第五章-中药指纹图谱课件.ppt

1、第五章中药指纹图谱与特征图谱大纲要求掌握中药指纹图谱分析及评价掌握中药指纹图谱分析及评价熟悉中药指纹图谱研究程序及技术要求熟悉中药指纹图谱研究程序及技术要求了解中药指纹图谱测定方法了解中药指纹图谱测定方法同一个成药，疗效一致么？同一个成药，疗效一致么？不同厂家：不同厂家：不同工艺：不同工艺：不同辅料：不同辅料：Forsythiaside AForsythin 123青翘Immature Lianqiao老翘 mature Lianqiao老翘（无种子）Mature Lianqiao（without seeds)质量相差悬殊的质量相差悬殊的连翘连翘药材药材Great disparity of i

2、ngredients in different Lianqiao crude drugs青翘青翘老翘老翘无籽老翘所含有效成分递减无籽老翘所含有效成分递减相同处方，不同工艺，疗效？相同处方，不同工艺，疗效？min01020304050mAU02004006008001000120014001600 DAD1 B,Sig=254,16 Ref=360,100(SQ012-0201.D)cmin01020304050mAU020040060080010001200 DAD1 B,Sig=254,16 Ref=360,100(SQ013-0301.D)cmin01020304050mAU0100200

3、300400500600700 DAD1 B,Sig=254,16 Ref=360,100(SQXD010901.D)cmin01020304050mAU0100200300400500600700 DAD1 B,Sig=254,16 Ref=360,100(SQ011-0101.D)c第一节第一节 概述概述中药色谱指纹图谱的提出中药色谱指纹图谱的提出中药依赖其所含的多种化学成份发挥疗效中药依赖其所含的多种化学成份发挥疗效任何单一的活性成份或指标成份都难以有效地评任何单一的活性成份或指标成份都难以有效地评价中药的真伪优劣价中药的真伪优劣利用现代分析技术分析不同中（成）药的整体特利用现代分析技术

4、分析不同中（成）药的整体特征以提高鉴别的准确性征以提高鉴别的准确性第一节第一节 概述概述定义定义:中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药特性的的分析手段，得到的能够标示该中药特性的共有峰共有峰的的图谱，是一种新的中药质量控制模式。图谱，是一种新的中药质量控制模式。中药指纹图谱的基本属性：中药指纹图谱的基本属性：整体性和模糊性整体性和模糊性。整体性：强调多个成分（共有指纹峰）的相对稳定的比例、排列整体性：强调多个成分（共有指纹峰）的相对稳定的比例、排列顺序及相互的牵制，反映的质量信息是综合的。顺序及相互的牵制，反映的质

5、量信息是综合的。模糊性：中药化学成分复杂性模糊性：中药化学成分复杂性+次生代谢产物化学成分不确定性次生代谢产物化学成分不确定性，具有无法精密度量的模糊性。，具有无法精密度量的模糊性。中药特征图谱的提出中药特征图谱的提出定义定义:中药特征图谱是指中药经适当处理后，采用一定中药特征图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示的分析手段，得到的能够标示其中各种组分群特征其中各种组分群特征的的共有峰共有峰的图谱，是一种新的中药质量控制模式。的图谱，是一种新的中药质量控制模式。中药指纹图谱和中药特征图谱均以表征中药指纹图谱和中药特征图谱均以表征中药内在质量的整体变化为评价目的中药内在质量

6、的整体变化为评价目的 图谱分析：强调准确的辨认，而不是精密的计算。图谱分析：强调准确的辨认，而不是精密的计算。图谱比较：强调的是相似性，而不是相同。图谱比较：强调的是相似性，而不是相同。特点：特点：(1)通过指纹图谱或特征图谱的特征性，通过指纹图谱或特征图谱的特征性，能有效鉴别中药的真能有效鉴别中药的真伪伪。(2)通过指纹图谱或特征图谱主要特征峰的面积和比例的制定通过指纹图谱或特征图谱主要特征峰的面积和比例的制定，能有效控制中药质量，保证中药质量的相对稳定，能有效控制中药质量，保证中药质量的相对稳定（即稳定性和均一性即稳定性和均一性）。）。指纹图谱的作用指纹图谱的作用对中药质量标准的补充和提高

7、。对中药质量标准的补充和提高。控制原料、中间体、成品的一致性，控控制原料、中间体、成品的一致性，控制工艺，减少批间差异。制工艺，减少批间差异。指纹图谱的特性指纹图谱的特性稳定性（重现性）稳定性（重现性）特征性特征性在规定的方法与条件下，不同的操作者和在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能重复不同的实验室应能重复能反映中药能反映中药有效部位所有效部位所含大部分成含大部分成分的种类，分的种类，或指标成分或指标成分的全部的全部能特征地区能特征地区分中药的真分中药的真伪与优劣伪与优劣整体性（模糊性）整体性（模糊性）指纹图谱中应包含的信息指纹图谱中应包含的信息 中药材和中药饮片：中药材和中

8、药饮片：种的共性种的共性 产地、采收期、炮制方法的个性信息。产地、采收期、炮制方法的个性信息。半成品和中药制剂：半成品和中药制剂：原药材（甚至辅料）的信息原药材（甚至辅料）的信息 工艺信息等。工艺信息等。药效信息药效信息1.1.指纹图谱的发展阶段：指纹图谱的发展阶段：初级阶段初级阶段:是确立指纹图谱的建立方法及相似度是确立指纹图谱的建立方法及相似度判定。判定。研究重点主要是测定方法的建立，方法稳定性研究重点主要是测定方法的建立，方法稳定性和适用性考察，化学有效部分基础研究，图谱多指标和适用性考察，化学有效部分基础研究，图谱多指标控制等，力求基本说清中药化学基础及质量控制参数控制等，力求基本说清

9、中药化学基础及质量控制参数，将中药质量控制提到整体量化的高度。，将中药质量控制提到整体量化的高度。高级阶段高级阶段:即指纹图谱特征和药效相关性研即指纹图谱特征和药效相关性研 究，指纹图谱的生物等效性研究。究，指纹图谱的生物等效性研究。中药指纹图谱的研究向多学科的相互渗透、从单中药指纹图谱的研究向多学科的相互渗透、从单指标向多指标（多维多息）的综合发展，最终建立指标向多指标（多维多息）的综合发展，最终建立体现谱效关系的指纹图谱，确保中药安全、有效和体现谱效关系的指纹图谱，确保中药安全、有效和可控。可控。国内，目前还处在初级阶段。国内，目前还处在初级阶段。1.针对中药注射剂这一相对简单的体系，进行

10、大量研究和深入针对中药注射剂这一相对简单的体系，进行大量研究和深入探讨。探讨。2.利用指纹图谱手段表征中药注射剂的特性，表达成品的质量利用指纹图谱手段表征中药注射剂的特性，表达成品的质量，以达到控制工艺操作和原药材的目的，利用指纹图谱追寻，以达到控制工艺操作和原药材的目的，利用指纹图谱追寻工艺操作中的问题和实现对原药材工艺操作中的问题和实现对原药材GAP的质量要求。的质量要求。3.通过对大量注射剂的指纹图谱研究，建立系统的测定方法和通过对大量注射剂的指纹图谱研究，建立系统的测定方法和全面的指标控制参数，寻找一定的数学模型，最终达到指纹全面的指标控制参数，寻找一定的数学模型，最终达到指纹图谱的可

11、操作，可控，稳定，显性和量化的目的，提高整个图谱的可操作，可控，稳定，显性和量化的目的，提高整个中药注射剂的质量控制水平。中药注射剂的质量控制水平。4.逐步建立其它类中药制剂，中药复方制剂的指纹图谱。逐步建立其它类中药制剂，中药复方制剂的指纹图谱。2.指纹图谱的分类指纹图谱的分类指纹图谱可按应用对象、测定手段进行不同的分类。指纹图谱可按应用对象、测定手段进行不同的分类。按应用对象分类：按应用对象分类：中药材中药材(原料药材原料药材)指纹图谱指纹图谱中药原料药中药原料药(包括饮片、配伍颗粒包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱指纹图谱中药中间体（工艺生产过程中间产物）指纹图谱中药中间体（工艺生产过程中间产

12、物）指纹图谱中药制剂指纹图谱中药制剂指纹图谱 按测定方法分类按测定方法分类:中药化学指纹图谱中药化学指纹图谱 指纹图谱系指采用色谱、光谱和其他分析方法建指纹图谱系指采用色谱、光谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。中药立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。中药化学指纹图谱对控制中药质量具有更直接、更重要的化学指纹图谱对控制中药质量具有更直接、更重要的意义。意义。色谱指纹图谱：色谱指纹图谱：TLC、GC、GC-MS、HPLC、HPLC-MS等等光谱指纹图谱：光谱指纹图谱：UV、IR、FP、NMR、MS等等中药生物指纹图谱中药生物指纹图谱包括：中药材包括：中药材DNA指纹

13、图谱指纹图谱 中药基因组学指纹图谱中药基因组学指纹图谱 中药蛋白组学指纹图谱中药蛋白组学指纹图谱 中药材中药材DNA指纹图谱主要是测定各种中药材的指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱，图谱，由于每个物种基因的唯一性和遗传性由于每个物种基因的唯一性和遗传性，中药材，中药材DNA指纹图谱指纹图谱可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它对中药材对中药材GAP基地建设、中药材种植规范基地建设、中药材种植规范(SOP)、选择优良种、选择优良种质资源和药材道地性研究极为有用。质资源和药材道地性研究极为有用。中药基因组学图谱和中药蛋白组学指

14、纹图谱系指中药基因组学图谱和中药蛋白组学指纹图谱系指用中药作用于某特定细胞或动物后，引起的基因用中药作用于某特定细胞或动物后，引起的基因和蛋白的复杂的变化情况，这两种指纹图谱可称和蛋白的复杂的变化情况，这两种指纹图谱可称为为生物活性指纹图谱。生物活性指纹图谱。中药蛋白组学指纹图谱是指纹图谱研究的最高级中药蛋白组学指纹图谱是指纹图谱研究的最高级阶段，可确定中药的主要活性物质。阶段，可确定中药的主要活性物质。第二节第二节 中药指纹图谱研究程序及技术要求中药指纹图谱研究程序及技术要求（一）指纹图谱的要求（一）指纹图谱的要求 中药指纹图谱应满足特征性、重现性和可操作性的中药指纹图谱应满足特征性、重现性

15、和可操作性的技术要求（即三性要求）。技术要求（即三性要求）。当一张指纹图谱不足以表现其全部特征，当一张指纹图谱不足以表现其全部特征，可用几张可用几张指纹图谱指纹图谱来表现某种中药来表现某种中药(药材或复方药材或复方)的各个不同的各个不同侧面的特征，从而构成其全貌。对每一张图谱都应侧面的特征，从而构成其全貌。对每一张图谱都应有其特征性。有其特征性。丹参滴丸多元丹参滴丸多元HPLC指纹图谱指纹图谱 min5101520253035mAU0501001502002503001 2 3 4 5 6 7 8 9 10 min10203040506070mAU-500501001502001 2 3 4

16、6 8 5 7 9 10 12 14 165 17 18 11 13 15(A)(B)指纹图谱指纹图谱I(280nm)指纹图谱指纹图谱II(203nm)首先具备专属性或唯一性。能够表达某品种特征首先具备专属性或唯一性。能够表达某品种特征的性质。的性质。在满足专属性前提下要有较好的重现性，指同一在满足专属性前提下要有较好的重现性，指同一品种的同一样品，同一操作条件下，结果的重现品种的同一样品，同一操作条件下，结果的重现性要好，即不同实验室和不同操作者得到的色谱性要好，即不同实验室和不同操作者得到的色谱整体特征应有较高的相似度整体特征应有较高的相似度(0.9以上以上)。具有可操作性。指针对不同用途

17、，选用不同分析具有可操作性。指针对不同用途，选用不同分析方法来达到不同的要求，选择的方法和试验条件方法来达到不同的要求，选择的方法和试验条件应便于推广和便于操作，要有普遍适用性。应便于推广和便于操作，要有普遍适用性。（二）指纹图谱的构建方法（二）指纹图谱的构建方法1、色谱法、色谱法 色谱技术具有极强的分离能力和极大的适应性，色谱技术具有极强的分离能力和极大的适应性，中药指纹图谱首推色谱法中药指纹图谱首推色谱法，其常用的方法有：，其常用的方法有：TLC、GC、HPLC、HPCE、SFC等。等。诃子指纹图谱诃诃 子子小诃子小诃子大诃子大诃子绒毛诃子绒毛诃子肉桂油的气相色谱指纹图谱肉桂油的气相色谱指

18、纹图谱HPCE指指纹纹图图谱谱操作简便（不需要复杂的提取操作简便（不需要复杂的提取仪器）、快速、准确、经济、仪器）、快速、准确、经济、溶剂低毒、重复性高、实用性溶剂低毒、重复性高、实用性强。强。中国药典规定：小中国药典规定：小蓟在开花时采。蓟在开花时采。根据根据1384cm-1处吸处吸收峰的有无，可以收峰的有无，可以鉴别其采集时间是鉴别其采集时间是否正确。否正确。小蓟丁酮提取物的红外小蓟丁酮提取物的红外指纹图谱指纹图谱中药指纹图谱中药指纹图谱供试品溶液供试品溶液10批以上中药批以上中药图谱信息图谱信息固定产地、采收期固定产地、采收期和加工炮制的中药和加工炮制的中药中药未中药未知检品知检品预处理

19、预处理不同产地、采收期不同产地、采收期和加工炮制的中药和加工炮制的中药评价标准评价标准药效学试验药效学试验代表性代表性均一性均一性选择测试条件选择测试条件方法建立考察方法建立考察测定图谱参数测定图谱参数图谱分析图谱分析相关性相关性图图谱谱评评价价图谱测试、相似度评价图谱测试、相似度评价方法检验方法检验中药指纹图谱的研究程序中药指纹图谱的研究程序一、研究方案设计一、研究方案设计 1 1、研究对象的确定、研究对象的确定 君药、臣药中有效成分作为主要研究对象君药、臣药中有效成分作为主要研究对象2、研究内容、研究内容样品收集：要求有一定的数量，以保证供试品的代表性和样品收集：要求有一定的数量，以保证供

20、试品的代表性和均一性均一性溶液的制备：包括对照品溶液和供试品溶液的制备。溶液的制备：包括对照品溶液和供试品溶液的制备。检测方法确立：包括测定方法、供试品溶液制备的提取条检测方法确立：包括测定方法、供试品溶液制备的提取条件、测定条件等筛选。件、测定条件等筛选。方法学考察试验：包括精密度试验、稳定性试验、重复性方法学考察试验：包括精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及图谱采集记录时间的考察试验。试验以及图谱采集记录时间的考察试验。标准制定标准制定：根据多批次样品测定图谱，建立共有模式，制：根据多批次样品测定图谱，建立共有模式，制定评价指标等。定评价指标等。二、样品收集二、样品收集 样品收集是研究指

21、纹图谱最初也是最关键的步骤，收样品收集是研究指纹图谱最初也是最关键的步骤，收集的样品要集的样品要有足够的代表性有足够的代表性。要求收集。要求收集10批次以上批次以上的的样品。样品数越多越好，使得到的指纹图谱更具生物样品。样品数越多越好，使得到的指纹图谱更具生物统计学意义。统计学意义。最关键的步骤最关键的步骤 真实性真实性 代表性代表性10批以上批以上 原药材原药材：不同产地、不同采收季节等：不同产地、不同采收季节等 样品收集原则：样品收集原则：1）正品优质道地药材，或规范化种植药材。）正品优质道地药材，或规范化种植药材。2）结合临床使用情况选择性收集药材样品。）结合临床使用情况选择性收集药材样

22、品。3）不同产地、不同采收期药材样品）不同产地、不同采收期药材样品（指导实际合（指导实际合理理“勾兑勾兑”过程）过程）。4）中间体、中药制剂的样品收集，应选择工艺稳）中间体、中药制剂的样品收集，应选择工艺稳定、疗效恒定、临床使用中很少异常的批次。定、疗效恒定、临床使用中很少异常的批次。注意：注意：收集药材样品收集药材样品“批次批次”，其含义与工业产品，其含义与工业产品“批次批次”的含义是完全不同的，的含义是完全不同的，它是指相互独立的样品，即不它是指相互独立的样品，即不能将同一地点或同一渠道同一时间获得的样品分成若干能将同一地点或同一渠道同一时间获得的样品分成若干批次样品批次样品。不同产地或同

23、一产地不同等级规格的样品，均可视作不不同产地或同一产地不同等级规格的样品，均可视作不同批次。同批次。同一产地的样品，存在不同的种植园和地块之差异，也同一产地的样品，存在不同的种植园和地块之差异，也均可视作不同批次。均可视作不同批次。三、供试品溶液的制备三、供试品溶液的制备 根据中药中所含化学成分的理化性质和检测方法的要根据中药中所含化学成分的理化性质和检测方法的要求，选择适宜的制备方法。求，选择适宜的制备方法。制备方法必须确保中药中制备方法必须确保中药中的主要化学成分或有效成分在指纹图谱中得以体现。的主要化学成分或有效成分在指纹图谱中得以体现。原药材、饮片供试品溶液的制备原药材、饮片供试品溶液

24、的制备 尽可能与生产工艺的提取溶剂接近或一致，定量操作 半成品半成品/中间体供试品溶液的制备中间体供试品溶液的制备 参考制剂和产品制备工艺 中药制剂供试品溶液的制备中药制剂供试品溶液的制备 直接使用、稀释或溶剂提取的方式四、四、对照品对照品(参照物参照物)溶液制备溶液制备 建立指纹图谱应设立参照物或参照峰。建立指纹图谱应设立参照物或参照峰。对照品作为参照物：常为供试品中主要成分对照品作为参照物：常为供试品中主要成分 或者峰面积相对较大、较稳定的共有峰（内参物）或者峰面积相对较大、较稳定的共有峰（内参物）制备：根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备：根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。五

25、、研究方法的选择五、研究方法的选择 包括指纹图谱试验方法和试验条件的优选，是包括指纹图谱试验方法和试验条件的优选，是通过通过比较试验比较试验，从中选取相对简单易行的方法和条件，从中选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和可操作性的要求，并须经过方谱的专属性、重现性和可操作性的要求，并须经过方法学验证。法学验证。首选色谱方法，其中首选色谱方法，其中HPLC法适用范围广，对含生物法适用范围广，对含生物碱、蒽醌、黄酮、有机酸、酚类、木脂素等成分的中药均碱、蒽醌、黄酮、有机酸、酚类、木脂素等成分的中药均

26、可采用。可采用。(一一)测定条件的选择测定条件的选择 提取条件、色谱条件需进行优化，提取条件、色谱条件需进行优化，在定量操作的前提下在定量操作的前提下，使供试品中所含成分尽可能地被提取并获得分离，即，使供试品中所含成分尽可能地被提取并获得分离，即分分得的色谱峰越多越好得的色谱峰越多越好，使中药的内在特性都显现出来，为，使中药的内在特性都显现出来，为中药指纹图谱评价及其品质鉴定提供足够的信息。中药指纹图谱评价及其品质鉴定提供足够的信息。液相色谱液相色谱 色谱柱：比较试验加以选择色谱柱：比较试验加以选择流动相比较流动相比较流动相流动相 1 1流动相流动相 2 2流动相流动相 3 3适宜的柱温和检测

27、波长适宜的柱温和检测波长1520253035203210236254365(二二)方法学验证方法学验证1.精密度试验：精密度试验：主要考察仪器的精密度主要考察仪器的精密度。取同一供试品溶液，取同一供试品溶液，连续进样连续进样5次以上次以上进行检测，进行检测，各共有峰峰面积比值的各共有峰峰面积比值的RSD3，各共有峰的相对保留时间应在平均相对，各共有峰的相对保留时间应在平均相对保留时间保留时间1min内内。或用或用“中药指纹图谱相似度计中药指纹图谱相似度计算软件算软件”计算，相似度应大于计算，相似度应大于0.9。2.稳定性试验：稳定性试验：主要考察供试品的稳定性。主要考察供试品的稳定性。取取同一

28、供试品溶液，分别在不同时同一供试品溶液，分别在不同时间检测间检测（0、1、2、4、8、12、24、36、48h），），考察色谱峰的考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一相对保留时间、峰面积比值的一致性，确定检测时间。致性，确定检测时间。或用或用“中中药指纹图谱相似度计算软件药指纹图谱相似度计算软件”计计算，相似度应大于算，相似度应大于0.9。3.重复性试验：重复性试验：主要考察实验方法的重复性。主要考察实验方法的重复性。取同一批号的样取同一批号的样品品5份以上份以上，分别按照选定的提取分离方法制备供，分别按照选定的提取分离方法制备供试品溶液，并在选定的色谱条件下进行检测，试品溶液，并在选定的

29、色谱条件下进行检测，各各共有峰峰面积比值的共有峰峰面积比值的RSD3，各共有峰的相对，各共有峰的相对保留时间应在平均相对保留时间保留时间应在平均相对保留时间1min以内。以内。或或用用“中药指纹图谱相似度计算软件中药指纹图谱相似度计算软件”计算，相似计算，相似度应大于度应大于0.9。4.指纹图谱的记录时间考察：指纹图谱的记录时间考察：如采用如采用HPLC或或GC法法一般为一般为60min。但。但实验中，应记录实验中，应记录2小时的色谱图，考察小时的色谱图，考察1小时小时以后的色谱峰情况，以确定记录时间。以后的色谱峰情况，以确定记录时间。指纹图谱的建立指纹图谱的建立 根据足够样品数（根据足够样品

30、数（10批次以上）测试结果所给出的批次以上）测试结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（保留时间）等相峰数、峰值（积分值）和峰位（保留时间）等相关参数，确定共有指纹峰（相对保留时间、峰面关参数，确定共有指纹峰（相对保留时间、峰面积比值），选取特征指纹峰群（色谱峰组合），积比值），选取特征指纹峰群（色谱峰组合），制定指纹图谱。采用阿拉伯数字标示共有峰，制定指纹图谱。采用阿拉伯数字标示共有峰，用用“S”标示参照物峰。标示参照物峰。中药材指纹图谱要对不同产地、不同等级规格中药材指纹图谱要对不同产地、不同等级规格或不同采收季节等的代表性样品进行分析比较，或不同采收季节等的代表性样品进行分析比较，从中从

31、中归纳出中药材共有的、峰面积相对稳定的色谱峰作为归纳出中药材共有的、峰面积相对稳定的色谱峰作为特征指纹峰。特征指纹峰。对于多来源的中药材，必须考察品种间对于多来源的中药材，必须考察品种间的特异性。的特异性。中药制剂指纹图谱的建立，要将原药材、半成品、中药制剂指纹图谱的建立，要将原药材、半成品、成品之间的图谱进行比较，考察相互之间的相关性。成品之间的图谱进行比较，考察相互之间的相关性。指纹图谱的辨认应注意指纹特征的整体性，从指纹图谱的辨认应注意指纹特征的整体性，从整体的角度综合考虑，注意各具有指纹意义的谱峰整体的角度综合考虑，注意各具有指纹意义的谱峰之间相互的依存关系。之间相互的依存关系。指纹图

32、谱的评价指标是供试品指纹图谱与该品指纹图谱的评价指标是供试品指纹图谱与该品种对照用指纹图谱种对照用指纹图谱(共有模式共有模式)及供试品之间指纹图及供试品之间指纹图谱的相似性。谱的相似性。相似性比较可以用相似性比较可以用“相似度相似度”表达，一般指纹图表达，一般指纹图谱相似度计算结果在谱相似度计算结果在0.91.0(或以或以90100表示表示)之间之间即符合要求。即符合要求。指纹图谱的相似性从两个方面考虑指纹图谱的相似性从两个方面考虑:色谱的整体面貌是否相似，以判断样品的真实性；色谱的整体面貌是否相似，以判断样品的真实性；供试品与对照样品或供试品与对照样品或“对照用指纹图谱对照用指纹图谱”之间及

33、不之间及不同批次样品指纹图谱之间同批次样品指纹图谱之间总积分值作量化比较总积分值作量化比较，如，如总积分面积相差较大总积分面积相差较大(如如20%)，则说明同样量的，则说明同样量的样品含有的内在物质有较明显的样品含有的内在物质有较明显的“量量”的差异，这的差异，这种差异是否允许，应视具体品种、具体工艺的实际种差异是否允许，应视具体品种、具体工艺的实际情况，并结合含量测定项目综合判断。情况，并结合含量测定项目综合判断。这种比较应这种比较应在同一台仪器平行进行测定。在同一台仪器平行进行测定。根据指纹图谱所获取的信息，建立指纹图谱分根据指纹图谱所获取的信息，建立指纹图谱分析比较的重要参数，如共有峰、

34、重叠率、析比较的重要参数，如共有峰、重叠率、n强峰、特强峰、特征指纹等；计算特征指纹的相似率与差异率，进行指征指纹等；计算特征指纹的相似率与差异率，进行指纹图谱评价；应用纹图谱评价；应用相似度分析相似度分析、主成分分析、聚类分、主成分分析、聚类分析或人工神经网络等计算机技术，进行解析、识别图析或人工神经网络等计算机技术，进行解析、识别图谱信息以及图谱相似度评价，以建立可行、实用的中谱信息以及图谱相似度评价，以建立可行、实用的中药指纹图谱量化评价标准。药指纹图谱量化评价标准。（一）重要参数的建立（一）重要参数的建立 1.共有指纹峰共有指纹峰 中药指纹图谱中，中药指纹图谱中，多个样品所具有的相同相

35、对保留值的色多个样品所具有的相同相对保留值的色谱峰，谱峰，即为共有指纹峰。即为共有指纹峰。(1)共有指纹峰的相对保留时间：共有指纹峰的相对保留时间：相对保留时间相对保留时间=tR/tRs。12345678910没食子酸大黄素图图5-2 大黄大黄HPLC指纹图谱指纹图谱(2)共有指纹峰面积比值：共有指纹峰面积比值：指纹峰面积比值指纹峰面积比值=A/As 各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。未达基线分离的共有峰，以该组峰的总峰面积未达基线分离的共有峰，以该组峰的总峰面积计，同时标定该组各峰的相对保留时间。计，同时标定该组各峰的相对保留时间。非共有峰：非共有峰：供

36、试品的图谱与指纹图谱比较，共有指纹供试品的图谱与指纹图谱比较，共有指纹峰以外的相对保留值不同的色谱峰。峰以外的相对保留值不同的色谱峰。特征指纹峰特征指纹峰 所有供试品图谱中均存在的色谱峰所有供试品图谱中均存在的色谱峰，可以认为可以认为它们是它们是该中药品种所特有该中药品种所特有，故又称之为故又称之为特征指纹峰特征指纹峰。特征指纹特征指纹是指由是指由一系列特征指纹峰所组成的固定一系列特征指纹峰所组成的固定峰群峰群，从多组分的角度来反映中药内在特征，从多组分的角度来反映中药内在特征，为原药为原药材或饮片品种鉴定，特别是同属不同种或含相同有效材或饮片品种鉴定，特别是同属不同种或含相同有效成分不同种的

37、药材的鉴别成分不同种的药材的鉴别，提供更多更细致的信息和，提供更多更细致的信息和依据。依据。要求要求“准确的辨认准确的辨认”而不是而不是“精密的测量精密的测量”；比较供试品与对照品的色谱指纹图谱要求比较供试品与对照品的色谱指纹图谱要求“相似相似”而不是而不是“相同相同”。评价色谱比较的结果，是根据其模糊属性，着眼于评价色谱比较的结果，是根据其模糊属性，着眼于宏观的规律性的特征分析，即着重辨认完整色谱的宏观的规律性的特征分析，即着重辨认完整色谱的“图貌图貌”，而不是求索细枝末节。，而不是求索细枝末节。计算机辅助相似度评价计算机辅助相似度评价第三节第三节 中药指纹图谱研究实例中药指纹图谱研究实例例

38、例1 中药大黄指纹图谱研究中药大黄指纹图谱研究(一一)基源基源 为蓼科植物掌叶大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum Palmatum L.、唐古特大黄、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。的干燥根及根茎。(二二)产地产地 掌叶大黄主产于甘肃、青海、西藏、四川等地；唐古特大掌叶大黄主产于甘肃、青海、西藏、四川等地；唐古特大黄主产于青海、甘肃、西藏及四川等地。二者商品均称为黄主产于青海、甘肃、西藏及四川等地。二者商品均称为“西西大黄大黄”、“北大黄北大黄”。药用大黄主产于四川、贵州、云

39、南、湖。药用大黄主产于四川、贵州、云南、湖北、陕西等地，商品称为北、陕西等地，商品称为“南大黄南大黄”、“川大黄川大黄”。商品以掌。商品以掌叶大黄产量大，唐古特大黄次之，药用大黄少见。叶大黄产量大，唐古特大黄次之，药用大黄少见。据产地考察及调查，甘肃庄浪、礼县大黄种植面积约据产地考察及调查，甘肃庄浪、礼县大黄种植面积约6666.67km2，年产量约，年产量约5万吨，资源十分丰富。万吨，资源十分丰富。甘肃主产区大黄资源分布图甘肃主产区大黄资源分布图 (三三)化学成分化学成分 主含蒽醌类成分：大黄酸主含蒽醌类成分：大黄酸(rhein)、大黄素、大黄素(emodin)、大黄、大黄酚酚(chrysop

40、hanol)、芦荟大黄素、芦荟大黄素(aloe-emodin)、大黄素甲醚、大黄素甲醚(physcion)、番泻苷、番泻苷A、B、C、D、E、F(sennoside A、B、C、D、E、F)、大黄酸、大黄酸-8-葡萄糖苷葡萄糖苷(rhein-8-mono-D-glucoside)、大黄素甲醚葡萄糖苷、大黄素甲醚葡萄糖苷(physcion monoglucoside)、芦荟大黄素葡萄糖苷、芦荟大黄素葡萄糖苷(aloe-emodin monoglucoside)、大黄、大黄素葡萄糖苷素葡萄糖苷(emodin monoglucoside)、大黄酚、大黄酚-1-葡萄糖苷葡萄糖苷(chrysophano

41、l-1-monoglucoside)。还含苯丁酮苷类、鞣质及。还含苯丁酮苷类、鞣质及相关的多元酚类等成分。相关的多元酚类等成分。(四四)实验仪器和材料实验仪器和材料仪器仪器:Agilent1100液相色谱仪，液相色谱仪，DAD检测器；检测器；样品样品:大黄采自甘肃省华亭、庄浪、礼县、宕昌四县，共大黄采自甘肃省华亭、庄浪、礼县、宕昌四县，共15份份样品，采集时间为样品，采集时间为2001年年11月，经品种鉴定为掌叶大黄。月，经品种鉴定为掌叶大黄。对照品对照品:没食子酸没食子酸(gallic acid)、大黄素、大黄素(emodin)均由中国药品均由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，纯度分

42、别为生物制品检定所提供，供含量测定用，纯度分别为98.14%、99.02%。试剂试剂:乙腈（美国乙腈（美国Tedia公司，色谱纯）、甲醇（上海化学试剂公司，色谱纯）、甲醇（上海化学试剂有限公司，分析纯；有限公司，分析纯；Tedia公司，色谱纯）、冰醋酸（南京公司，色谱纯）、冰醋酸（南京化学试剂一厂，分析纯）、重蒸去离子水（实验室制备）。化学试剂一厂，分析纯）、重蒸去离子水（实验室制备）。(五五)供试品溶液制备供试品溶液制备 精密称取大黄供试品粉末精密称取大黄供试品粉末(过过20目筛目筛)2g，加入甲醇，加入甲醇50ml，水浴，水浴(80)加热回流加热回流1h，滤过。残渣加甲醇，滤过。残渣加甲醇

43、50ml，水浴，水浴(80)加热回流加热回流1h，滤过，合并两次滤液。置蒸发皿中，滤过，合并两次滤液。置蒸发皿中，水浴挥去部分溶剂，加甲醇溶解并定容至水浴挥去部分溶剂，加甲醇溶解并定容至25ml。用微孔滤。用微孔滤膜（孔径为膜（孔径为0.45m）滤过，滤液作为供试品溶液。）滤过，滤液作为供试品溶液。(六六)参照物溶液制备参照物溶液制备 精密称取没食子酸、大黄素对照品各精密称取没食子酸、大黄素对照品各5mg，用甲醇溶解，用甲醇溶解并定容至并定容至25ml，配成，配成0.2mg/ml的溶液，再将该溶液稀释的溶液，再将该溶液稀释10倍，作为参照物溶液。倍，作为参照物溶液。(七七)色谱条件色谱条件 色

44、谱柱色谱柱:Inertsil ODS-3分析柱分析柱(250mm 4.6mm，5m)流动相流动相:(A)1%HAc-H2O与与(B)1%HAc-CH3CN梯度洗脱梯度洗脱 055min B（）（）025 5575min B（）（）2555 7590min B（）（）5585 流量流量:1.0ml/min 柱温柱温:30 检测波长检测波长:280nm 参比波长参比波长:380nm 分析时间分析时间:90min (八八)方法学考察方法学考察 1.精密度试验精密度试验 取同一批次供试品（取同一批次供试品（9号样品：庄浪大黄），连续进样号样品：庄浪大黄），连续进样5次次，考察色谱峰相似度的一致性，用，

45、考察色谱峰相似度的一致性，用“中药指纹图谱相似度计中药指纹图谱相似度计算软件算软件”计算，结果相似度大于计算，结果相似度大于0.9，表明仪器精密度良好。，表明仪器精密度良好。2.重复性试验重复性试验 取同一批次样品（取同一批次样品（9号样品：庄浪大黄），按上法分别制备号样品：庄浪大黄），按上法分别制备5份供试品，平行测定，考察色谱峰相似度的一致性，用份供试品，平行测定，考察色谱峰相似度的一致性，用“中中药指纹图谱相似度计算软件药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度大于计算，结果相似度大于0.9，表，表明实验重复性良好。明实验重复性良好。3.稳定性试验稳定性试验 取同一批次供试品溶液（取同一

46、批次供试品溶液（9号样品：庄浪大黄），分别在号样品：庄浪大黄），分别在0，2，4，7，11，16，22，29，36h不同时间点进行检测，用不同时间点进行检测，用“中药指纹图谱相似度计算软件中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度大于计算，结果相似度大于0.9，表明供试品在，表明供试品在36h内稳定。内稳定。(九九)供试品溶液测定供试品溶液测定 同一上述实验条件，测定同一上述实验条件，测定10批次供试品批次供试品HPLC色谱图。色谱图。(十十)指纹图谱及技术参数指纹图谱及技术参数 1.指纹图谱的建立指纹图谱的建立 根据根据10批次供试品溶液测定结果所给出的峰数、批次供试品溶液测定结果所给出的

47、峰数、峰值（积分值）和峰位（相对保留时间）等相关参峰值（积分值）和峰位（相对保留时间）等相关参数，进行分析比较，制定优化大黄指纹图谱。见图数，进行分析比较，制定优化大黄指纹图谱。见图5-2，彩图，彩图5。12345678910没食子酸大黄素彩图彩图5 大黄三维大黄三维HPLC指纹图谱指纹图谱 2.共有指纹峰的保留时间及峰面积共有指纹峰的保留时间及峰面积 大黄大黄HPLC可分离出约可分离出约90个色谱峰，经与参照物对照以及个色谱峰，经与参照物对照以及比较所有测定记录的色谱图，选取其中比较所有测定记录的色谱图，选取其中10个共有峰作为指个共有峰作为指纹图谱的特征峰。其保留时间（纹图谱的特征峰。其保

48、留时间（min）、峰面积见下表：）、峰面积见下表：峰序号峰序号12345保留时间保留时间7.25 8.95 18.04 30.77 42.54 峰面积峰面积965.14207.61898.255824.058354.54峰序号峰序号678910保留时间保留时间51.6152.6553.0660.7176.44峰面积峰面积972.54201.89 2852.43 1336.58 229.68 3.共有指纹峰标定共有指纹峰标定 根据根据10批次供试品溶液测定结果，标定共有指纹峰。大黄批次供试品溶液测定结果，标定共有指纹峰。大黄HPLC指纹图谱中，共有指纹峰指纹图谱中，共有指纹峰10个。与大黄素参照

49、物个。与大黄素参照物S峰峰（10号峰）相比，其他号峰）相比，其他9个共有指纹峰相对保留时间依次为个共有指纹峰相对保留时间依次为：0.095(1)、0.117(2)、0.2369(3)、0.403(4)、0.557(5)、0.675(6)、0.689(7)、0.694(8)、0.794(9)。4.共有指纹峰面积比共有指纹峰面积比 4、5号共有指纹峰面积为共有指纹峰总峰面积的号共有指纹峰面积为共有指纹峰总峰面积的65%，规，规定定4号峰相对峰面积比值为号峰相对峰面积比值为13.736025.5096。5号峰相对峰面号峰相对峰面积比值为积比值为19.704136.5933。5.相似度评价相似度评价

50、将测试数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，经选峰，将测试数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，经选峰，设定匹配模板，将谱峰自动匹配；然后设定标准模板，进行设定匹配模板，将谱峰自动匹配；然后设定标准模板，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。掌叶大黄谱峰差异性评价和整体相似性评价。掌叶大黄HPLC指纹谱指纹谱共有模式如图共有模式如图5-3；华亭、庄浪、礼县、宕昌四地样品的相；华亭、庄浪、礼县、宕昌四地样品的相似度较高，大多在似度较高，大多在0.850.95之间，说明四地大黄之间既有较之间，说明四地大黄之间既有较好的相关性，又有区别。好的相关性，又有区别。图图5-3 掌叶大黄掌叶大黄HPLC指纹谱共有