从细胞因子及能量代谢角度研究慢性心力衰竭治疗的新课件.ppt

1、心血管药理讲座心血管药理讲座 从细胞因子及能量代谢角度研究慢性心从细胞因子及能量代谢角度研究慢性心力衰竭治疗的新靶点及干预策略力衰竭治疗的新靶点及干预策略主要介绍内容研究慢性心衰治疗新策略的必要性研究慢性心衰治疗新策略的必要性改善心肌能量代谢改善心肌能量代谢- -治疗心衰的关键治疗心衰的关键三、新策略及靶点：细胞因子、能量代谢与心力衰竭三、新策略及靶点：细胞因子、能量代谢与心力衰竭TNF-TNF-及其受体及其受体心衰的治疗靶点及希望？心衰的治疗靶点及希望？五、抑制五、抑制TNF-TNF-与与 TNF-R1 TNF-R1的结合活性的合成的优选多肽的结合活性的合成的优选多肽Pep3Pep3治疗心衰

2、效果评价治疗心衰效果评价2精品资料 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早”世界卫生组织世界卫生组织0808年年1010月发布了全球疾病状况月发布了全球疾病状况的最新评估报告，心血管疾病是当前导致的最新评估报告，心血管疾病是当前导致人类死亡的最主要原因。人类死亡的最主要原因。一、研究慢性心衰治疗新策略的必要性一、研究慢性心衰治疗新策略的必要性心血管疾病心血管疾病肿瘤肿瘤传染病传染病

3、(29%)(29%)心血管疾病的主要死亡原因心血管疾病的主要死亡原因心力衰竭心力衰竭n 发病率高：国内患病率发病率高：国内患病率0.8%0.8%0.9%0.9%，患者约，患者约12001200万万, , 而而 且每年呈现且每年呈现5050万递增的趋势；万递增的趋势；n 预后差：预后差： 每年死亡每年死亡2020万，五年死亡率万，五年死亡率5050；n 费用大：费用大： 在欧美，治疗费用占整个卫生支出的在欧美，治疗费用占整个卫生支出的2%2%，是肿瘤的是肿瘤的2 2倍。倍。 死亡死亡代偿期代偿期失代偿期失代偿期恶化期恶化期结构和功能的改变结构和功能的改变-重塑重塑高血压，冠心病高血压，冠心病遗传

4、，心肌病遗传，心肌病瓣膜病，先心病瓣膜病，先心病*心力衰竭心力衰竭6激素、药物、神经递质膜受体第二信使 Ca2+离子通道活性肽心力衰竭心律失常线粒体活性氧心脏病相关基因活性肽(1) (1) 心心力力衰衰竭竭心力衰竭可能的发展基础8慢性心衰治疗理念的进步慢性心衰治疗理念的进步70年代：改善血流动力学紊年代：改善血流动力学紊乱：强心、利尿、扩血管乱：强心、利尿、扩血管90年代：抑制神经体液因年代：抑制神经体液因子：子：阻滞剂、阻滞剂、ACEI/ARB 2121世纪：心肌代谢疗法可世纪：心肌代谢疗法可望成为望成为CHFCHF治疗的新靶点。治疗的新靶点。任何减少能量消耗的心力衰竭疗法，如受体阻滞剂，A

5、CEI，ARB均可以改善心衰患者的预后。增加能量消耗的药物，如正性肌力药物，则增加心衰的死亡率。“衰竭的心脏是一台缺乏燃料的发动机衰竭的心脏是一台缺乏燃料的发动机” 能量缺乏可能是心衰的重要发病机制能量缺乏可能是心衰的重要发病机制 Neubauer S. N Engl J Med, 2007, 356:1140-1151.二、改善心肌能量代谢二、改善心肌能量代谢- -治疗心衰的关键治疗心衰的关键 心脏耗能位居所有器官之首，每天消耗6kg ATP，搏动约 10 万次，向全身泵出 10 吨血液。心脏通过能量代谢将储存于脂肪酸或葡萄糖中的化学能转化为机械能，为心脏收缩和舒张提供能量。若能量产生和利用

6、的效率发生改变，心脏便会出现功能障碍。心脏的能量代谢心脏的能量代谢2 2、糖酵解（极少）、糖酵解（极少） 1 1、线粒体氧化代谢、线粒体氧化代谢 脂肪酸脂肪酸（60%-90%60%-90%） 葡萄糖葡萄糖（10%-40%10%-40%） 正常心肌的能量代谢正常心肌的能量代谢 ATPATP来源来源正常心肌的能量代谢正常心肌的能量代谢 底物代谢底物代谢 氧化磷酸化氧化磷酸化能量利用能量利用 正常心肌的能量代谢过程（一）：底物的利用丙酮酸丙酮酸葡萄糖葡萄糖脂肪酸脂肪酸糖酵解糖酵解脂酰CoA合成酶乙酰CoA丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶（PDH）有氧状态有氧状态脂酰脂酰CoA脂酰脂酰CoA-氧化氧化三羧酸三

7、羧酸循环循环CO2 + NADHMitochondriacytoplasmBlood肉毒脂酰转移肉毒脂酰转移酶酶（CPT）正常心肌的能量代谢过程（二）：氧化磷酸化线粒体内膜QH+H+H+O2H2OH+ATP合酶ADP + PiATPNADHHNADFADH2FAD三羧酸循环三羧酸循环游离脂肪酸游离脂肪酸氧化氧化Mitochondria主要表现：主要表现：2004年，Van Bilsen 等提出心肌代谢重构的概念。 Van Bilsen M, et al. Cardiovasc Res, 2004, 61: 218-226心肌代谢重构（心肌代谢重构（metabolic remodeling） 由

8、心肌细胞糖类和脂肪等物质代谢紊乱引起心脏能量代由心肌细胞糖类和脂肪等物质代谢紊乱引起心脏能量代谢途径改变，导致细胞结构和功能异常的现象。谢途径改变，导致细胞结构和功能异常的现象。脂肪酸氧化作用受损，主要的心肌能量来源从脂肪酸脂肪酸氧化作用受损，主要的心肌能量来源从脂肪酸氧化变为糖酵解。重构过程至失代偿状态，心肌能量缺氧化变为糖酵解。重构过程至失代偿状态，心肌能量缺乏。乏。 Razeghi P, et al. Circulation, 2001, 102: 2923-2931. Paolisso G, et al. Metabolism, 1994, 43: 174179.1 1 心肌底物利用变

9、化心肌底物利用变化衰竭心肌的能量代谢衰竭心肌的能量代谢 FFA氧化率正常或增加，葡萄糖摄取和糖酵解可能加速，氧化率正常或增加，葡萄糖摄取和糖酵解可能加速， 心肌细胞处于代偿状态。心肌细胞处于代偿状态。 心衰早期心衰早期 心衰晚期心衰晚期 脂肪酸氧化受损可能继发于线粒体结构紊乱。PDH和CPT-1活性改变脂肪酸氧化的基因表达下调Bilsen MV. Cardiovasular Res. 2009, 81:420-428衰竭心肌的能量代谢衰竭心肌的能量代谢 1 1 心肌底物利用变化心肌底物利用变化ATP产生减少，产生减少，心肌收缩、舒张心肌收缩、舒张功能障碍功能障碍2 2 氧化磷酸化受损氧化磷酸化

10、受损线粒体结构、数量改变线粒体结构、数量改变 电子传递链活性降低电子传递链活性降低 ATP合酶效能降低合酶效能降低 解偶联蛋白表达增强解偶联蛋白表达增强 Ide T, Ide T, et al. Circ Reset al. Circ Res, 2001, 88:529-35., 2001, 88:529-35.Quigley AF, Quigley AF, et al. J Card Failet al. J Card Fail, 2000, 6:47-55., 2000, 6:47-55.Casademont J, Casademont J, et al. Heart Fail Revet

11、 al. Heart Fail Rev, 2002;7:131-9., 2002;7:131-9.衰竭心肌的能量代谢衰竭心肌的能量代谢 3 3 ATP 转移和利用受损转移和利用受损 线粒体内膜线粒体内膜ANT蛋白表达下降蛋白表达下降cytoplasmATPADP + +线粒体线粒体肌酸激酶肌酸激酶+ + 肌酸（肌酸（Cr） 磷酸肌酸（磷酸肌酸（PCr）衰竭心肌的能量代谢衰竭心肌的能量代谢 PPAR调节心肌线粒体功能及脂肪酸氧化的重要核转录因子。调节心肌线粒体功能及脂肪酸氧化的重要核转录因子。PPAR基因敲除鼠心肌脂肪酸氧化明显降低，而转基因鼠心肌脂肪基因敲除鼠心肌脂肪酸氧化明显降低，而转基因鼠

12、心肌脂肪酸氧化增强。酸氧化增强。研究发现，心衰患者心肌组织研究发现，心衰患者心肌组织PPAR的表达较正常心肌组织下降的表达较正常心肌组织下降54，PPAR受损可能导致心肌能量匮乏。受损可能导致心肌能量匮乏。vKarbowska J, et al. Cell Mol Biol Lett, 2003, 8:49-53衰竭心肌能量代谢的基因调节衰竭心肌能量代谢的基因调节 外源性配体（调脂药）外源性配体（调脂药） 内源性配体内源性配体（长链脂肪酸）（长链脂肪酸）PPARPPRE脂肪酸氧化（脂肪酸氧化（FAOFAO）基因）基因CD36/FATFABPFACSmCPT-1MCAD, LCADUCP3细胞核

13、PPAR衰竭心肌能量代谢的基因调节衰竭心肌能量代谢的基因调节Stanley WC. Physiol Rev. 2005, 85:1093-1129 衰竭心肌能量代谢的基因调节衰竭心肌能量代谢的基因调节可与可与PPAR等多种核转录因子结合等多种核转录因子结合 生物学效应生物学效应 脂肪酸氧化增强脂肪酸氧化增强 葡萄糖氧化减弱葡萄糖氧化减弱 线粒体生物合成增加线粒体生物合成增加 Zhou SG, Liu PQ*（刘培庆，通讯作者）（刘培庆，通讯作者）.Proteomic Analysis of Hypertension-Induced Left Ventricular Hypertrophy by

14、 Two-Dimensional Difference Gel Electrophoresis and Mass Spectrometry J Proteome Res, 2006,5(11):2901-2908 (IF 6.92)24 SHR与与2k2c RHR心肌肥大大鼠心肌组织蛋白组学研究心肌肥大大鼠心肌组织蛋白组学研究发现了发现了18个差异表达蛋白，其中个差异表达蛋白，其中12个是能量代谢密切的酶，如个是能量代谢密切的酶，如-烯醇化酶、短烯醇化酶、短链脂酰辅酶链脂酰辅酶A 脱氢酶、脱氢酶、NADH 脱氢酶脱氢酶亚复合体亚复合体10、谷胱甘肽、谷胱甘肽-s-转移酶等转移酶等研究基础研究基

15、础研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中点变化及调控机制Nmnat2 protects cardiomyocytes from hypertrophy via activation of SIRT6.Nmnat3 protects cardiomyocytes from hypertrophy via activation of SIRT3. NAD+的生物合成的生物合成尼克酰胺磷酸核糖基转移酶（Nampt）和烟酰胺单核苷酸腺苷酰基转移酶（Nmnat）对NAD+的合成起到了关键的催化作用。NAD+的转运及细胞分布的转运及细胞分布证明了证明了PPAR、NFATc4及及 GATA-4之间相互作用在之

16、间相互作用在心肌肥大中的意义心肌肥大中的意义。29心衰过程中转录调控因子心衰过程中转录调控因子PGC-1、 RIP140 表达与能量代谢关键指标的关系表达与能量代谢关键指标的关系30增加线粒体生物合成 NRF(核呼吸因子核呼吸因子)PGC-1-PPAR线粒体生物合成 。此二者是调控心肌脂肪酸分解和线粒体供能的枢纽此二者是调控心肌脂肪酸分解和线粒体供能的枢纽 心肌代谢疗法心肌代谢疗法底物的调节底物的调节心肌代谢的争议与思考 脂肪酸脂肪酸葡萄糖葡萄糖心肌肥厚和心衰时，能量代谢底物改变何种程度是代偿性的，何种程度是失代偿性的？脂肪酸氧化抑制在何时？抑制到什么程度?可以改善心衰。心衰时葡萄糖代谢可以代

17、偿脂肪酸氧化降低的能量不足吗？心衰 心肌代谢 心衰代谢重构在心衰治疗中的意义 拮抗神经体液：血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI) 、血管紧张素受体拮抗剂、-受体阻滞剂心衰缺能底物的调节： 1 1）增加葡萄糖氧化：曲美他嗪（Trimetazidine,TMZ) 2 2）抑制脂肪酸氧化：L-卡尼丁(L-carnitine) 3 3）增强呼吸链功能：辅酶Q10 4 4）补充磷酸肌酸 5）Potential therapy: promote mitochondria biogenesis三.新策略及靶点细胞因子受体、能量代谢调控？心衰过程中增高的细胞因子、神经激素及生长因子形心衰过程中增高的细胞因子、神

18、经激素及生长因子形成网络，其错综复杂的网络调节紊乱决定了心衰病理成网络，其错综复杂的网络调节紊乱决定了心衰病理过程的复杂性，过程的复杂性，针对某一靶点或单一环节的药物往往针对某一靶点或单一环节的药物往往难以起到理想的治疗心衰效果。难以起到理想的治疗心衰效果。靶向细胞因子受体及心肌能量代谢关键环节的药物具靶向细胞因子受体及心肌能量代谢关键环节的药物具有重要的研发前景，有重要的研发前景，心衰新靶点的干预正在成为治疗心衰新靶点的干预正在成为治疗心衰的希望心衰的希望。34Ardehali H, et al. Eur J Heart Fail. 2012 ;14(2):120-9. 肾素肾素血管紧张素血

19、管紧张素醛固酮系统醛固酮系统交感神经系统交感神经系统内皮素系统内皮素系统 胰岛素抵抗胰岛素抵抗细胞因子和生长因子细胞因子和生长因子 细胞因子网络与炎症反应通路细胞因子网络与炎症反应通路引自引自:Sun SC. The noncanonical NF-B pathway. Immunol Rev. 2012, 246(1):125-4037TNF-及其受体炎症性疾病重要治疗靶点！TNF-是诸多炎性是诸多炎性相关疾病细胞因子相关疾病细胞因子网络的关键部分，网络的关键部分，也是与能量代谢障也是与能量代谢障碍密切相关的细胞碍密切相关的细胞因子，因子， TNF-主要主要通过通过 TNFR1介导胞介导胞内

20、信息传递及细胞内信息传递及细胞功能改变，是炎症功能改变，是炎症性疾病重要治疗靶性疾病重要治疗靶点。点。38Chen G, Goeddel DV. TNF-R1 signaling: a beautiful pathway. Science. 2002，296:1634 以以TNF-孵育孵育AC16（人源性心肌细胞株）（人源性心肌细胞株） 或或H9c2细胞细胞（心肌细胞株），可以明显下调丙酮酸脱氢酶激酶（心肌细胞株），可以明显下调丙酮酸脱氢酶激酶4、 PGC-1、肉碱脂酰基转移酶、肉碱脂酰基转移酶(CPT-) ，诱导葡萄糖氧，诱导葡萄糖氧化率显着增加，同时增加化率显着增加，同时增加MCP-1及及

21、IL-6表达增加，该作用表达增加，该作用主要通过主要通过NFB及及P38信号通路。信号通路。 心脏特异性过表达心脏特异性过表达TNF- 小鼠小鼠 (Mus musculus)也表现出明显的也表现出明显的PGC-1表达下表达下调。调。Gao F, et al. J Cardiovasc Pharmacol.2012;59(6):500-6Palomer X et al. Cardiovasc Res 2009;81:703-712四、四、TNF-及其受体及其受体心衰的治疗靶点及希望？心衰的治疗靶点及希望？（一）（一）TNF-与心肌能量代谢与心肌能量代谢Schematic representati

22、on of the mechanisms involved in the metabolic dysregulation of AC16 cells treated with tumour necrosis factor-. Palomer X et al. Cardiovasc Res 2009;81:703-712Published on behalf of the European Society of Cardiology. All rights reserved. The Author 2008. For permissions please email: journals.perm

23、issionsoxfordjournals.org（二）TNF-及其受体心衰的治疗靶点及希望？普遍支持慢性心衰患者循环血中普遍支持慢性心衰患者循环血中 TNF- TNF-水平显著增高，且增水平显著增高，且增高的程度与高的程度与CHFCHF的严重程度、心功能分级及死亡率呈正相关。的严重程度、心功能分级及死亡率呈正相关。不同病因间（高血压、冠心病、风湿性心脏病、扩张型心肌病）不同病因间（高血压、冠心病、风湿性心脏病、扩张型心肌病）所导致的心力衰竭循环中所导致的心力衰竭循环中TNF-TNF-的含量无明显统计学差异，提的含量无明显统计学差异，提示循环血中示循环血中TNF-TNF-增高参与心衰的基本病理

24、过程。增高参与心衰的基本病理过程。Levine B, et al. N Engl J Med. 1990; 323(4):236-41.Levine B, et al. N Engl J Med. 1990; 323(4):236-41.Kosar F, et al. Eur J Heart Fail. 2006; 8(3):270-4.Kosar F, et al. Eur J Heart Fail. 2006; 8(3):270-4.Sharma R, et al. Am J Cardiol. 2003;15;92(2):188-93.Sharma R, et al. Am J Cardi

25、ol. 2003;15;92(2):188-93.411、临床研究资、临床研究资料料2.实验动物水平研究1.1. 转转TNF-基因小鼠出现心衰表现，提示基因小鼠出现心衰表现，提示TNF-与心衰的密切关与心衰的密切关系系2. TNF基因敲除基因敲除 (TNF-/-)小鼠对腹主动脉缩窄介导的心脏重构、炎小鼠对腹主动脉缩窄介导的心脏重构、炎症反应等均比症反应等均比C57背景鼠轻得多，而且心功能也明显改善背景鼠轻得多，而且心功能也明显改善3.灌注灌注TNF-可导致大鼠心肌收缩性明显下降以及心室过度舒张。可导致大鼠心肌收缩性明显下降以及心室过度舒张。4. 心衰时心脏既是心衰时心脏既是TNF-作用的靶器官

26、，也是其生物合成的场所。作用的靶器官，也是其生物合成的场所。TNF-的表达水平与心衰的严重性相关，心肌表达的表达水平与心衰的严重性相关，心肌表达TNF-受体。受体。 Shusterman V, et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2010; 298(2):H440-50 Shusterman V, et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2010; 298(2):H440-50 Jobe LJ, et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009;297(4):H1462-

27、8 Jobe LJ, et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009;297(4):H1462-8； Sun M, et al. Circulation. 2007;115(11):1398-407. Sun M, et al. Circulation. 2007;115(11):1398-407.423. 靶向TNF-途径治疗心衰现状已上市的已上市的TNF-抑制剂：依那西普（抑制剂：依那西普（Etanercept）、英利昔单抗）、英利昔单抗（Infliximab）和阿达木单抗（）和阿达木单抗（Adalimumab）等大分子蛋白药物。）等大分子蛋白药物

28、。其机制为竞争性和其机制为竞争性和TNF-结合，阻断结合，阻断TNF-和细胞表面和细胞表面TNF受体结合，降受体结合，降低低TNF-活性，为非选择性拮抗活性，为非选择性拮抗TNF-作用。其临床适应症主要为类风湿作用。其临床适应症主要为类风湿性关节炎等，以往缺乏单纯治疗心衰治疗的大样本临床资料。性关节炎等，以往缺乏单纯治疗心衰治疗的大样本临床资料。NurmohamNurmoham等等近期对近期对10.9万万RA患者（其中患者（其中4.8万例万例暴露于抗暴露于抗TNFTNF治疗治疗) )的大样的大样本回顾性研究明确本回顾性研究明确：抗抗TNFTNF治疗与未用治疗与未用TNFTNF治疗相比显著减少包

29、括心衰在内治疗相比显著减少包括心衰在内的多种的多种CVCV事件发生的风险事件发生的风险。 Nurmoham,et al. Ann Rheum Dis 2012;71(Suppl3):52Nurmoham,et al. Ann Rheum Dis 2012;71(Suppl3):52 。43（三）研究TNFR1亚型及胞外区的意义TNFTNF受体受体:目前发现的有TNFR1和TNFR2，两种都为跨膜蛋白。 TNFR1及及TNFR2胞外区有胞外区有30%同源性，胞内区无同源性，提示同源性，胞内区无同源性，提示二者介导不同的信号转导机制二者介导不同的信号转导机制, TNFR1 是是TNF- 引发炎症反

30、应引发炎症反应的主要受体，也是心衰过程中心脏的主要表达受体的主要受体，也是心衰过程中心脏的主要表达受体。 TNFR2不不能直接激活胞内信号通路能直接激活胞内信号通路,亦有研究认为激活亦有研究认为激活TNFR2有助于心衰有助于心衰治疗。治疗。利用高选择性多肽或选择性小分子抑制剂区分利用高选择性多肽或选择性小分子抑制剂区分TNFR1不同胞外不同胞外TNF- 结合区，分别研究结合区，分别研究TNFR1不同胞外区介导的相关的胞内不同胞外区介导的相关的胞内信号机制，有望发现适合治疗心衰新的靶点、信号途径及相关信号机制，有望发现适合治疗心衰新的靶点、信号途径及相关靶基因。靶基因。44Chen G, Goe

31、ddel DV. TNF-R1 signaling: a beautiful pathway. Science. 2002;296(5573):1634-5TNF受体途径 1）TNF与TNFR1胞外区结合，使TNFR1形成三聚体。 2）三聚体TNFR1通过其聚集的胞内区死亡结构域（DD）招募下游信号传导蛋白（TRADD、FADD、TRAF2、RIP）。 3）下游信号传导蛋白形成复合体，激活下游的caspase 8以及各种效应分子caspases，产生级联激活反应，最终引起靶细胞凋亡。 4）TNF还可通过下游激活蛋白RIP，TRAF2等，分别激活NIK和MEKK，从而激活NFKB和cJun，抑制

32、细胞凋亡。TNFR1主要通过第主要通过第2、3 功能区（功能区（CRD2,CRD3)与与TNF-相互识别，相互识别， TNF- 与与TNFR1 的识别的两个的识别的两个关键位点分别位于关键位点分别位于CRD2 和和CRD3 的的A1 模块模块,关键的关键的作用位点存在于作用位点存在于A1 模块的疏水区模块的疏水区,目前对于目前对于TNFR1的的研究及研究及TNFR1抑制剂的设计和开发主要集中在这抑制剂的设计和开发主要集中在这2个个功能区，特别是针对功能区，特别是针对CRD3已研究出选择性及抗炎效已研究出选择性及抗炎效价较高的环肽抑制剂（价较高的环肽抑制剂（YCWSQYLCY, C-C），但并）

33、，但并没有进行治疗心衰效果评价。没有进行治疗心衰效果评价。 Takasaki W,et al. Nat Biotechnol 1997; 15:1266-70Mukai Y, et al. J Mol Biol 2009; 385:1221-9 46CRD4亦有非常保守的亦有非常保守的A1 模块结构，针对于模块结构，针对于CRD4 A1 模块结模块结构疏水区域的作用研究对于客观认识构疏水区域的作用研究对于客观认识TNF- 和和TNFR1的结合模的结合模式式我们以我们以 TNF-R1 的胞外的胞外CRD4 区的区的A1 模块疏水区为模板，设模块疏水区为模板，设计合成计合成TNFR1 衍生小肽序列

34、，并对其进行活性测试，筛选出对衍生小肽序列，并对其进行活性测试，筛选出对TNF- CRD4 区有较高亲和力，可以通过对区有较高亲和力，可以通过对TNF-的识别及阻的识别及阻断作用抑制断作用抑制TNF- 信号传导较高活性肽信号传导较高活性肽Pep3，动物实验显示，动物实验显示出比出比Etanercept更好的治疗心衰效果，申请并已获得专利授权。更好的治疗心衰效果，申请并已获得专利授权。Cao Y, Liu PCao Y, Liu P* *. A synthetic peptide derived from A1 module in CRD4 of human TNF . A synthetic

35、peptide derived from A1 module in CRD4 of human TNF receptor-1 inhibits binding and proinflammatory effect of human TNF-alpha, receptor-1 inhibits binding and proinflammatory effect of human TNF-alpha, Inflammation, 2009, 32: 139-145Inflammation, 2009, 32: 139-145一种多肽及其在制备抗心衰和炎性反应药物中的应用，中国发明专利授权号：一种

36、多肽及其在制备抗心衰和炎性反应药物中的应用，中国发明专利授权号：ZL 2008 10218732.2ZL 2008 10218732.2；发发 明明 ( (设计设计) )人：刘培庆人：刘培庆; ; 蒋建敏蒋建敏; ; 曹颖男曹颖男四.针对TNF-及其受体TNFR1的研究我们利用心梗致心衰大鼠模型比较了我们利用心梗致心衰大鼠模型比较了Etanercept和我们前和我们前期筛选到的期筛选到的TNFR1 CRD4区抑制剂区抑制剂Pep3，发现尽管，发现尽管Etanercept 抑制抑制TNF-活性作用高于活性作用高于Pep3，但改善心脏，但改善心脏功能作用不及功能作用不及Pep3。TNFR1可与可与

37、TNF-结合的胞外端包结合的胞外端包括括CRD3区和区和CRD4区，是否区，是否TNF-与与TNFR1 CRD3区、区、CRD4区结合介导的胞内信号机制、靶基因及转录调控不同？区结合介导的胞内信号机制、靶基因及转录调控不同？针对针对TNF-受体及亚型的选择性抑制更有利于心衰治疗？受体及亚型的选择性抑制更有利于心衰治疗？ (一）建立了针对一）建立了针对TNFR1 CRD4区多肽合成、多肽区多肽合成、多肽表征鉴定及活性筛选体系表征鉴定及活性筛选体系1. 肽库的设计及多肽合成肽库的设计及多肽合成以I型TNF受体（TNFR1）N端胞外第四区域（Domain 4）的天然结构为目标，应用组合化学、多肽固相

38、合成技术，结合现代合成、分离纯化技术，建立各种不同的多肽衍生物，通过各种波谱分析及HPLC等确定它们的结构纯度。小分子肽的合成采用固相Fmoc法，选用2-Chlorotrityl chloride树脂作为固相载体，N,N-二甲基甲酰胺做溶剂，缩合试剂选用二异丙基碳二亚胺，使用Reagent B切除肽链和侧链保护基，有关合成技术已经完善。49ClCl+NHOHOOOR11.DCM/DIPEA2.Methol/DIPEAClNHOOOOR120%Piperidine/DMFClNH2OOR11.AA2-Fmoc/DIC/HOBT/DMF 2. 20%Piperidine/DMFClOONHR1OO

39、NH2R21.AA3-Fmoc/DIC/HOBT/DMF 2. 20%Piperidine/DMF. .2-Cl-trityl-AA1-AA2.AAn-NH2Reagent BAA1-AA2.AAn-NH2图图1. 固相固相Fmoc法合成肽链示意图法合成肽链示意图 502. 建立了合成多肽分子量的建立了合成多肽分子量的ESI- MS质谱表征分析、多肽纯度质谱表征分析、多肽纯度的的HPLC表征分析、合成的粗产品表征分析、合成的粗产品HPLC纯化方法及活性分析纯化方法及活性分析TNF- binding实验方法实验方法 254 nm214 nmFig. 2. HPLC analysis of Pep

40、 3 at 254 nm and 214 nm.S5 #52 RT: 1.53 AV: 1 SB: 8 2.00-2.22 NL: 5.58E5T: + c Full ms 160.00-2000.0092094096098010001020104010601080110011201140m/z05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance949.41005.4987.41006.51027.4971.41043.3950.41009.4951.4988.51028.41045.3931.41025.4972.41065.

41、41029.51072.81102.5993.41011.5913.5973.5953.41054.51034.41129.71101.31111.3970.41084.3932.5906.4977.7926.81121.9964.81138.3944.6Fig.3. ESI-MS analysis of Pep 3 513. 证明了已合成的优选多肽证明了已合成的优选多肽Pep3具有较高的抑制具有较高的抑制TNF-与与 TNF-R1的结合活性、抑制的结合活性、抑制HeLa细胞细胞IB-降解及降解及NF-B p65核转位核转位。Fig. 4. Inhibition of TNF- binding

42、 to TNF-R1 by synthetic peptides in ELISA.Fig. 5. Effect of Pep 3 on TNF-induced degradation of IB- in HeLa cells.Fig. 6. Effect of Pep 3 on TNF-induced NF-B p65 subunit nuclear translocation.Cao, Y, Liu, P * (刘培庆，通讯作者刘培庆，通讯作者). A synthetic peptide derived from A1 module in CRD4 of human TNF recepto

43、r-1 inhibits binding and proinflammatory effect of human TNF-alpha, Inflammation, 2009, 32: 139-145 52Yu S, Liu P.* (刘培庆，通讯作者刘培庆，通讯作者).Sirtuin 6 protects cardiomyocytes from hypertrophy in vitro via inhibition of NF-kappaB-dependent transcriptional activity, Br J Pharmacol, 2012. DOI: 10.1111/j.1476

44、-5381.2012.01903.x发现发现Sirt6通过以酶活性依赖性方式抑制通过以酶活性依赖性方式抑制NF-B的转录激活发挥的转录激活发挥抑制心肌肥大及炎性反应的作用抑制心肌肥大及炎性反应的作用53建立了巨噬细胞炎症反应模型，为从炎性病变角度研究心衰提供了技术支持。Xu S, Liu PQ*（刘培庆，通讯作者）（刘培庆，通讯作者）. Tanshinone II-A inhibits oxidized LDL-induced LOX-1 expression in macrophages by reducing intracellular superoxide radical generat

45、ion and NF-B activation. Transl Res. 2012 Aug;160(2):114-24 鉴于鉴于TNF-在心衰过程中的重要作用，在心衰过程中的重要作用，TNF-及其受体及其受体TNFR1有望成为心衰治有望成为心衰治疗的新途径及新靶点！疗的新途径及新靶点！通过多肽设计、合成及优化通过多肽设计、合成及优化, 获得更高活性及选择性多肽获得更高活性及选择性多肽研究研究TNF-通过通过TNFR1胞外不同区域介导心衰能量代谢胞外不同区域介导心衰能量代谢紊乱的机制紊乱的机制明确干预明确干预TNF-信号途径治疗心衰可行性，确定具体干预信号途径治疗心衰可行性，确定具体干预靶点靶点

46、对研发的高活性高选择性多肽进行治疗心衰的药效学评价，对研发的高活性高选择性多肽进行治疗心衰的药效学评价，为进一步小分子化合物的设计及研发奠定良好的基础。为进一步小分子化合物的设计及研发奠定良好的基础。56短肽库短肽库TNR1活性测试活性测试（试剂盒）（试剂盒）有机合成有机合成靶标靶标 （ TNFR1 ）专利多肽专利多肽Pep3构效关系分析构效关系分析优选多肽优选多肽Pepx合理化设计合理化设计结构优化结构优化细胞活性测试细胞活性测试（IC50）小分子抑制剂小分子抑制剂合理化设计合理化设计1. 多肽设计、合成及优化多肽设计、合成及优化TNF Receptor 1、TNF 和和小分子抑制剂的模建作

47、用模式小分子抑制剂的模建作用模式基于晶体结构：基于晶体结构：1FT4 和和 1TNR58TNF 小分子抑制剂的发现（设计、合成和活性测试）小分子抑制剂的发现（设计、合成和活性测试）活性测试活性测试分子动力学模拟分子动力学模拟分子对接分子对接小分子数据库小分子数据库大于大于40万化合物万化合物苗头化合物苗头化合物目标化合物目标化合物结构结构改造改造有机有机合成合成活性测试活性测试先导化合物先导化合物59中国天然产物数据库（中国天然产物数据库（CNPD ） (A) Chemical structure of the small molecule TNF- inhibitor. See (12) f

48、or synthetic route used. (B) Compound inhibition of TNF- binding to TNFR1 in vitro. An ELISA (12) was used to measure inhibition of solution-phase TNF-R1 horseradish peroxidase conjugate binding to biotinylated TNF- immobilized on a strepavidin-coated microtiter plate by serial dilutions of compound

49、. The solid line represents a four-parameter curve fit (20) that yielded an IC50 value of 22 M. (C) Compound inhibition of TNF- induced IB- depletion in HeLa cells. Cells were treated with sufficient TNF- or IL-1 to give an 80% of maximal IB- depletion response after a 30-min exposure (0.4 and 0.04

50、ng/ml, respectively), as measured in an assay of cell lysates (12). Solid circles show that compound addition inhibits this TNF-induced IB- depletion and yields an IC50 value of 4.6 M. Open circles show that compound addition does not affect orthogonal IL-1induced IB- depletion. Error bars indicate