结核病实验室诊断技术新进展52页PPT课件.ppt

1、1主要内容主要内容22一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法33一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法培养on plates or in broth identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colony显微镜检查脱色复染染色unstained or stained with e.g. Gram stain 44一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法5677一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法88 二、二、 新诊断技术和方法

2、新诊断技术和方法99二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法1 1、细菌学检查、细菌学检查 发光二极管发光二极管（ （LEDLED） ）荧光显微镜荧光显微镜光源寿命光源寿命长长（30,000h30,000h）不不需要预热需要预热不需要不需要暗室暗室可用现有的显微镜可用现有的显微镜可使用可使用电池电源电池电源与与通常通常荧光显微镜的荧光显微镜的判定一判定一致率致率98.0%98.0%两种方法观察结果两种方法观察结果二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法中盖项目中盖项目LED评估结果评估结果中盖项目中盖项目LED评估结果评估结果13 13二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法 单核细胞分

3、离单核细胞分离TBTB抗原刺激，抗原刺激，IFN-IFN- 释放释放与标记的二抗结合与标记的二抗结合 酶作用标记物显色酶作用标记物显色每一斑点代表释放每一斑点代表释放 IFN- IFN- 的的一个一个细胞细胞Y Y Y YY Y Y YY Y Y YYYYYY Y Y YYYYYIFN-抗原抗原一抗捕获一抗捕获IFN-IFN- 2 2、免疫学方法：、免疫学方法： - -干扰素释放实验干扰素释放实验BCG进化过程进化过程15 15二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法分子生物学分子生物学 LAMP( LAMP( 等温扩增等温扩增) )LPA( LPA( 线性探针线性探针) )Genechip

4、(Genechip(基因芯片基因芯片) )GeneXpert( GeneXpert( 多色巢式定量多色巢式定量PCR)PCR)分子分型技术分子分型技术16 16二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（1 1）环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)：Eiken,Japan 可同时检测可同时检测患者是否感染结核患者是否感染结核 所用仪器设备极其简单所用仪器设备极其简单 63 63 扩增（避免非特异性扩增扩增（避免非特异性扩增 多对引物（提高特异性和速度）：靶基因多对引物（提高特异性和速度）：靶基因6 6个

5、不同区域，设计个不同区域，设计4 4种引物种引物 对对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 密闭密闭系统系统( (没有污染的风险）没有污染的风险） 快速，快速，两小时两小时内即可得到检测结果，内即可得到检测结果， 肉眼观察肉眼观察 17 17二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（1 1）环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)临床标本临床标本（咯痰咯痰等）等）DNADNA提取提取基因扩增基因扩增基因检出基因检出标本处理标本处理Extraction solutio

6、n 1 and 210min ,1001min ,2000gSupernatant，capture DNAReconstitute reaction mix40min ,67LAMP amplificationPCR LAMP 需要使用需要使用PCRPCR扩增仪扩增仪 设计特异性的两条引物设计特异性的两条引物 扩增效率扩增效率:1:10 07 7 不需要使用不需要使用PCRPCR扩增仪扩增仪 多对引物保证扩增的特异性多对引物保证扩增的特异性 扩增效率扩增效率: :10101010二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（1 1）环介导等温扩增技术）环介导等温扩增技术( (Loop media

7、ted isothermal amplification ，LAMP)1819 19二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3 3、分子生物学、分子生物学（2） 线性探针检测技术线性探针检测技术（LPA）可进行结核杆菌复合群的鉴定可用于MDR-TB高危人群的筛查对利福平的抗药性(通过检测rpoB基因的最常见突变)对异烟肼的抗药性(通过检测katG基因和inhA基因的最常见突变)检测的样本可以是纯培养物或是涂片阳性的痰标本内部控制保证了结果的正确可以获得商品化的试剂盒约五小时内即可得到检测结果需要配备生物安全柜的生物安全二级实验室需要至少三间房子Who policy statement， Ju

8、ne 201920 20二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3 3、分子生物学、分子生物学（2） 线性探针检测技术线性探针检测技术（LPA）耐药分子诊断的基本原理耐药分子诊断的基本原理21 21DNADNA提取提取标本标本 固体或液体培养基培养的菌种固体或液体培养基培养的菌种 抗酸染色涂片阳性标本抗酸染色涂片阳性标本方法方法 超声波裂解超声波裂解 GenoLyse试剂盒试剂盒0.50.51 1 h h22 22 PCRPCR扩增扩增不同标本不同标本, ,扩增参数不同扩增参数不同 培养菌种：扩增培养菌种：扩增2020个循环个循环 涂阳标本：扩增涂阳标本：扩增3030个循环个循环引物：生物素

9、标记引物：生物素标记多重多重PCRPCR扩增扩增2.5 2.5 3h3h23 23 杂杂 交交采用反向杂交法采用反向杂交法: :PCRPCR扩增产物扩增产物变性（变性（DNADNA成单链）成单链）与线性与线性探针杂交探针杂交洗涤洗涤显色显色判断结果判断结果1 1 2h2h24 24结果判读结果判读0.5h0.5h中盖项目线性探针检测利福平评价中盖项目线性探针检测利福平评价WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2019通过系统评估和通过系统评估和META分析（和分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本RIP ：敏感性：敏感性97%，

10、特异性特异性99%中盖项目线性探针检测异烟肼评价中盖项目线性探针检测异烟肼评价WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2019通过系统评估和通过系统评估和META分析（和分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本INH：敏感性：敏感性90%， 特异性特异性99%中盖项目线性探针检测中盖项目线性探针检测MDR评价评价WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2019通过系统评估和通过系统评估和META分析（和分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本MDR-TB检测准确性：检测准确性

11、：99%。28WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2019基因芯片基因芯片二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（3 3）Genechip(Genechip(基因芯片基因芯片) )29检测过程检测过程杂交反应杂交清洗清洗干燥扫描检测数据分析检测分析PCR扩增DNA 提取样品制备二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（3 3）Genechip(Genechip(基因芯片基因芯片) )30芯片结果图例芯片结果图例二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（3 3）Genechip(Genechip(基因芯片基因芯片) )3132 32二、二、 新诊断技术和方法新诊断技

12、术和方法（3 3）Genechip(Genechip(基因芯片基因芯片) ) 结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书获国家医疗器械证书和欧盟CE认证样品制备仪样品制备仪 杂交仪杂交仪n 通通 量：两个一线抗结核药量：两个一线抗结核药n 速速 度：度： 6 6 小时（比传统药敏试验法快小时（比传统药敏试验法快 50-100 50-100 倍）倍）n 灵敏度：灵敏度：10103 3 CFU/ CFU/反应反应n 特异性：对照设计严谨；自动判读特异性：对照设计严谨；自动判读基于基于rpoB/katG/inhArpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分

13、离株或者痰样本中的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。软件判读软件判读激光共焦扫描仪激光共焦扫描仪International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3）二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（4 4）GeneXpert( GeneXpert( 多色巢式定量多色巢式定量PCR)PCR)检测技术检测技术33二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（4 4）GeneXpert( GeneXpert( 多色巢式定量多色巢

14、式定量PCR)PCR)检测技术检测技术34二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（4 4）GeneXpert( GeneXpert( 多色巢式定量多色巢式定量PCR)PCR)检测技术检测技术35基于核酸扩增的一步法利福平耐药检测基于核酸扩增的一步法利福平耐药检测Xpert TM MTB/Rif技术平台技术平台 利福平的耐药性分析 喹诺酮类药物耐药性 HIV 病毒载量分析自动化得标本处理和检测，自动化得标本处理和检测，可以在可以在2小时内出结果小时内出结果二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（4 4）GeneXpert( GeneXpert( 多色巢式定量多色巢式定量PCR)PCR)检

15、测技术检测技术37 37 结核分枝杆菌菌株水平鉴定最早采用生化分析、血清学结核分枝杆菌菌株水平鉴定最早采用生化分析、血清学技术和噬菌体分型等技术进行分析，但由于这些方法的局限技术和噬菌体分型等技术进行分析，但由于这些方法的局限性而未得到广泛应用。性而未得到广泛应用。 基于核酸基础上的分子流行病学研究技术是对结核病等基于核酸基础上的分子流行病学研究技术是对结核病等感染性疾病进行检测的一个强有力的手段，可以进行结核菌感染性疾病进行检测的一个强有力的手段，可以进行结核菌传播的研究，结核病实验室交叉污染的研究，判断结核再感传播的研究，结核病实验室交叉污染的研究，判断结核再感染或复发以及国际间传播的研究

16、。染或复发以及国际间传播的研究。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（5 5）分子分型技术）分子分型技术38 38 简单介绍以下三种分型技术：简单介绍以下三种分型技术：（1 1）插入序列）插入序列 6110 6110 限制性片段长度多态性分析：限制性片段长度多态性分析：IS6110IS6110（2 2）直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：间隔寡核苷酸分）直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：间隔寡核苷酸分 型型( spacer oligonucleotide typing ,Spoligotyping)( spacer oligonucleotide typing ,Spoligotyping

17、)（3 3）分枝杆菌分散重复单元）分枝杆菌分散重复单元- -可变数目串联重复序列：可变数目串联重复序列： (mycobacterial interspersed repetitive units-variable (mycobacterial interspersed repetitive units-variable number tandem repeats, MIRU-VNTR)number tandem repeats, MIRU-VNTR)二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3 3、分子生物学、分子生物学（5 5）分子分型技术）分子分型技术39 39插入序列插入序列 6110

18、6110 限制性片段长度多态性分限制性片段长度多态性分析：析： IS6110 IS6110是一个是一个只存在于结核分枝杆只存在于结核分枝杆菌复合群菌复合群基因组中的插入序列，长度为基因组中的插入序列，长度为1355bp1355bp，具有高度的保守性，属于，具有高度的保守性，属于IS3IS3家家族。族。不同结核菌株不同结核菌株IS6110IS6110的数目和位置不的数目和位置不同同。在。在IS6110IS6110序列中，限制性内切酶序列中，限制性内切酶PvuIIPvuII的酶切位点只有一个，经酶切后产的酶切位点只有一个，经酶切后产生大小两个不同的片段，再与只针对酶切生大小两个不同的片段，再与只针

19、对酶切位点右侧的位点右侧的245bp245bp探针杂交，则杂交后产探针杂交，则杂交后产生的条带数即为菌株生的条带数即为菌株IS6110IS6110拷贝数。拷贝数。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（5 5）分子分型技术）分子分型技术40 40插入序列插入序列 6110 6110 限制性片段长度多态性分析：限制性片段长度多态性分析：IS6110IS6110这种方法存在一定的缺陷：这种方法存在一定的缺陷：对于基因组中对于基因组中IS6110IS6110低拷贝低拷贝66或缺陷的分辨能力有限；或缺陷的分辨能力有限；需要大量的基因组需要大量的基因组DNADNA，操作步骤繁琐且工作量大；，操作步骤

20、繁琐且工作量大；各实验室所采用的各实验室所采用的IS6110-RFLPIS6110-RFLP分型方法的标准不统一，不分型方法的标准不统一，不同实验室的同实验室的IS6110-RFLPIS6110-RFLP分型结果难于进行比对。分型结果难于进行比对。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（5 5）分子分型技术）分子分型技术41 41直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：直接重复片段及寡核苷酸多态性分型： 基于直接重复区（基于直接重复区（RDRD区）的多态性。区）的多态性。DRDR区只出现于结核分枝杆菌复合群中。由区只出现于结核分枝杆菌复合群中。由若干个保守的长为若干个保守的长为36bp36bp的

21、直接重复序列的直接重复序列组组成，并被非重复序列即成，并被非重复序列即间隔区分开间隔区分开。每隔。每隔间隔区序列长为间隔区序列长为34-41bp34-41bp。通常。通常间隔区的间隔区的顺序在所有菌株都是相同的，但可能发生顺序在所有菌株都是相同的，但可能发生某一间隔区的插入或缺失，某一间隔区的插入或缺失，因此利用因此利用SpoligotypingSpoligotyping就可以对结核分支杆菌进就可以对结核分支杆菌进行株水平的鉴定。行株水平的鉴定。 可以区分结核分枝杆菌复合群和可以区分结核分枝杆菌复合群和M.bovisM.bovis以及以及M.bovis BCGM.bovis BCG二、二、 新

22、诊断技术和方法新诊断技术和方法（5 5）分子分型技术）分子分型技术42 42直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：SpoligotypingSpoligotyping该方法该方法对菌株的分辨能力明显弱于对菌株的分辨能力明显弱于IS6110IS6110一一RFLPRFLP方法，特方法，特别是不能有效分辨北京家族菌株，而在我国目前流行的结核别是不能有效分辨北京家族菌株，而在我国目前流行的结核菌株中，大约菌株中，大约50%50%属于北京家族属于北京家族；同时与其他方法相比有高估菌株间流行病学联系的倾向。同时与其他方法相比有高估菌株间流行病学联系的倾向。二、二、 新诊断技

23、术和方法新诊断技术和方法3 3、分子生物学、分子生物学43 43可变数目串联重复序列：可变数目串联重复序列：MIRU-VNTRMIRU-VNTR 该技术是近年发展起来的以该技术是近年发展起来的以PCRPCR为基为基础的分型技术。础的分型技术。MIRUMIRU为为40-100bp40-100bp的的DNADNA元元件件，通常以串联重复形式散步于结核分，通常以串联重复形式散步于结核分枝杆菌复合群基因中。枝杆菌复合群基因中。H37RvH37Rv基因组中含基因组中含4141个个MIRUMIRU区区，其中有，其中有1212个区具有多态性个区具有多态性，其拷贝数在不同菌株之间其拷贝数在不同菌株之间1212

24、个区拷贝数个区拷贝数在在不同菌株之间存在差异不同菌株之间存在差异。MIRUMIRU技术利技术利用不同菌株之间这用不同菌株之间这1212个区拷贝数的差异个区拷贝数的差异达到鉴定菌株的目的。达到鉴定菌株的目的。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3 3、分子生物学、分子生物学44 44可变数目串联重复序列：可变数目串联重复序列：MIRU-VNTRMIRU-VNTR 该方法操作简单该方法操作简单 , ,分辨率高分辨率高 , ,结果容易分析结果容易分析 , ,具有很高的具有很高的可重复性可重复性 , ,在实验室内和实验室间具有非常好的可比性在实验室内和实验室间具有非常好的可比性 , ,并并能提供

25、数字化的分型信息能提供数字化的分型信息 , ,适宜于进行大量样本和网络化分适宜于进行大量样本和网络化分析。析。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3 3、分子生物学、分子生物学（5 5）分子分型技术）分子分型技术45 45 DNA DNA测序法被认为是检测变异的测序法被认为是检测变异的“金标准金标准”，可检测出待，可检测出待检基因上的所有突变位置和突变情况。已用于检基因上的所有突变位置和突变情况。已用于RFPRFP、INHINH、PZAPZA、EMBEMB等耐药基因的检测。等耐药基因的检测。 缺陷：专业设备，专业技术，限制其广泛应用。缺陷：专业设备，专业技术，限制其广泛应用。二、二、 新

26、诊断技术和方法新诊断技术和方法4 4、其他、其他（1 1）DNADNA测序法测序法46 46在应用某项新技术时，需要考虑的一般性问题：在应用某项新技术时，需要考虑的一般性问题：是否有足够的经过培训的人员是否有足够的经过培训的人员有效的实验室质量管理体制有效的实验室质量管理体制能否得到备用设备和耗材能否得到备用设备和耗材技术支持的可获得程度技术支持的可获得程度工作环境的条件工作环境的条件 等等等等 二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法未来实验室的诊断模式 需要需要8-108-10周时间周时间 需要需要4 4天时间天时间患者标本患者标本分子方法分子方法传统方法传统方法菌种鉴定菌种鉴定药敏试验

27、药敏试验涂片涂片培养培养菌种鉴定和药敏试验菌种鉴定和药敏试验结核病实验室未来检测模式可疑结核病患者的标本涂片阳性或二者均阳性二者均阴性培养阳性基因分型复发再感染或流行规律研究快速药敏试验利福平耐药利福平敏感耐药风险评估临床治疗方案耐药风险评估临床治疗方案快速菌种鉴定涂片未来实验室的诊断模式 以病人为中心的实验室诊断技术平台固体培养固体培养 监测监测 应急处置应急处置 网络建设网络建设主要筛查耐药主要筛查耐药 诊断治疗诊断治疗 主动发现主动发现 被动的病人发现被动的病人发现 诊断治疗诊断治疗地市地市县区县区HIV/TB双重感染双重感染MDRTB/TB-MM省级省级萋尼萋尼 荧光荧光涂片检查涂片检查推荐耐药可疑者推荐耐药可疑者iLEDLAMP等等手动分子诊断手动分子诊断HIV/TB双重感染双重感染分子诊断分子诊断MDRTB/TB-MM固体培养固体培养分子诊断分子诊断LPA等等应急处置应急处置TB疫情监测疫情监测传统方法传统方法/ /新诊断技术新诊断技术确定治疗方案确定治疗方案50The End