经典免疫学技术精品PPT课件.pptx

1、免疫分析技术的发展多元免疫技术多元免疫技术免疫沉淀免疫沉淀免疫凝集免疫凝集补体结合反应补体结合反应中和反应中和反应免疫标记技术免疫标记技术经典免疫学方法经典免疫学方法化学发光化学发光胶体金胶体金酶免疫酶免疫免疫荧光免疫荧光放射免疫放射免疫PCR-免疫分析免疫分析时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析沉淀反应（沉淀反应（PrecipitationPrecipitation）凝集反应（凝集反应（ Agglutination Agglutination ）补体结合反应补体结合反应中和反应中和反应概念：概念：沉淀反应沉淀反应又称免疫沉淀反应免疫沉淀反应，是指可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体相应抗体在液相或凝胶

2、中特异性结合特异性结合后，形成的免疫复合物免疫复合物在一定条件下出现的蛋白质析出现象蛋白质析出现象。 A. Precipitation 原理：原理：蛋白质表面蛋白质表面极性分子极性分子水膜水膜沉淀沉淀 A. Precipitation 沉淀反应的类型沉淀反应的类型溶液中溶液中沉淀反应沉淀反应凝胶中凝胶中沉淀反应沉淀反应 絮凝沉淀试验，环状沉淀试验，免疫絮凝沉淀试验，环状沉淀试验，免疫比浊法，比浊法，免疫沉淀技术免疫沉淀技术，免疫共沉淀免疫共沉淀技术技术 单单( (双双) )向免疫扩散向免疫扩散，免疫电泳，对流免，免疫电泳，对流免疫电泳，火箭免疫电泳，交叉免疫电泳，疫电泳，火箭免疫电泳，交叉免疫

3、电泳，免疫固定电泳，免疫固定电泳，免疫印记技术免疫印记技术1. 溶液中的免疫沉淀反应Negative testPositive testUses fine particles of antigen to detect antibody in patients serum.1.1 絮凝试验 (Flocculation)抗原抗体比例是关键！稀释法、方阵滴定法。梅毒的检测1902年，Ascoli 建立。早期用途：兽类内脏、皮毛浸液等标本中的炭疽杆菌抗原。 1.2 环状沉淀试验 (ring precipitation test) 抗血清抗原37 与絮凝实验相比：与絮凝实验相比：减少了反应体积；提高了反

4、应灵敏度。可用于较少量的抗原检测，如血迹分析、病原昆虫的流行病学分析。 原理：抗原抗体充分反应后，所形成的絮状或颗粒抗原抗体复合物会增加反应体系的浊度。 特点：现代光学技术与自动分析技术相结合，提高了灵敏度和易操作性。 分类：透射比浊法、散射散射比浊法（灵敏度高）比浊法（灵敏度高） 1.3 免疫比浊法 (Immunoturbidimetry)YYY光线穿透待测溶液时，会受到抗原抗体复合物的作用而发生散射，散射光的强度与复合物的含量以及散射夹角成正比，因此可以通过测定散射光强度的变化来推测抗原抗体反应的情况。Light sourceDetector1. 反应动力学测定反应动力学测定2. 快速、敏

5、感、精确度高（快速、敏感、精确度高（ng）3. 仪器价格昂贵、对抗体要求高仪器价格昂贵、对抗体要求高 散射比浊法 (Nephelometry)利用抗原抗体的特异性结合作用，使靶蛋白（抗原）形利用抗原抗体的特异性结合作用，使靶蛋白（抗原）形成抗原抗体复合物并最终从溶液中沉淀出来成抗原抗体复合物并最终从溶液中沉淀出来。第一阶段改进：第一阶段改进：改变反应条件促进抗原抗体多聚物形成，使其更加容易沉淀。第二阶段改进：第二阶段改进：加入二抗，促进更大的抗原抗体网络形成。第三阶段（第三阶段（2020世纪世纪7070年代）改进：年代）改进：采用固相载体提高对靶蛋白的沉淀。细菌蛋白质A，细菌蛋白质G。1.4

6、免疫沉淀法 (immunoprecipitation )免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是利用抗体将相应蛋白沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子同时被沉淀出来。通过进一步与其他技术结合，如SDS-PAGE，Western blot 可以进一步对靶蛋白质进行分析。以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。1.5 免疫共沉淀法 (co- immunoprecipitation )相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，保持了蛋白质的天然活性；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。可能检

7、测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；如用western blot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。优点优点缺点缺点2. 凝胶中的免疫沉淀反应 2.1 单向免疫扩散 (Single Immunodiffusion) 凝胶中抗原或抗体其中之一保持相对静止，通过对应的抗原凝胶中抗原或抗体其中之一保持相对静止，通过对应的抗原或抗体分子的运动而在合适的位置上形成沉淀。可用于或抗体分子的运动而在合适的位置上形成沉淀。可用于抗原抗原或抗体的定量。或抗体的定量。 2.2 双向免疫

8、扩散 (Double Immunodiffusion/Ouchterlony Method)Testing performed in agar gel.Antigen is placed in one well. Antibody is place in other well.Each diffuses through gel.If antibody is specific to that antigen, a precipitin line will form where the 2 meet.Ag01/4Ab1/2Ab1/1Ab1/16Ab1/8Ab2.3 免疫电泳 (Immunoelec

9、trophoresis)琼脂平板电泳琼脂平板电泳+ +双向扩散双向扩散 2.4 火箭免疫电泳 (Rocket immunoelectrophoresis) 单向扩散单向扩散+ +水平琼脂电泳水平琼脂电泳pH条件：条件：抗体分子不带电荷，抗体分子不带电荷，抗原分子带负电荷。抗原分子带负电荷。 2.5 交叉免疫电泳 (Rocket immunoelectrophoresis)双向火箭电泳（电场方向垂直的两次电泳）双向火箭电泳（电场方向垂直的两次电泳）抗原根据不同迁移率分离抗原根据不同迁移率分离抗原抗体复合物形成火箭峰抗原抗体复合物形成火箭峰 2.6 免疫固定电泳 (Immunofixation E

10、lectrophoresis)与免疫电泳原理相同。电泳后直接将抗体加于蛋白质区带表面，形成的复合物嵌于固相支持物中。洗去游离的抗原抗体后，染色观察被固定的区带。 Anode Patient serum Cathode (+ electrode) (- electrode)Application pointWestern blotting (Immunoblotting) 1979，Rebart&Towbin - Identification of protein antigen following SDS-PAGE 2.7 免疫印记 (Immunoblotting)Western blotti

11、ngSDS-PAGEIFE （固免（固免） 高分辨率 操作简单 高特异性 高灵敏度1. Separate proteins by SDS PAGE2. Transfer proteins to membranes (i.e. Nitrocellulose)3. Block non-specific sites on membrane4. Incubate with primary antibody, wash5. Incubate with secondary antibody, wash6. Detect secondary antibody 2.7 免疫印记 (Immunoblotting

12、) 2.7 免疫印记 (Immunoblotting)颗粒型抗原颗粒型抗原或细胞型抗原细胞型抗原与相应抗体结合后，在有适当电解质存在下，抗原与抗体充分反应，相互聚集，形成肉眼可见肉眼可见的凝集块团。B. 凝集反应凝集反应 Agglutinogen 抗原性质，反应方式，实验目的抗原性质，反应方式，实验目的 - - - 直接凝集反应（直接凝集反应（Direct agglutinationDirect agglutination） - - 间接凝集反应（间接凝集反应（Indirect agglutination Indirect agglutination ） - - 血凝和血凝抑制反应血凝和血凝抑

13、制反应 （Inhibition of AgglutinationInhibition of Agglutination）细菌、螺旋体或红细胞与其相应抗体直接混合，经一定时间，形成细菌或红细胞凝集。Often performed at room temperature.May use centrifugation to bring antigen and antibody into closer proximity.某些病原菌感染的检测（伤寒、副伤寒）。Click on image at right wait for animation to begin. 1 直接凝集直接凝集Direct Ag

14、glutination载体种类载体种类：血细胞血细胞 聚苯乙烯胶乳颗粒（羧化）聚苯乙烯胶乳颗粒（羧化） 2 间接凝集间接凝集Passive Agglutination与直接凝集不同，间接凝集反应中的可溶性抗与直接凝集不同，间接凝集反应中的可溶性抗原或抗体需要吸附或偶联在一种原或抗体需要吸附或偶联在一种与免疫无关的与免疫无关的、具有一定大小的不溶性颗粒物的表面，使其成具有一定大小的不溶性颗粒物的表面，使其成为为致敏载体致敏载体。间接血凝试验，胶乳凝集试验，活性碳粒试验正向间接凝集反应，反向间接凝集反应 Antigens on a carrier molecule, such as latex,

15、combine with patients sample for antibody detection.Click on image above wait for animation to begin. 2.1 正向间接凝集正向间接凝集Forward Passive AgglutinationAntibody is bound to the carrier molecule, which is then mixed with patients sample to detect antigen.Click on image above wait for animation to begin. 2

16、.2 反向间接凝集试验 Reverse Passive Agglutination提高了单纯抗原抗体反应的灵敏度提高了单纯抗原抗体反应的灵敏度对微量抗原（真菌毒素）检测具有一定优势对微量抗原（真菌毒素）检测具有一定优势Antibody reagent is combined with patients specimen.If patients specimen contains the antigen for that antibody, they will react.Erythrocyte（红细胞） is added.A positive reaction will show no agg

17、lutination.A negative reaction shows agglutination between reagent antibodies and antigen.YYYYYY 3 血凝抑制反应 Inhibition of Agglutination+-含血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象！Jules Bordet（1870-1961）Discoverer of complement 19世纪末世纪末概念：概念：新鲜血液中含有的一种不耐热成分，可辅助和补充特异性抗体介导的免疫溶菌、溶血作用；特点：特点：补体的激活没有抗原抗体特异性；原理：原理：作为一种通用试

18、剂来检测反应体系中抗原抗体复合物的存在，并利用补体对红细胞的裂解作用，通过红细胞的变化可以很容易的对反应进行示踪。 C. 补体参与的抗原抗体反应补体参与的抗原抗体反应 补体结合试验原理补体结合试验原理受检系统受检系统指示系统指示系统溶血反应溶血反应补体结合试验补体结合试验1.仅有抗原或抗体补体红细胞溶血素阳性阳性阴性阴性2.抗原抗体反应红细胞溶血素阴性阴性阳性阳性抗原抗体补体抗原抗原/抗体抗体 D. 中和反应中和反应 中和试验是免疫学和病毒学中常用的一种抗原抗体反应试验方法，用以测定抗体中和病毒感染性或细菌毒素的生物学效应。凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体又称中和抗体。能与细菌外毒素结合，

19、中和其毒性作用的抗体称为抗毒素。中和试验可以在敏感动物体内(包括鸡胚)，体外组织(细胞)培养或试管内进行。观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡；能否抑制病毒的细胞病变效应或中和毒素对细胞的毒作用；以及测定抗体的其他生物学效应。p 经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量p Study Constantly, And You Will Know Everything. The More You Know, The More Powerful You Will Be写在最后谢谢你的到来学习并没有结束，希望大家继续努力Learning Is Not Over. I Hope You Will Continue To Work Hard演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日