T细胞研究的流式检测方案.ppt

1、Overview T细胞亚群的流式检测方法 Treg（调节性T细胞）-分化和功能 -鉴定分析指标和新指标 Th17细胞 -分化与功能 -检测方法 T细胞亚群的流式检测方法 Treg（调节性T细胞）-分化和功能 -鉴定分析指标和新指标 Th17细胞 -分化与功能 -检测方法OverviewT T细胞亚群细胞亚群T T细胞研究与疾病细胞研究与疾病Th1/Th17/Th22Th2/TregTh1/Th17/Th22Th2/TregT细胞亚群失衡细胞亚群失衡风湿性关节炎风湿性关节炎多发性硬化症多发性硬化症I型糖尿病型糖尿病红斑狼疮红斑狼疮 more diseases流式检测胞内细胞因子的方法学原理流式

2、检测胞内细胞因子的方法学原理1.激活免疫细胞(激活T细胞)；2.阻断胞内蛋白转运系统；3.增加细胞膜通透性；4.应用多色荧光标记抗细胞因子抗体；5.结合细胞表型测定胞内细胞因子。流式检测胞内细胞因子的方法学原理流式检测胞内细胞因子的方法学原理1.激活免疫细胞激活免疫细胞(激活激活T细胞细胞)静止的T、B细胞不产生或极低产生细胞因子 多数细胞因子必须在T细胞激活后才能分泌产生(诱导性)T细胞激活剂细胞激活剂 特异性抗原(结核杆菌抗原、病毒抗原)多克隆刺激剂(丝裂原：PHA、Con A、抗CD3单抗、抗CD28单抗)活化信号激活剂，如 PMA(佛波酯)、Ionomycin(离子霉素)流式检测胞内细

3、胞因子的方法学原理流式检测胞内细胞因子的方法学原理阻断剂：阻断剂：Monesin BD GolgiStop(cat no:554724,250 test)Brdfeldin A BD GolgiPlug (cat no:555029,250 test)2.阻断胞内蛋白转阻断胞内蛋白转运系统，使细胞因运系统，使细胞因子聚集在胞浆内子聚集在胞浆内流式检测胞内细胞因子的方法学原理流式检测胞内细胞因子的方法学原理3.增加细胞膜通透性，使抗细胞因子抗体进入胞内增加细胞膜通透性，使抗细胞因子抗体进入胞内应用方法：应用方法：1)预先固定，BD Lysing Buffer(cat no:555899)或者2%

4、多聚甲醛2)用细胞膜通透剂处理：BD 破膜剂(cat no:554714)4.应用多色荧光标记抗细胞因子单克隆抗体应用多色荧光标记抗细胞因子单克隆抗体流式检测胞内细胞因子的方法学原理流式检测胞内细胞因子的方法学原理5.同时测定细胞表型与胞内细胞因子同时测定细胞表型与胞内细胞因子例如：CD4和CD8+T细胞不同亚群的Th1/Th2/Th17/Treg细胞因子的检测。检测指标选择如下，抗CD3 抗CD8（不用抗CD4，CD4在PMA刺激后表达下调）抗IL-17 抗IFN-r 抗IL-4 抗Foxp3流式检测胞内细胞因子的方法学原理流式检测胞内细胞因子的方法学原理流式细胞仪检测胞内细胞因子的标准操作

5、程序流式细胞仪检测胞内细胞因子的标准操作程序1.细胞刺激与培养细胞刺激与培养（用于检测（用于检测IFN-,IL-4,IL-17,IL-22等）等）以人PBMC或全血为例：+PMA(50 ng/ml)+Ionomycin(1 ug/L),刺激2-4小时后 +Brefeldin A(10 ug/ml)继续培养4小时后，收集细胞用于染色流式细胞仪检测胞内细胞因子的标准操作程序流式细胞仪检测胞内细胞因子的标准操作程序2.细胞染色过程细胞染色过程 收集细胞 阻断Fc受体：用10%血清/Fc受体阻断抗体封闭，消除非特异性结合染色 细胞表面染色：抗表面分子荧光抗体 溶血、固定、破膜 胞内染色：加荧光标记细胞

6、因子抗体 洗涤，上机检测（尽可能及时测定，存放时间过久将导致荧光强度降低Overview T细胞亚群的流式检测方法 Treg（调节性T细胞）-分化和功能 -鉴定分析指标和新指标 Th17细胞 -分化与功能 -检测方法Treg 分化分化第一类：天然第一类：天然 Tregs（nTregs）胸腺来源 CD4+,CD25high,FoxP3+，调控自身免疫反应第二类：第二类：适应性适应性 Tregs 来源于胸腺CD4单阳性细胞，TGF-,IL-10和 IL-4诱导 在外周调控免疫反应 调节性调节性T细胞的功能细胞的功能 维持机体内环境的稳定维持机体内环境的稳定 抗感染免疫抗感染免疫 抗肿瘤免疫抗肿瘤免

7、疫 诱导移植耐受诱导移植耐受 自身免疫性疾病自身免疫性疾病17Treg:免疫系统的终极维和部队免疫系统的终极维和部队Treg 缺陷会造成的严重的器官功能衰竭，甚至死亡缺陷会造成的严重的器官功能衰竭，甚至死亡Treg缺陷体内肠道表现：严缺陷体内肠道表现：严重的坏死性肠炎重的坏死性肠炎Treg缺陷体表皮肤：缺陷体表皮肤：皮炎，坏疽皮炎，坏疽Treg 重要性重要性如何鉴定和分离如何鉴定和分离TregsTreg:CD4+,CD25+,FoxP3+FoxP3:Tregs特异性标志 局限性：分选出的Tregs Cells are killedCD25high:依靠CD25high 流式分选细胞 局限性：损

8、失部分目的细胞CD127:较新标记，结合使用，完善了分选Marker CD127 的表达与 FoxP3Hi CD4+CD25ihi T细胞显著负相关Tregs新标记新标记:CD39CD39表达在Foxp3(+)调节性效应/记忆T细胞。Blood.2007;110:1225-1232.Tregs新标记新标记:CD152CD152(CTLA-4)：抑制活性Marker，维持Treg细胞保持正常的抑制活性,对于维持自身免疫耐受,保持免疫自稳的非常重要的标志。Tregs功能性标记功能性标记:SATB1 功能性Marker 代表了Treg的Suppressive功能Nat Immunol.2011;12

9、:898-907.Tregs的新标记的新标记:GARP GARP是活化Treg的特异性指标活化TregReferences1.Ollendorff V,Noguchi T,deLapeyriere O,Birnbaum D.The GARP gene encodes a new member of the family of leucine-rich repeat-containing proteins.Cell Growth Differ.1994;5(2):213-219.(Biology)2.Stockis J,Colau D,Coulie PG,Lucas S.Membrane pro

10、tein GARP is a receptor for latent TGF-beta on the surface of activated human Treg.Eur J Immunol.2009;39(12):3315-3322.(Biology)Human Regulatory T Cell Cocktail-CD4,CD25,CD127Cat no:560249 50 TestsTargetFormatCD4FITCCD25PE-Cy7CD127Alexa Fluor 647Human Treg Sorting KitTargetFormatCD4PerCP-Cy5.5CD25PE

11、CD127Alexa Fluor 647CD45RA*FITC*单独一瓶包装 方便快捷地分选Tregs CD45RA 的加入优化了Tregs的分选 CD45RA 利于分选 nTregs 分选后扩增质量有保证Cat no:560753 10 Tests25Overview T细胞亚群的流式检测方法 Treg（调节性T细胞）-分化和功能 -鉴定分析指标和新指标 Th17细胞 -分化与功能 -检测方法Th17的分化、细胞表达及功能的分化、细胞表达及功能Th17 细胞参与炎性反应和宿主抗胞外病原体反应。作为可分泌IL-17A的Th的一个亚群，Th17 在自身免疫病发生过程中发挥重要作用。Th17 ba

12、ckground 特异性的表达IL-17A、F TGF-、IL-6、21、23诱导其分化 功能 介导防御感染，自身免疫和炎症反应。疾病治疗新靶点Th1/Th2/Th17 Phenotyping Cocktail ComponentsSpecificityCloneDyehIFN-gB27FITChIL-17AN49-653PEhCD4SK3PerCP-Cy5.5Buffers/Solutions(Cytofix,Perm/Wash,GolgiStop)hIL-4MP4-25D2APCQC 数据数据Treg/Th17 Phenotyping CocktailSpecificityCloneFor

13、matAnti-hIL-17AN49-653PEAnti-hCD4SK3PerCP-Cy5.5Anti-hu Foxp3259D/C7Alexa Fluor647QC 数据数据30FoxP3 和和 IL-17A的表达的表达Day 1Day 2Day 3Condition:A:CD3/CD28 B:A+IL-1b/IL-6 C:B+TGF-b D:C+IL-232.9%3.5%3.3%4.5%1.9%1.7%2.5%2.5%2.3%2.9%1.9%2.3%2.6%3.2%2.3%7.9%FoxP3IL-17ATGF-b induces IL17 from Day 2 also enhanced

14、by IL-23IL-17+(TH17)cells are non-overlapping with Foxp3+(Treg)cells文献：文献：T细胞多色检测细胞多色检测Nat Rev Immunol,201232Nat Rev Immunol,2012文献：文献：T细胞多色检测细胞多色检测Nat Rev Immunol,2012文献：文献：T细胞多色检测细胞多色检测Where to find the information？http:/ is BD Horizon BB515?BD Exclusive alternative to FITC Up to seven times brigh

15、ter than FITC Less spillover into neighboring channels Excellent resolution of dim populations35BB515 Spectra Brightness:Very Bright Ex Max 490 nm Em Max 515nm Filter:Same as FITC(e.g.530/30 nm)BB515 is up to seven times brighter than FITCHu CD4 Hu CD3Ms CD11b Hu CD19Hu CD127Better resolution of dim

16、 markersCD25 FITC or CD25 BB515 and CD3 PerCP-Cy5.5,CD4 APC,CD127 PECD25 FITCCD25 BB515BB515 on Accuri39Hu CD4 BB515,FITC Hu CD19 BB515,FITC Hu CD127 BB515,FITC Less spillover compared to FITCCompbeads can be used to set up compensationBufferResultsFACSLyse vs PharmlyseBoth CompatibleCytofixStable a

17、t least 72 hoursCytofix/CytopermStable at least 72 hours1%PFAStable at least 72 hoursFACSPermeabilization Solution 2Both Pre and Post staining protocols work,Pre-staining works bestTranscription Factor BufferCompatiblePhosflow Perm IIIBoth Pre and Post staining protocols work,Pre-staining works bestEDTA vs HeparinBoth CompatibleCompatible with Standard Buffers