第六章酶工程制药课件.ppt

1、第六章第六章 酶工程制药酶工程制药第一节第一节 概述概述一、酶的定义一、酶的定义定义定义：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的、受多种因素调节控制的、具有催化能力的生物催化剂。酶具有一般催化剂的特征酶具有一般催化剂的特征：1.1.只能进行热力学上允许进行的反应；只能进行热力学上允许进行的反应；2.2.可以缩短化学反可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.3.通过降低通过降低活化能加快化学反应速度。活化能加快化学反应速度。酶的特点：酶的特点：高效性、专一性、反应条件温和、可调节性。高效性、专一性、反应条件温和、可调节性。酶的高效性酶的高效性

2、以分子比表示，酶的催化反应的速度比非催化反应高1081020倍，比非酶催化剂高1031013倍。许多反应如无酶催化须在高温、高压、极端的pH条件下才能进行，而以酶为催化剂则可在常温、常压及中等的pH条件下进行。专一性专一性只能作用于某一类或某一种特定物质。反应条件温和反应条件温和反应可调节性反应可调节性l酶浓度的调节酶浓度的调节 l共价修饰调节共价修饰调节 l限制性蛋白水解作用与酶活力调控限制性蛋白水解作用与酶活力调控 l抑制剂的调节抑制剂的调节 l反馈调节反馈调节 l金属离子和其他小分子化合物的调节金属离子和其他小分子化合物的调节二、酶学研究历史回顾二、酶学研究历史回顾古代古代最早酶的利用：

3、l食品加工：面包，酒，醋及奶酪等。l夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。l商代，BC 1300，“酒池肉林”。l酿醋出现的时间几乎和酿酒同步。l公元前12世纪周朝，酿酒，制作饴糖和酱。l春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。近代酶的发现近代酶的发现1783年,意大利科学家司帕拉扎尼（Spallazani）阐明动物和人的胃液对肉块的消化作用为化学变化而非物理变化（如溶解），在“温和”的条件下实现，这个作用还和温度、胃液加量有关，且在体外是不稳定的，活性会逐渐丧失。19世纪，Pasteur和Liebig学术长期争论:1857年，法国化学家和微生物学家Pasteur认为没有生物则没有发酵。德国化学

4、家Liebig认为发酵是由化学物质引起的。此争议由德国学者Buchner兄弟于1896年解决。德国巴克纳(Buchner)兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，制备了不含酵母细胞的抽提液，并证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵，说明发酵与细胞的活动无关。从而说明了发酵是酶作用的化学本质，为此Buchner获得了1911年诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖。l 1878年,给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思“在酵母中”。近代酶的化学本质近代酶的化学本质 1926年美国的Sumner从刀豆中得到脲酶结晶，首次提出酶的蛋白质本质,并为此获得1947年诺贝尔奖。30年代，Northrops得到了

5、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的结晶。酶是蛋白质酶是蛋白质?酶是高分子胶体物质、两性电解质，在电场 中如蛋白质一样泳动泳动;导致蛋白质变性的因素如温度、pH、紫外线、表面活性剂、重金属等往往也能使酶变性变性;酶能被蛋白酶水解水解而失活。1969年，年，Merrifield等人由氨基酸人工合成了具等人由氨基酸人工合成了具有催化活性的酶有催化活性的酶RNase，进一步证实了酶的蛋白，进一步证实了酶的蛋白质本质。质本质。酶表现出蛋白质性质：1982 美国的切克（Cech）发现具有催化功能的RNA，即四膜虫的26s rRNA具有催化自我剪切能力，并命名为核酶(ribozyme)。这一发现打破了酶是蛋

6、白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域，Cech 因此获得1986 诺贝尔奖。酶是一类具有催化活性的生物大分子，包括酶是一类具有催化活性的生物大分子，包括蛋白质和核酸。蛋白质和核酸。三、酶的分类三、酶的分类 1961年国际生化协会酶命名委员会根据酶所催化的反应类型将酶分为六大类，即氧化氧化还原酶类还原酶类、转移酶类转移酶类、水解酶类水解酶类、裂解酶类裂解酶类、异构酶类异构酶类和合成酶类合成酶类。1、氧化还原酶类 l催化氧化催化氧化-还原反应。还原反应。l主要包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、羟化酶以主要包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、羟化酶以及加氧酶类。及加氧酶类。如乳酸如乳酸(Lactate)

7、(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH2、转移酶类l转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上，如如转甲基团或原子转移到另一个底物的分子上，如如转甲基酶、转氨基酶、已糖激酶、磷酸化酶等。酶、转氨基酶、已糖激酶、磷酸化酶等。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。CH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO3、水解酶类 l水解酶催

8、化底物的加水分解反应。水解酶催化底物的加水分解反应。l主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反应：催化的脂的水解反应：H2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OH4、裂解酶类l裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。双键的反应及其逆反应。l主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，例如，延胡索酸水合酶催化的反应。延胡索酸水合酶催化的反应。HOOCCH=CHCOOHH2OHOO

9、CCH2CHCOOHOH5、异构酶类l异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。如消旋酶、顺反异构子内基团或原子的重排过程。如消旋酶、顺反异构酶等。酶等。例：例：6-6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。OCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOH6、合成酶类l合成酶，又称为连接酶，能够催化合成酶，又称为连接酶，能够催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 键的形成反应。这类反应必须与键的形成反应。这类反应必须与ATPATP分解分解反应相互偶联。反应相互

10、偶联。lA+B+ATP=AA+B+ATP=A-B+ADP+PiB+ADP+Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸丙酮酸 +COCO2 2 草酰乙酸草酰乙酸四、酶的来源和生产四、酶的来源和生产1、直接从动植物获得，即从生物体中分离和提纯 2、化学合成方法不足：生产周期长，来源有限，还要受一些自然 条件的限制。不足：一般只适用于短肽的生产。其优点如下：v微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全。v微生物繁殖快，生产周期短，成本低。v微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新的高产酶的菌株。3、工业微生物发酵通过液体深层发酵或固态

11、发酵细菌，从细菌中获得酶，是工业上酶的主要来源。五、酶工程及其研究内容五、酶工程及其研究内容酶工程酶工程：工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类需要的产品或服务于其它目的的一门应用技术。广义地讲还包括酶的生产、分离和纯化。国际酶工程学会（1971年）定义：是研究和开发酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化、酶及固定化酶的反应器、酶与固定化酶的应用等的工程科学。酶的大量生产和分离纯化新颖酶的发现、研究和应用酶的固定化技术和固定化酶反应器基因工程技术应用于酶制剂的生产酶分子改造与化学修饰有机介质中酶的反应酶抑制剂、激活剂的开发及应用研究抗体酶、核

12、酸酶的研究模拟酶、合成酶的研究酶的定向进化研究按现代观点，酶工程主要包括以下内容生物催化生物催化化学工业化学工业发酵工业发酵工业轻工业轻工业采矿采矿医药医药食品食品能源能源材料材料生物安全生物安全环境环境酶工程的应用酶工程的应用生物催化是工业生物技术的核心技术产品名称产量丙烯酰胺10万吨/年聚乳酸1.3万吨/年阿斯巴甜素2万吨/年生物柴油与汽油1000万吨/年抗菌素中间体6APA0.9万吨/年以生物催化法合成的主要产品以生物催化法合成的主要产品 第二节第二节 酶的分离纯化酶的分离纯化 由于大部分酶是蛋白质，其分离纯化遵循蛋白质分离纯化的一般原则，但又有特殊性：低温：一般14 条件温和：避免极端

13、条件(剧烈搅拌、pH、盐浓度等)加入保护剂：EDTA、2-巯基乙醇等 对纯化过程进行监测：不断检测酶活力和蛋白浓度一、酶分离纯化的步骤一、酶分离纯化的步骤包括固液分离和细胞破碎包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等（分离胞内产物）等除去与目的产物性质差异很大的杂质除去与目的产物性质差异很大的杂质除去与产物性质相似的杂质除去与产物性质相似的杂质使酶与溶剂分离的过程使酶与溶剂分离的过程预处理预处理初步纯化初步纯化高度纯化高度纯化浓缩与干燥浓缩与干燥包括固液分离和细胞破碎包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等（分离胞内产物）等预处理预处理二、酶的提取（一）细胞破碎细胞破碎的方法细胞破碎的方法l

14、机械法机械法 l 物理法物理法l 化学法化学法 l 生物法（酶解）生物法（酶解）1.机械法：液体剪切：搅拌、匀浆。固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。超声波破碎法。渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等），平衡后 迅速转入低渗溶液或水中。冻融法：反复低温冰冻，室温融化。2.物理法：应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。l 有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁 醇、氯仿等。l 表面活性剂处理：常用非离子型表面活性剂，如 Triton X-100，Tween等。3.化学法l 外加酶法：外加酶法：根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。l 自溶法自

15、溶法:细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶 解的现象。解的现象。4.酶解法采用保护措施，保护酶的活性 采用缓冲系统 添加保护剂 抑制水解酶的作用 其他：注意温度、搅拌、紫外光等的影响（二）酶的抽提 把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。提取目标：a.将目的酶最大限度地溶解出来。b.保持生物活性。提取原则 a.相似相溶。b.使用远离等电点的pH值，溶解度增加。盐溶液提取盐溶液提取 常用稀盐（常用常用稀盐（常用NaClNaCl）溶液（盐溶），）溶液（盐溶），对酶稳定对酶稳定性好、溶解度大，最常

16、用。性好、溶解度大，最常用。酸、碱溶液提取酸、碱溶液提取 有机溶剂提取有机溶剂提取 提取方法提取方法：（三）沉淀分离 通过以上过程获得含目的酶的无细胞抽提物，称为初提物。通常要采用沉淀技术对初提物进行再分离。等电点沉淀 盐析 有机溶剂沉淀采用方法：三、酶的纯化 根据分子量大小分离 离心、膜分离、凝胶层析等 根据电荷性质进行分离 离子交换、电泳等 根据疏水作用进行分离 疏水层析、反相色谱等 根据亲和作用分离 亲和层析第三节 酶和细胞的固定化 酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶 剂对其有影响）。酶不能回收，无法重复使用。产物中混杂酶蛋白，分离纯化困难。游离酶的缺点：游离酶的缺点：水溶性酶水不溶

17、性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术什么是固定化酶？固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。优点：优点：(1)(1)可提高酶的稳定性。可提高酶的稳定性。(2)(2)酶能回收，易与产物分离，可反复使用。酶能回收，易与产物分离，可反复使用。缺点：缺点：(1)(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)(2)酶活性下降。酶活性下降。固定在载体上固定在载体上,并在一定空间范围内进行生并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。什么是固定化细胞？(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作;(2)既可作为单一酶

18、，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。固定化细胞的优越性：(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要 的副产物。(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散 限制作用。固定化细胞的局限性：一、固定化酶(细胞)的制备（一）传统的酶固定化方法固定化方法固定化方法载体结合法载体结合法物物理理吸吸附附法法离离子子结结合合法法共共价价结结合合法法交联法交联法包埋法包埋法网格型网格型微囊型微囊型 依据酶或细胞和载体之间的非特异性物理吸附作依据酶或细胞和载体之间的非特异性物理吸附作用，使酶或细胞吸附于惰性固体的表面或离子交用，使酶或细胞吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。换剂上。1.1.吸附法（吸附法（adsorpt

19、ionadsorption）（2 2）离子结合法）离子结合法 作用力：作用力：离子键离子键 常用载体：常用载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、CM-CM-纤维素等。纤维素等。根据吸附剂的特点分为根据吸附剂的特点分为:（1 1）物理吸附法）物理吸附法 作用力：作用力：氢键、疏水键、范德华力、静电氢键、疏水键、范德华力、静电 常用载体：常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻 璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。优点：优点：条件温和，操作简条件温和，操作简 便，酶活力损失少。便，酶活力损

20、失少。缺点：缺点：结合力弱，易解吸结合力弱，易解吸 附附。吸附法吸附法2.2.共价结合法共价结合法借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。缺点：缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间反应条件较激烈，易影响酶的空间 构象而影响酶的催化活性。构象而影响酶的催化活性。优点：优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。可连续使用。常用的双功能试剂：常用的双功能试剂：戊二醛戊二醛3.3.交联法交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。固定化方法。戊二醛有两戊二醛有两个醛基，均可与个醛基，均可与酶或蛋

21、白质的游酶或蛋白质的游离氨基反应离氨基反应,使酶使酶蛋白交联。蛋白交联。此法与共价结合法利用的均是共价键，此法与共价结合法利用的均是共价键，不同之处：不同之处：交联法不使用载体。交联法不使用载体。交联反应既能发生在分子间，也可发生交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。在分子内。酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保 持溶解持溶解 状态。状态。酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为 不溶态。不溶态。缺点：缺点：(1)(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交反应条件激烈，酶分子的多个基团被交 联，酶活力损失大。联，酶活力损失

22、大。(2)(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来 不便。不便。4.4.包埋法包埋法将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。网格型：网格型：将酶包埋在高分子将酶包埋在高分子 凝胶细微网格中。凝胶细微网格中。微囊型：微囊型：将酶包埋在高分子将酶包埋在高分子 半透膜中。半透膜中。1 1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。2 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既 可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解可避免引起免

23、疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解 酶的降解，具有较大的医学价值。酶的降解，具有较大的医学价值。与网格型包埋法相比，与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：微囊型包埋法的优点：缺点：缺点：反应条件要求高反应条件要求高,制备成本也较高。制备成本也较高。优点：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变 酶的高级结构，酶活回收率高。酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。只适合作用于小分子底物和产物的酶。包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：与其它固定化方法相比：传统的酶固

24、定化方法传统的酶固定化方法吸附法吸附法固定化方法固定化方法吸附法吸附法包埋法包埋法共价结共价结合法合法交联法交联法物理吸附法物理吸附法离子吸附法离子吸附法制备难易制备难易易易易易较难较难难难较难较难结合程度结合程度弱弱中等中等强强强强强强活力回收活力回收高，酶易流失高，酶易流失高高高高低低中等中等费用费用低低低低低低高高中等中等底物专一性底物专一性不变不变不变不变不变不变可变可变可变可变各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较（二）酶固定化的新方法（二）酶固定化的新方法 光偶联法光偶联法 等离子体法等离子体法 偶合固定化法偶合固定化法 无载体固定化酶的新技术无载体固定化酶的新技术（

25、三）细胞的固定化方法（三）细胞的固定化方法分类方式分类方式固定化细胞固定化细胞 分类方式分类方式固定化细胞固定化细胞细胞类型细胞类型微生物微生物植物植物动物动物生理状态生理状态死细胞死细胞:完整细胞完整细胞,细胞碎片细胞碎片,细胞器细胞器活细胞活细胞:增殖细胞增殖细胞,静止细胞静止细胞,饥饿细胞饥饿细胞1.固定化细胞的分类固定化细胞的分类 直接固定法直接固定法 不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。固定。一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。一般只用于单酶或少数几种酶

26、催化的反应。吸附法吸附法 包埋法包埋法 2.2.固定化方法固定化方法（四）常用的固定化酶载体材料（四）常用的固定化酶载体材料自学。二、固定化酶（细胞）的性质和指标二、固定化酶（细胞）的性质和指标（一）固定化酶活力的改变（一）固定化酶活力的改变 酶的构象发生变化，影响活性中心的氨基酸酶的构象发生变化，影响活性中心的氨基酸 空间障碍：形成立体屏蔽空间障碍：形成立体屏蔽 内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻 包埋时，大分子底物不能透过膜包埋时，大分子底物不能透过膜通常低于天然酶（有例外）。通常低于天然酶（有例外）。原因：原因：酶的耐热性提高，对变性剂、抑制

27、剂、酶的耐热性提高，对变性剂、抑制剂、pH值、值、蛋白酶以及操作条件的抵抗力增加。蛋白酶以及操作条件的抵抗力增加。（二）酶的稳定性（二）酶的稳定性 可能的原因：可能的原因：固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形。抑制酶的自身降解。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶 的侵袭。最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。定性上升，最适温度也上升（有例外）。（三）酶的最适温度（三）酶的最适温度 带负电荷载体带负电荷载体：最适：最适pH 向碱性偏移。向碱性偏移。带正电荷载体带正电荷载体：最适：最适pH 向酸性偏移

28、。向酸性偏移。（四）酶的最适（四）酶的最适pH（五）酶的动力学特征（五）酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。固定化载体与酶的底物电荷相反时，固定化酶的表观Km值降低。固定化载体与酶的底物电荷相同时，固定化酶的表观Km值显著增加。与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。（六）酶的作用专一性（六）酶的作用专一性 与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂：（七）固定化细胞的性质（七）固定化细胞的性质 有活性升高的现象。稳定性的增加。最适温度和最适pH常保持不变。（八）固定化酶（细胞）的评价指标（八）固定化酶（细胞）的评价指标 固定化酶（细胞）

29、的活力 固定化酶（细胞）的偶联率及相对活力 固定化酶（细胞）的半衰期 固定化酶（细胞）的热稳定性1、固定化酶（细胞）的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。可在填充床或均匀悬浮在保温介质中测定。活力回收=(加入酶蛋白活力一上清液酶蛋白活力)/加入酶蛋白活力100%2、固定化酶（细胞）的偶联率及相对活力偶联率1，表明固定化对酶活性影响不明显；偶联率 1，表明固定化对降低酶活性；偶联率 1，可能有细胞分裂，或从载体中排除 影响酶活性的抑制剂。偶联率=固定化酶总活力/(加入酶的总活力 -上清液中未偶联酶活力)100%在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活

30、力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。是衡量稳定性的一项重要指标。3、固定化酶（细胞）的半衰期4、热稳定性 固定化酶的在不同温度下孵育1小时后，在最适温度下测酶活性，活力一般应保持在60%以上。四、酶传感器1、生物传感器的工作原理 待测物质经扩散作用进入固定生物膜敏感层，经分子识别而发生生物学作用，产生的信息如光、热、音等被相应的信号转换器变为可定量和处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，以电极测定其电流值或电压值，从而换算出被测物质的量或浓度。1967 1967年年UpdikeUpdike等采用酶的固定化等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜化酶

31、固定在疏水膜上，然后再和氧电上，然后再和氧电极结合，组装成了极结合，组装成了世界上第一个生物世界上第一个生物传感器传感器葡萄糖葡萄糖氧化酶电极。氧化酶电极。二、酶传感器GlucoseGluconic acidGlucose oxidaseOxygenHydrogen peroxideMembraneElectrode根据反应中消耗的根据反应中消耗的O O2 2、生成的葡萄糖酸和、生成的葡萄糖酸和H H2 2O O2 2的量，可的量，可以用氧电极和以用氧电极和H H2 2O O2 2电极来测定葡萄糖的含量。电极来测定葡萄糖的含量。1、酶传感器的原理酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成：固定化酶膜

32、：选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应；变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。（1 1）水质监测）水质监测 用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。其测定。从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物数酚类化合物。2、酶传感器的应用 德国研发的环境废水德国研发的环境废水BODBOD分析仪分析仪葡萄糖传感器和血糖测定仪葡萄糖传感器和血糖测定仪 用葡萄糖氧化酶（用葡萄糖氧化酶（glucose

33、 oxidase,GODglucose oxidase,GOD）制）制成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。（2 2）医疗方面）医疗方面手掌型葡萄糖手掌型葡萄糖(glucose)(glucose)分析仪分析仪（3）肉鲜度传感器l肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程度。l用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构成多胺生物传感器，或用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。第四节 酶反应器 与化学反应器相比：在低温、低压下发挥作用，反应时的耗能和产能较少。定义：以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置称为酶反应器(Enzy

34、me reactor)。作用：以尽可能低的成本，按一定的速度由规定的反应物制备特定的产物。与发酵反应器相比：不表现自催化方式（即细胞的连续再生）。酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图过程调控过程调控生物反应器生物反应器 消消毒毒原料原料预处理预处理 产物分产物分离提纯离提纯 产产品品生物催化生物催化剂制备剂制备空气空气除菌除菌能量能量热量热量一、酶反应器的类型l按结构结构区分l搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor,STR）l鼓泡式反应器(bubble column reactor,BCR)l填充床式反应器(packed column reactor,PCR)l流化床式反

35、应器(Fluidized Bed Reactor,FBR)l膜反应器(Membrane Reactor,MR)l按操作方式操作方式区分l分批式反应(batch)l连续式反应(continuous)l流加分批式反应(feeding batch)l混合形式混合形式l连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor,CSTR）l分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor,BSTR）(1)(1)间歇式酶反应器间歇式酶反应器l又称为批量反应器（Batch Reactor，BSTRBSTR）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。其特点是：底物与酶一次性投

36、入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。l优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态。l缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。(2)(2)连续式酶反应器连续式酶反应器l又称为连续搅拌釜式反应器（Continuous Stirred Tank Reactor,CSTRCSTR）、连续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。l优点是：在理想

37、状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。l缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。底物溶液进口 反应液出口 填充床酶反应器填充床酶反应器l填充床反应器（Packed Reactor,PBR）,又称固定床反应器。将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液（含产物）。l优点是：高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。l缺点是：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含

38、固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。流化床反应器流化床反应器l流化床反应器（Fluidized Bed Reactor,FBR）。l特点是：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。FBR可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。但因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。膜反应器膜反应器l膜反应器（membrane reactor,MRMR）是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。l用于固定

39、化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。l膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。7.3 各种酶反应器的特点各种酶反应器的特点反应器类型适用的操作方式适用的酶特点搅拌罐式反应器分批式,流加分批式连续式,游离酶固定化酶反应比较完全，反应条件容易调节控制。填充床式反应器连续式固定化酶密度大，可以提高酶催化反应的速度。在工业生产中普遍使用。流化床反应器分批式流加分批式连续式固定化酶流化床反应器具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和pH值的调节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应。反应器

40、类型适用的操作方式适用的酶 特点鼓泡式反应器分批式流加分批式连续式游离酶固定化酶鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高,适合于有气体参与的反应。膜反应器连续式游离酶固定化酶清洗比较困难 喷射式反应器连续式游离酶通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应，适用于某些耐高温酶的反应二、酶反应器的性能评价1、固定化酶的性状2、底物的物理性质3、固定化酶稳定性4、酶反应动力学特性通常颗粒状、片状、膜状或纤维状固定化酶固定化酶均可采用填充床反应器（PBR），而颗粒状、粉末状及片状固定化酶均可使用于连续式搅拌罐（CSTR），膜状固定化酶要用螺旋卷膜式反应器

41、。在应用游离酶游离酶进行催化反应时，酶与底物均溶解在反应溶液中，通过互相作用，进行催化反应。可以选用搅拌罐式反应器、膜反应器、鼓泡式反应器、喷射式反应器等。可溶性底物可溶性底物在反应器操作过程中，由于搅拌或液流的剪切作用，常会使酶从载体上脱落下来，或者由于磨损而使粒度变细，从而影响了固定化酶的操固定化酶的操作稳定性作稳定性。三、酶反应器的操作 底物浓度 酶浓度 反应温度的确定与调节控制 pH值的确定与调控 搅拌速度 流动速度 1、操作条件的确定2、酶反应器应用的注意事项 保持酶反应器的操作稳定性 保持反应器中流体的流动方式和状态 防止酶的失活变性 防止微生物的污染3、酶反应器生产能力的下降 酶

42、本身失活 酶从载体上脱落 载体的破碎或溶解第五节 酶工程的研究现状一、基因工程生产酶 可以大量生产某种酶，解决酶的来源问题。可以在构建表达载体时，加入各种突变。将编码酶的基因与合适的载体连接，导入受体进行表达，从而得到该基因编码的酶蛋白。意义二、突变酶 采用定点突变或随机突变的方法，改变酶分子的氨基酸序列，使其性质发生改变。提高酶的活性和稳定性研究酶的功能基团主要应用：三、酶分子的进化l理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。本先决条件。l所谓酶的所谓酶的

43、体外定向进化体外定向进化，属于蛋白质的非合理设，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。因，并定向选择出所需性质的突变酶。l在待进化酶基因的在待进化酶基因的PCRPCR扩增反应中，利用扩增反应中，利用Taq DNATaq DNA聚合酶不具聚合酶不具有有3 3-5-5校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率校对功能的性质，配合适当条

44、件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质或蛋白质)，从而排除其他突，从而排除其他突变体。变体。l定向进化的基本规则是定向进化的基本规则是“”。前者是人为引发的，后者虽相当。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。为控制下进行的。（1）定向进化中，

45、采用的突变方法可以有多种，突变具有随机性，但通过，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。（2）通常,。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。（3）高通量的筛选体系。四、抗体酶相同点：都是蛋白质，都有特异性。不同点：1）抗体无催化活力，酶有催化活力。2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催 化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。3）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。1、抗体与酶的异同：2.酶与底物形成过渡态理论 酶的催化在于

46、能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。O C A.酯酶的底酯酶的底物物酯酯B.酯的羧基碳酯的羧基碳原子受到亲核原子受到亲核攻击形成四面攻击形成四面体过渡态体过渡态C.设计的磷酸设计的磷酸酯类似物酯类似物,作作为抗原去免疫为抗原去免疫实验动物实验动物磷酸酯类似物磷酸酯类似物(半抗原半抗原)对酯水解反应有催化对酯水解反应有催化作用的作用的单克隆单克隆抗体抗体免疫免疫免疫反应免疫反应动物免疫动物免疫接种接种诱导法制备具有酯酶活性的抗体诱导法制备具有酯酶活性的抗体3 3、抗体酶的定义、抗

47、体酶的定义 抗体酶又称催化抗体（抗体酶又称催化抗体（catalytic antibody），），是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。在其可变区赋予了酶的属性。五、酶的化学修饰1 1、酶的化学修饰的概念：、酶的化学修饰的概念：通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变，从而改变酶的性质。发生改变，从而改变酶的性质。2 2、酶化学修饰的目的、酶化学修饰的目的1 1）提高酶的生物活性

48、（酶活力）。）提高酶的生物活性（酶活力）。2 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4 4）产生新的催化能力。）产生新的催化能力。3、酶化学修饰的方法（1 1）交联修饰（交联法）交联修饰（交联法）用双功能基团试剂用双功能基团试剂(如戊二醛如戊二醛)，与酶分子内不，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。（2 2）定点突变与化学修饰相结合）定点突变与化学修饰相结合 应用定点突变引入一些

49、非天然氨基酸侧链，再应用定点突变引入一些非天然氨基酸侧链，再运用化学修饰法对突变的氨基酸进行修饰。运用化学修饰法对突变的氨基酸进行修饰。（3 3）小分子修饰）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）（酶蛋白侧链基团修饰）通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有主要有氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。常见的重要修饰反应：常见的重要修饰反应：烷基化反应、酰化烷基化反应、酰化

50、反应、氧化还原反应、芳香环取代反应。反应、氧化还原反应、芳香环取代反应。（4 4）大分子修饰（大分子结合修饰）大分子修饰（大分子结合修饰）利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。能的方法。修饰剂：修饰剂：聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、右旋糖酐（）、右旋糖酐（dextrandextran）、肝素）、肝素（heparinheparin）、蔗糖聚合物（）、蔗糖聚合物（FicollFicoll）等。）等。修饰方法：修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结修