粉末的流动性、均匀性、结块情况和颜色变化结块情况和颜色变化)

29、)。培养基的储存培养基的储存v例行常规检查（干粉培养基）：例行常规检查（干粉培养基）：v容器密封性复查；首次开封日期；内容物感容器密封性复查；首次开封日期；内容物感官检查。官检查。v使用前检查（商业性培养基）：使用前检查（商业性培养基）：v颜色是否发生变化？是否蒸发颜色是否发生变化？是否蒸发/ /脱水？脱水？ 是否是否有微生物污染？有微生物污染？v严格按照供应商提供的储藏条件、有效期和使用方严格按照供应商提供的储藏条件、有效期和使用方法进行培养基的保存和使用。法进行培养基的保存和使用。v有计划购买，先购先用。有计划购买，先购先用。培养基的储存培养基的储存v成品培养基（系指配好待用的培养基成品培

30、养基（系指配好待用的培养基, ,下同）下同）v已分装好的培养基：避光、冷藏。已分装好的培养基：避光、冷藏。v最终成分在使用前加入的培养基，冰箱保存最终成分在使用前加入的培养基，冰箱保存不超过三个月，室温保存不超过一个月。不超过三个月，室温保存不超过一个月。v不稳定的选择性添加成分应在培养基制备的不稳定的选择性添加成分应在培养基制备的当天使用。当天使用。v观察任意颜色变化，记录培养基蒸发或微生观察任意颜色变化，记录培养基蒸发或微生物生长情况。物生长情况。培养基的实验室制备培养基的实验室制备v使用商品化的脱水合成培养基时，应严格按使用商品化的脱水合成培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配置，如重

31、量照厂商提供的使用说明配置，如重量/ /体积、体积、PHPH值、制备的数据、灭菌条件、操作步骤。值、制备的数据、灭菌条件、操作步骤。v使用独立成分制备培养基时，按配方准确配使用独立成分制备培养基时，按配方准确配置并记录配置步骤。置并记录配置步骤。培养基的实验室制备培养基的实验室制备v水：要求使用蒸馏水或相同质量的水，不含水：要求使用蒸馏水或相同质量的水，不含有抑制或影响微生物生长的物质。有抑制或影响微生物生长的物质。v称量和复水：防止培养基结块。称量和复水：防止培养基结块。v溶解和分装：适当加热重复搅拌。溶解和分装：适当加热重复搅拌。v pHpH值的测定和调整：使用值的测定和调整：使用 pHp

32、H计。计。 1mol/L1mol/L的氢氧化钠溶液或的氢氧化钠溶液或1mol/L1mol/L的盐酸溶液的盐酸溶液进行进行pHpH值的调整。值的调整。培养基的实验室制备培养基的实验室制备v分装分装v灭菌灭菌 v湿热灭菌：按使用说明规定进行湿热灭菌：按使用说明规定进行 ，监控高压，监控高压灭菌过程，保证灭菌温度，避免过度加热。灭菌过程，保证灭菌温度，避免过度加热。v过滤除菌：真空负压或正压条件下进行，滤过滤除菌：真空负压或正压条件下进行，滤膜和滤垫除菌。滤器膜和滤垫除菌。滤器121121灭菌灭菌2020分钟。分钟。培养基的使用培养基的使用v琼脂培养基的融化琼脂培养基的融化 避免过度加热，融化后避免

33、过度加热，融化后的培养基应尽快使用，不要放置超过的培养基应尽快使用，不要放置超过4 4小时。小时。v对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至48482 2时加入。时加入。v平板培养基的保存：暗处存放一周或平板培养基的保存：暗处存放一周或4 41212冰箱密封袋，存放三周或按厂商提供标冰箱密封袋，存放三周或按厂商提供标准进行。作好标记（名称、制备日期、有效准进行。作好标记（名称、制备日期、有效期）。期）。v平板冷却后装袋避免产生冷凝水。平板冷却后装袋避免产生冷凝水。培养基的使用培养基的使用v平板培养基的培养平板培养基的培养 每垛最多堆放六个平板，平板间要留有空隙每

34、垛最多堆放六个平板，平板间要留有空隙 进行空气流通，使温度尽快达到一致。进行空气流通，使温度尽快达到一致。v培养基的弃置培养基的弃置v所有污染和未使用的培养基的弃置必须采用安全的所有污染和未使用的培养基的弃置必须采用安全的方式，并且要符合相关法规（废弃物处理程序）的方式，并且要符合相关法规（废弃物处理程序）的规定。规定。 成品培养基的质量控制成品培养基的质量控制v物理质量的控制物理质量的控制v20202525时的时的pHpH值。值。v液体培养基：外观透明、清亮、无混浊、无液体培养基：外观透明、清亮、无混浊、无沉淀。沉淀。v固体培养基：具有特定颜色、表面湿润无水固体培养基：具有特定颜色、表面湿润

35、无水气、平整光洁无凹坑和气泡、无杂质气、平整光洁无凹坑和气泡、无杂质 厚度厚度3 34mm4mm。成品培养基的质量控制成品培养基的质量控制v无菌实验无菌实验v压力蒸汽灭菌后的固体培养基，随机抽取一压力蒸汽灭菌后的固体培养基，随机抽取一定数量放定数量放36361 1温箱培养温箱培养2424小时。小时。v煮沸消毒的选择性培养基可取部分琼脂，放煮沸消毒的选择性培养基可取部分琼脂，放入无菌肉汤培养入无菌肉汤培养2424小时。小时。v培养后无细菌生长视为合格。培养后无细菌生长视为合格。成品培养基的质量控制成品培养基的质量控制v细菌生长实验细菌生长实验：用已知标准菌株做质控。：用已知标准菌株做质控。v测试

36、菌种要求测试菌种要求 v具有稳定特性，能代表其种并能有效证明实具有稳定特性，能代表其种并能有效证明实验室特定培养基的最佳性能。验室特定培养基的最佳性能。v可溯源至国家或国际公认的菌种收藏中心。可溯源至国家或国际公认的菌种收藏中心。v可使用实验室自己分离的具有良好特性的菌可使用实验室自己分离的具有良好特性的菌种，但必须对照标准菌株进行鉴定。种，但必须对照标准菌株进行鉴定。成品培养基的质量控制成品培养基的质量控制v质控菌种要求具有稳定特性，能代表其种并质控菌种要求具有稳定特性，能代表其种并能有效的证明实验室特定培养基的最佳性能能有效的证明实验室特定培养基的最佳性能的菌种。测试菌种主要购于参考菌种的

37、菌种的菌种。测试菌种主要购于参考菌种的菌种保藏中心。保藏中心。 v中国医学细菌保藏管理中心中国医学细菌保藏管理中心 CMCCCMCC 。v美国细菌收集和分型中心美国细菌收集和分型中心 ATCCATCC 。成品培养基的质量控制成品培养基的质量控制v培养基的测试菌种应具备以下性能：培养基的测试菌种应具备以下性能：v典型反应的强阳性菌种；典型反应的强阳性菌种；v弱生长的阳性菌种（选择更敏感的菌种）；弱生长的阳性菌种（选择更敏感的菌种）；v生化反应菌种（显示不同发酵和荧光反应的生化反应菌种（显示不同发酵和荧光反应的菌种）；菌种）；v完全抑制菌种。完全抑制菌种。成品培养基的质量控制成品培养基的质量控制v

38、菌液制备菌液制备v将工作用的质控菌株在培养平板上转种，培将工作用的质控菌株在培养平板上转种，培养后取养后取3 35 5个单个的菌落悬浮于少量的灭菌个单个的菌落悬浮于少量的灭菌TSBTSB中，培养中，培养4h4h5h5h。v用分光光度计调整浊度至用分光光度计调整浊度至0.50.5麦氏标准或在麦氏标准或在625nm625nm吸光度值为吸光度值为0.080.080.10.1，使菌落计数达，使菌落计数达到到(1(12)2)10108 8 CFU/ CFU/mLmL。成品固体培养基的质量控制成品固体培养基的质量控制v将将363611培养培养181824h24h的的新鲜菌悬液新鲜菌悬液用生理用生理盐水作盐

39、水作1:101:10稀释，在每个待测培养基上用稀释，在每个待测培养基上用3mm3mm接种环或接种环或0.1mL0.1mL稀释悬液接种稀释悬液接种, ,使浓度达到使浓度达到100 100 CFU/CFU/碟。碟。v至少使用两块平板，每块平板的菌落平均数至少使用两块平板，每块平板的菌落平均数应为应为100cfu100cfu。v按适宜的温度培养，按适宜的温度培养，观察观察平板上平板上细菌的生长细菌的生长特征。特征。结果应生长良好。结果应生长良好。成品固体培养基的质量控制成品固体培养基的质量控制v平板培养技术：平板培养技术：v倾注法倾注法v涂布法涂布法v旋转涂布法旋转涂布法成品液体培养基的质量控制成品

40、液体培养基的质量控制v将将363611培养培养18182424小时的小时的新鲜菌悬液新鲜菌悬液用生理盐水作用生理盐水作1:101:10稀释，取稀释，取5050100cfu 100cfu 接种至试验培养基和参照培养基中。接种至试验培养基和参照培养基中。v按适宜的温度进行培养。按适宜的温度进行培养。v观察每瓶（管）细菌的生长情况，结果应观察每瓶（管）细菌的生长情况，结果应生长良好。生长良好。v对于不透明的培养基，在确定生长时需接对于不透明的培养基，在确定生长时需接种到琼脂培养基上。种到琼脂培养基上。成品培养基质量检查记录成品培养基质量检查记录v培养基质量检查记录表培养基名称生产厂家批号外观颜色澄清

41、度pH软硬度微生物学性能检定结论检验者/时间备注微生物检验的量值溯源微生物检验的量值溯源v为满足培养基、试剂盒和试剂的质量测定和为满足培养基、试剂盒和试剂的质量测定和微生物工程检测过程的质量控制需要，实验微生物工程检测过程的质量控制需要，实验室应准备好足够种类和数量的参考菌株和参室应准备好足够种类和数量的参考菌株和参考培养物。考培养物。v参考菌株和参考培养物可以由有资质的单位参考菌株和参考培养物可以由有资质的单位提供或经过准确鉴定的分离株。提供或经过准确鉴定的分离株。v菌种：个体形态以及菌落特征相近，而且生菌种：个体形态以及菌落特征相近，而且生化反应、基因特征、血清型均保持一致的细化反应、基因

42、特征、血清型均保持一致的细胞菌落。胞菌落。微生物检验的量值溯源微生物检验的量值溯源v参考菌种：至少定到属或种水平的菌种，按参考菌种：至少定到属或种水平的菌种，按其特征进行分类和描述。其特征进行分类和描述。v参考参考原种原种：将实验室获得的或供应商提供的：将实验室获得的或供应商提供的标准菌种在实验室经过一代转接后获得的一标准菌种在实验室经过一代转接后获得的一套独立的相同的菌种。套独立的相同的菌种。v工作菌种：由参考原株转接一代获得的菌种。工作菌种：由参考原株转接一代获得的菌种。菌种保藏的目的菌种保藏的目的v菌种保藏的目的：菌种保藏的目的：v保持菌种较高的存活率；保持菌种较高的存活率；v降低菌种的

43、变异幅度；降低菌种的变异幅度；v防止其他微生物污染；防止其他微生物污染；v在适宜条件下，菌种可以重新恢复原有在适宜条件下，菌种可以重新恢复原有生物学活性。生物学活性。菌种保藏的原理菌种保藏的原理v菌种保藏的原则是根据菌种的生理、生化特菌种保藏的原则是根据菌种的生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞处于休眠状态，生长胞的代谢强度，使细胞处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减少菌的繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减少菌的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代

44、谢作用。因此低境条件都有抑制微生物的代谢作用。因此低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。菌种的管理菌种的管理v1、实验用菌、毒种的申购，应有科室负责人实验用菌、毒种的申购，应有科室负责人签字。申购单应注明菌种名、菌号、数量及签字。申购单应注明菌种名、菌号、数量及请购单位盖章。请购单位盖章。v2 2、菌种应有专人保管，管理人员应具有较强、菌种应有专人保管，管理人员应具有较强的责任心。从指定单位购到的菌毒种，应有的责任心。从指定单位购到的菌毒种，应有登记。一一核对菌种、菌号、数量，无误后登记。一一核对菌种、菌号、数量，无误后方可转种。方可转种。v3 3、

45、用适宜培养基将冻干菌种稀释、转种、培、用适宜培养基将冻干菌种稀释、转种、培养。该菌种经鉴定无误后可作为对照菌用。养。该菌种经鉴定无误后可作为对照菌用。如发现菌株特性不符，不得使用。如发现菌株特性不符，不得使用。菌种的管理菌种的管理v4 4、 试验用菌种在使用过程中，应检查其生试验用菌种在使用过程中，应检查其生物学特性。如有变异或污染杂菌，均不得使物学特性。如有变异或污染杂菌，均不得使用。发现染菌用。发现染菌 或变异、衰退等现象时，应及或变异、衰退等现象时，应及时恢复或废弃。时恢复或废弃。v5 5 、试验菌种不得任意带出实验室。外单位、试验菌种不得任意带出实验室。外单位索取菌种时，应经领导同意，

46、包装严密，妥索取菌种时，应经领导同意，包装严密，妥善携带。善携带。 菌种保藏菌种保藏v菌种的保藏是微生物检验工作中的一项常规菌种的保藏是微生物检验工作中的一项常规技术，科学的保藏和管理直接关系到检验结技术，科学的保藏和管理直接关系到检验结果的正确与否。果的正确与否。v不同微生物根据其特征选择最适宜的保藏方不同微生物根据其特征选择最适宜的保藏方法，菌种保藏方法一般分四个阶段（法，菌种保藏方法一般分四个阶段（1 1）挑选）挑选特征典型的纯菌菌落。（特征典型的纯菌菌落。（2 2）能产生孢子或芽）能产生孢子或芽孢的微生物应用孢子和芽孢进行保存。（孢的微生物应用孢子和芽孢进行保存。（3 3）选择最适宜的

47、方法保藏。（选择最适宜的方法保藏。（4 4）定期对保藏菌）定期对保藏菌种进行检查。种进行检查。标准菌株的储备标准菌株的储备v标准菌株在实验室经过一次传代获得的一组标准菌株在实验室经过一次传代获得的一组完全相同的菌株。完全相同的菌株。v传代菌株应当完全具备标准菌株的所有性状。传代菌株应当完全具备标准菌株的所有性状。v传代时要保证一定的量，以减少传代的次数传代时要保证一定的量，以减少传代的次数v每株菌株尽量避免多次使用。每株菌株尽量避免多次使用。v采用不同的保存方法保存期限不同（如斜面采用不同的保存方法保存期限不同（如斜面保存法、穿刺法，液体石蜡法等保存期限的保存法、穿刺法，液体石蜡法等保存期限的

48、长短都不一样）。长短都不一样）。常用菌种的保藏方法常用菌种的保藏方法v菌种保藏方法有多种，如琼脂斜面低温保藏菌种保藏方法有多种，如琼脂斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、干燥（沙土）保藏法、法、液体石蜡保藏法、干燥（沙土）保藏法、玻璃珠保藏法、冷冻真空保藏法、超低温保玻璃珠保藏法、冷冻真空保藏法、超低温保藏法、液氮保藏法等。但对不同的微生物应藏法、液氮保藏法等。但对不同的微生物应通过保藏试验来选择最适宜的保藏方法。通过保藏试验来选择最适宜的保藏方法。v注意事项注意事项: :保藏的菌种均应是新鲜纯菌培养物保藏的菌种均应是新鲜纯菌培养物, ,至少应是第三代的培养物。不同细菌用不同至少应是第三代的培养物

49、。不同细菌用不同培养基，定期检查菌种保存环境做好记录。培养基，定期检查菌种保存环境做好记录。v1 1、琼脂斜面低温保藏方法、琼脂斜面低温保藏方法 常用菌种的保藏方法常用菌种的保藏方法v2 2、半固体高层培养基穿刺培养、半固体高层培养基穿刺培养v3 3、液体石蜡覆盖保藏法：本法是用石蜡将培、液体石蜡覆盖保藏法：本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理、升化养物与空气隔绝，以降低菌种的生理、升化水平，延长菌种保藏时间。水平，延长菌种保藏时间。方法：选择优质液体石蜡，方法：选择优质液体石蜡，121121高压灭菌高压灭菌30min30min后在后在160160烘箱烘箱1 12h2h除去掉水分冷

50、却后除去掉水分冷却后备用。取经培养的高层半固体菌管加入液体备用。取经培养的高层半固体菌管加入液体石蜡，高出培养基面石蜡，高出培养基面1cm1cm为宜，放入为宜，放入4 4 保藏。保藏。可保存半年或一年。可保存半年或一年。常用菌种的保藏方法常用菌种的保藏方法v4 4、冷冻真空保藏法、冷冻真空保藏法v保护剂：有多种，多用脱脂牛奶。将牛奶煮沸、静保护剂：有多种，多用脱脂牛奶。将牛奶煮沸、静止、冷却除去上面一层脂肪，重复止、冷却除去上面一层脂肪，重复3 3次后用脱脂棉次后用脱脂棉过滤，灭菌。过滤，灭菌。v菌悬液制备：直接刮取用营养琼脂培养基培养的细菌悬液制备：直接刮取用营养琼脂培养基培养的细菌，悬浮于