荧光光谱课件.ppt

1、 生物物理学的内容生物物理学的内容分子生物物理学（分子生物物理学（Molecular Biophysics) 生物物理仪器与技术生物物理仪器与技术( Biophysical Instrumentation and Techniques)膜与细胞生物物理学膜与细胞生物物理学(Membrane and Cell Biophysics)理论生物物理学理论生物物理学(Theoretical Biophysics) 感官与神经生物物理学感官与神经生物物理学( Sensory and Neural Biophysics)自由基与电磁生物物理学自由基与电磁生物物理学荧光分光光度术荧光分光光度术Spectro

2、photofluorimetry一、荧光的发现一、荧光的发现 二、荧光与荧光光谱二、荧光与荧光光谱 三、三、荧光光谱仪荧光光谱仪及主要谱参量及主要谱参量四、荧光生色团的结构特点四、荧光生色团的结构特点五、五、影响荧光测量的因素影响荧光测量的因素六、荧光技术在生物学、医学研究中的应用六、荧光技术在生物学、医学研究中的应用荧光分光光度术荧光分光光度术夜明珠发光成因夜明珠发光成因 1、矿物的发光性、矿物的发光性 矿物在外来的能量激发下，产生可见光的性质称为矿物的发光性。外来的能量有日光、紫外线、X射线、阴极射线、加热、加压、摩擦等。根据其发光的性质不同，分为荧光和磷光二类。 2、矿物的发光机理、矿物

3、的发光机理 矿物的发光是矿物能量的一种转换过程，物体受激发吸收能量而跃迁至激发态（非稳定态）在反回到基态的过程中，以光的形式放出能量。一一 荧光的发现荧光的发现 1575：N.Monardes Lignum Nephriticum1852：Stokes 分光计 植物抽提液、矿物、夜明珠、叶绿素、奎宁 借用萤石的（借用萤石的（Fluospar）发光现象而推演，）发光现象而推演，荧光荧光 Fluorescence1867年年：Goppelsroder AL 与桑色素的配合测定与桑色素的配合测定AL 的含量1880：Liebeman 提出“荧光与化学结构关系”的经验法则 为荧光技术的开发应用拉开了序

4、幕（一） 荧光的产生（二）荧光光谱与吸收光谱二二 荧光与荧光光谱荧光与荧光光谱（一） 荧光的产生1 分子的能量状态分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：在光学分析中涉及的分子能量有： Eo=Ee+ Ev + Er Ee：价电子运动能：价电子运动能, electron Ev：原子在平衡位置附近的振动：原子在平衡位置附近的振动,vibration Er：分子绕其重心的转动能：分子绕其重心的转动能, rotation 其中，其中， Ee Ev Er（一） 荧光的产生2 分子的能级Energy Levels与跃迁Transition（二）荧光光谱与吸收光谱荧光分光光度术：荧光分光光度术： 又称荧

5、光光谱术，属于光谱技术中的一种发射光谱术。其原理是电磁波和物质作用后，物质首先吸收电磁波的能量，然后再重新发射电磁波。激发波段在100-800nm之间，相当于紫外与可见光波段。（一）荧光光谱仪（一）荧光光谱仪（二）荧光分光光度术中的参量（二）荧光分光光度术中的参量三 荧光光谱仪与主要参量（一）荧光光谱仪（一）荧光光谱仪吸收光谱仪光路图吸收光谱仪光路图荧光光谱仪光路图荧光光谱仪光路图氢灯的能量分布氢灯的能量分布氘灯的能量分布氘灯的能量分布氙灯（红线）和带有玻璃外套的汞灯的能量分布氙灯（红线）和带有玻璃外套的汞灯的能量分布1 激发光源激发光源 在紫外在紫外-可见光区，可供荧光激发用的光源很多包括：

6、钨灯，碘钨灯，可见光区，可供荧光激发用的光源很多包括：钨灯，碘钨灯，氢灯，氘灯，汞灯，氙灯等。主要根据光源稳定性和强度选择光源。氢灯，氘灯，汞灯，氙灯等。主要根据光源稳定性和强度选择光源。实践中常不选用强光源：实践中常不选用强光源：随着光强的增加，会同时导致散射光和热量的增多随着光强的增加，会同时导致散射光和热量的增多 强光源照射，容易使样品产生光化分解强光源照射，容易使样品产生光化分解 强光源需要的稳压稳流装置复杂而昂贵强光源需要的稳压稳流装置复杂而昂贵 产生大量臭氧，损害健康产生大量臭氧，损害健康 对于光源要注意以下几点对于光源要注意以下几点:（1）正负极不要接错。）正负极不要接错。（2）

7、 拿灯时，不要碰窗口，以免手上的油污经紫外照射后，难以清除。拿灯时，不要碰窗口，以免手上的油污经紫外照射后，难以清除。 应及时用无水乙醇擦干净。应及时用无水乙醇擦干净。（3） 灯有寿命，要节约使用。灯有寿命，要节约使用。（4） 启动间隔一般要大于半小时，待灯冷却后，在重新启动。启动间隔一般要大于半小时，待灯冷却后，在重新启动。 启动后要预热启动后要预热 半小时。半小时。（5） 不要用眼睛直视灯。不要用眼睛直视灯。2 样品池样品池在可见可用玻璃池，但紫外区一定要用石英池。在可见可用玻璃池，但紫外区一定要用石英池。（1）设置空白对照）设置空白对照 。 （2）清洗问题，关键是即时冲洗。）清洗问题，关

8、键是即时冲洗。自来水冲洗自来水冲洗SDS浸泡浸泡双蒸水冲洗双蒸水冲洗浓硝酸处理浓硝酸处理双蒸水冲洗双蒸水冲洗（二）荧光分光光度术中的参量（二）荧光分光光度术中的参量 exMaximum excitation wavelength em, max Maximum emission wavelengthA 荧光强度的定义：在一定激发波长荧光强度的定义：在一定激发波长(ex)作用下，发射的作用下，发射的 荧光强弱。荧光强弱。 F=Ia Ia=I0-I，I=I010-cL F = I0(1-10-cL ) 当当C很低时很低时F= I0cL ， 当当C较大时较大时F=I0 B =发射光子数发射光子数/吸

9、收光子数吸收光子数 2 荧光强度（fluorescence intensity, F, I ）与 量子产率（quantum yield, ）（二）荧光分光光度术中的参量（二）荧光分光光度术中的参量荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系3 荧光偏振荧光偏振( fluorescence polarization)（二）荧光分光光度术中的参量（二）荧光分光光度术中的参量自然光自然光 部分偏振光部分偏振光 偏振光偏振光I/-I I/+I P=I/-I I/+2I A=荧光偏振度荧光偏振度Fluorescence polarization -p 荧光各向异性荧光各向异性Fluorescence ani

10、sotropy - A(1) 荧光偏振度的物理意义：荧光偏振度的物理意义：A ：I/=I ，P=0，自然光，荧光分子运动很快，自然光，荧光分子运动很快，取取 向随机。（稀溶液）向随机。（稀溶液）B：I/或或I 为为0 ，P=1 偏振光，荧光分子运动很偏振光，荧光分子运动很慢，取向有序。慢，取向有序。C： I/ I 0 ，0P1，生物大分子的荧光属于，生物大分子的荧光属于这种情况。这种情况。(2) 环境因素及分子运动对荧光偏振度的影响环境因素及分子运动对荧光偏振度的影响 A .温度的影响：温度的影响：溶液粘度溶液粘度 A：温度的影响：温度的影响 温度升高，温度升高，P降低降低 B：溶液粘度：溶液

11、粘度 粘度升高，粘度升高，P升高升高C：分子的运动：分子的运动转动转动旋转弛豫时间旋转弛豫时间rotational relaxation time （二）荧光分光光度术中的参量（二）荧光分光光度术中的参量4 荧光寿命荧光寿命 （Fluorescence liftime - ） 荧光衰减为原来激发时最大荧光强度的荧光衰减为原来激发时最大荧光强度的1/e所需要的时间所需要的时间I=I0e-kt , =1/k 分子所处的环境分子所处的环境有无淬灭有无淬灭有无能量转移有无能量转移有无分子间相互作用有无分子间相互作用影响因素影响因素5 荧光探剂荧光探剂(1)具有环状共轭双键即具有环状共轭双键即电子系统电

12、子系统(2)量子产率随环境变化，而且变化很大量子产率随环境变化，而且变化很大 (3) 能产生稳定荧光的小分子能产生稳定荧光的小分子 藻胆蛋白藻胆蛋白phycobiliprotein 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白Green Fluorescent Protein (4) 与研究对象的特定基团共价结合或与蛋白质非共价与研究对象的特定基团共价结合或与蛋白质非共价 结合结合（5）荧光探针的应用分类 测定细胞活性的荧光探针：活细胞探针和死细胞探针 膜荧光探针：荧光基团标记的磷脂，阴离子膜探针，阳离子膜探针， 其它非极性和双亲性膜探针。细胞器荧光探针：线粒体探针，溶酶体、酵母菌液泡和其它酸性细胞器的探针 Ca

13、2， Mg2， Zn2 ，Na， K， Cl等离子荧光探针 pH荧光探针: 近中性pH应用的探针，酸性，探针交联物 活性氧和一氧化氮探针 信号转导探针：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸结合蛋白探针 入胞作用、受体和离子通道探针pH 细胞形态和流体测量的荧光示踪剂 细胞骨架蛋白荧光探针 四四 荧光生色团的结构特点荧光生色团的结构特点1 天然荧光生色团的结构特点天然荧光生色团的结构特点（1）碳原子骨架：）碳原子骨架： 分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环 任何有利于提高任何有利于提高电子共轭度的结构改变，都将提高电子共轭度的结构改变，都将提高 荧光效率。

14、荧光效率。 例如：对苯基化，间苯基化等。例如：对苯基化，间苯基化等。 （2）分子的几何排布：）分子的几何排布： 具有刚性平面结构具有刚性平面结构 COOCOOHHOHHCOCOOHHO 荧光素荧光素酚酞酚酞四四 荧光生色团的结构特点荧光生色团的结构特点（4）取代基的位置：）取代基的位置： 邻位、对位邻位、对位荧光增强，间位荧光增强，间位荧光减弱（荧光减弱（-CN基例基例 外）外）(5)环境、溶剂、温度及环境、溶剂、温度及pH等均会影响分子结构，从而影等均会影响分子结构，从而影响荧光响荧光四四 荧光生色团的结构特点荧光生色团的结构特点（3）取代基的类型：）取代基的类型： （1）加强荧光的基团：给

15、电子取代基，）加强荧光的基团：给电子取代基， -NH2, -NHR, -OH,-OR, -CN,-OCH3,-OC2H5 （2）减弱荧光的基团：得电子取代基，）减弱荧光的基团：得电子取代基， -CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I （3）影响不明显的基团：）影响不明显的基团：-R,-SO3H,-NH32 蛋白质和核酸中的荧光生色团蛋白质和核酸中的荧光生色团Tryptophan(W, Trp)Phenylalanine(F, Phe)Tyrosine(Y, Tyr)四四 荧光生色团的结构特点荧光生色团的结构特点生色团生色团条件条件 exnm max

16、10-3 emnm F Fns敏感度敏感度 max F 10-2TrpH2O,pH72805.63480.22.611TyrH2O,pH72741.43030.13.61.4PheH2O,pH72570.22820.046.40.08Y-base Yeas t-RNAPhe3201.34600.076.30.91亚硝基奈酚+Tyr茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Phe ex:460nm, em:570nm ex:365nm, em:515nm四四 荧光生色团的结构特点荧光生色团的结构特点 五 影响荧光测量的因素1 光化分解（photodissociation） 光照后导致化学键断裂荧光减弱2

17、淬灭(quenching)(1)温度淬灭： 温度每升高温度每升高10C ，荧光减少的百分比，称为温度系数。，荧光减少的百分比，称为温度系数。 在在20-300C的范围内，温度系数大约为的范围内，温度系数大约为1.5。(1)浓度淬灭： 21 内滤光效应（inner filter effect)(3)杂质淬灭：3O2 1O23 溶液溶液pH的影响的影响利用一些物质在不同利用一些物质在不同pH值溶液中荧光强度和颜色的改变，值溶液中荧光强度和颜色的改变， 可以判别各种滴定的终点。可以判别各种滴定的终点。指示剂指示剂颜色变化颜色变化pH范围范围萘萘 酚酚无色变黄绿无色变黄绿8.2-10.3荧光素荧光素浅

18、绿变绿浅绿变绿4.0-5.0丫啶橙丫啶橙浅黄绿变黄浅黄绿变黄8.0-10.04 溶液极性的影响溶液极性的影响荧光物质在非极性溶液中的发射峰位比其在极性溶液中的峰位向短波方向荧光物质在非极性溶液中的发射峰位比其在极性溶液中的峰位向短波方向（或高频方向）移动，即蓝移，同时荧光强度前者也高于后者。（或高频方向）移动，即蓝移，同时荧光强度前者也高于后者。DPH水溶液中水溶液中膜膜 中中发射波长：发射波长：440nm发射波长：发射波长：430nm5 溶剂和化学试剂溶剂和化学试剂(1) 溶剂选择要适宜溶剂选择要适宜 例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。(2) 溶剂要纯溶

19、剂要纯6 荧光污染荧光污染(1) 涂活塞用的润滑油以及橡皮塞和软木塞涂活塞用的润滑油以及橡皮塞和软木塞(2) 去污剂去污剂(3) 微生物污染微生物污染(4) 滤纸滤纸六 荧光分光光度术的应用(一）一）.物质的检测物质的检测 1 测量原理：测量原理： 稀溶液，稀溶液， F= I0cL 2 结构特点：含有结构特点：含有“芳香环芳香环”结构结构 3 灵敏度：灵敏度：10-710-8g/ml检测物质激发波长nm发射波长nm维生素A345490维生素B2，pH7370565维生素B12， pH7275305维生素C4905303,4-苯并芘10-6g/ml3814035羟色胺，中性或弱酸性2953305

20、羟色胺，盐酸295550，330研究生物大分子构象 （二）蛋白质的荧光分析蛋白质的荧光分析1 蛋白质的内源荧光蛋白质的内源荧光2 蛋白质的外源荧光蛋白质的外源荧光（三）核酸的荧光分析（三）核酸的荧光分析嘌呤及衍生物嘌呤及衍生物室温，用紫外和可见光照射，中性水溶液中，均无荧光。室温，用紫外和可见光照射，中性水溶液中，均无荧光。酸性介质中，腺嘌呤和鸟嘌呤有荧光。酸性介质中，腺嘌呤和鸟嘌呤有荧光。碱性介质中，鸟嘌呤有荧光碱性介质中，鸟嘌呤有荧光嘧啶及衍生物嘧啶及衍生物游离的胸腺嘧啶有自发荧光，但量子产率极低游离的胸腺嘧啶有自发荧光，但量子产率极低0.00153 核酸的荧光标记核酸的荧光标记Probe

21、s ex emNoteEthidium Bromide545610非透膜，非透膜，RNA,DNAPropidium Iodine530615PO-PRO-1 iodine435455Acridine Orange490590透膜，透膜，RNA,DNAPyronin Y545580Bisbenzimide345460透膜，透膜，DNA（四）（四） 利用荧光技术检测分子间结合程度利用荧光技术检测分子间结合程度1 用荧光偏振用荧光偏振变化变化检测结合程度检测结合程度当一些小分子，如辅酶、辅基、半抗原等与特异蛋白质反应时，改变当一些小分子，如辅酶、辅基、半抗原等与特异蛋白质反应时，改变其荧光特性（强度

22、与偏振），通过这些参数的变化，可以了解他们结其荧光特性（强度与偏振），通过这些参数的变化，可以了解他们结合时的信息。合时的信息。结合后的大分子驰豫时间长，荧光偏振就大。结合后的大分子驰豫时间长，荧光偏振就大。用杀鼠灵滴定HSA Scatchard图r = L Ka (n - r) L = L0 LP = L0 rP0ex=320nm em=400nm2 用荧光强度变化检测结合程度用荧光强度变化检测结合程度（五） 大分子内基团间或分子间距离的测定荧光共振能量转移荧光共振能量转移( Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)荧光共振能量转移的三个条件

23、：荧光共振能量转移的三个条件：供体和受体都能发光供体的发射谱和受体的激发谱必须有部分重叠供体和受体的距离必须小于100Forster 公式E= R06/(R6+R06)R0: 临界距离，E：转移效率，R：基团间距离E= 1- IDA/ID IDA: 受体存在时的荧光强度，ID：受体不存在时的荧光强度 大分子内基团间或分子间距离的测定1 膜流动性 DPH ：P值小，流动性高 2-AS，6-AS，9-AS，12-AS高2 膜渗漏性 羧基荧光素( selfquenching) 3 膜电位的测量Nernst公式：E(mV)=59log(KO+/KI+) KO+：细胞外浓度， KI+：细胞内浓度 荧光探

24、剂：花菁（cyanine) K+载体：缬氨霉素： （六） 膜生物物理研究4 膜融合机理的研究方法一 ：利用能量共振转移现象II方法二：利用淬灭现象1/25 膜成分扩散速度的测定荧光漂白恢复技术fluorescence recovery after photobleaching，FRAPD：扩散系数，：光斑半径， 1/2：漂白后的荧光值恢复到稳定值的一半所需时间， rD：与光斑形状有关的一个常数。常用探剂：标记脂类DiI 标记蛋白异硫氰荧光素（FITC），蕊香红（rhodamine）D=241/2rD（七） 荧光技术与其它技术的结合 1 显微荧光光度术 对细胞内的不同成分进行定性定位或定量 2

25、流式细胞术荧光，激光和计算机结合 3 激光扫描共聚焦显微镜 FRAP 4光镊（optical tweezers)Fluo-3/Ca2+，AM, ex=506nm, em=526nm 思考题1 荧光产生的机理是什么？2 荧光技术研究的生物学样品的主要参数有哪些？量子产率与荧光强度的区别及关系是什么？ 荧光偏振的意义是什么？3 举例说明荧光技术的应用？ 4.如果婴幼儿体内缺乏使苯丙氨酸转变为如果婴幼儿体内缺乏使苯丙氨酸转变为酪氨酸的酶时，则苯丙氨酸的含量异常增酪氨酸的酶时，则苯丙氨酸的含量异常增大而患大而患“苯丙酮尿症苯丙酮尿症”且易引起智力低下，且易引起智力低下，所以，对婴幼儿的该项体查极为重要

26、，但所以，对婴幼儿的该项体查极为重要，但是，由于血液蛋白质中其它芳香氨基酸的是，由于血液蛋白质中其它芳香氨基酸的影响而难以测出苯丙氨酸的含量，请用本影响而难以测出苯丙氨酸的含量，请用本课程所学内容提出一个检测方案。课程所学内容提出一个检测方案。参考资料1.赵南明，周海梦，生物物理学，北京：高等教育出版赵南明，周海梦，生物物理学，北京：高等教育出版 社，海德堡：社，海德堡：施普林格出版社，施普林格出版社，20002.林克椿，生物物理技术林克椿，生物物理技术波谱技术及其在生物学中的应用，北京：波谱技术及其在生物学中的应用，北京：高等教育出版社，高等教育出版社，19893.林克椿，吴本玠，医学生物物理学，北京医科大学。北京大学医林克椿，吴本玠，医学生物物理学，北京医科大学。北京大学医学出版社，学出版社，20044.李楠，王凤翔，周春喜，荧光探针应用技术，北京：军事医学科李楠，王凤翔，周春喜，荧光探针应用技术，北京：军事医学科学出版社，学出版社，19985.Pattabhi Vasantha, Gautham N. Biophysics, Pangbourne: Alpha Science, c2002.