血红蛋白的提取和分离-ppt课件(同名36).ppt

1、课题课题3血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离课标领航课标领航1概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理。的基本原理。2能根据凝胶色谱过程中的现象和结果，能根据凝胶色谱过程中的现象和结果，评价实验操作的过程是否规范，分析实验结评价实验操作的过程是否规范，分析实验结果。果。3尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本过程和方法。过程和方法。【重点重点】凝胶色谱法、电泳法基本原理。凝胶色谱法、电泳法基本原理。【难点难点】实验操作的过程及分析。实验操作的过程

2、及分析。情境导引情境导引为年老多病的人注射丙种为年老多病的人注射丙种球蛋白，可以在一定程度上增强球蛋白，可以在一定程度上增强其身体的抵抗力。在动物体内，其身体的抵抗力。在动物体内，丙种球蛋白和许多蛋白质混合丙种球蛋白和许多蛋白质混合在一起。要获得纯净的丙种球蛋在一起。要获得纯净的丙种球蛋白制品，就必须进行提取和分离。白制品，就必须进行提取和分离。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种

3、分子的分离。分子的分离。基础自主梳理基础自主梳理一、凝胶色谱法一、凝胶色谱法1概念：也称作分配色谱法，是根据概念：也称作分配色谱法，是根据_质量的大小分离蛋白质的有效方法。质量的大小分离蛋白质的有效方法。2原理原理(1)由微小的多孔球体构成的凝胶，内部有许多贯由微小的多孔球体构成的凝胶，内部有许多贯穿的通道。穿的通道。相对分子相对分子(2)由相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对由相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量分子质量_的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大的路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大的蛋白

4、质无法进入凝胶内部的通道，只能在蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在_移动，路程较短，移动速度较快，从而使相对分子移动，路程较短，移动速度较快，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。质量不同的蛋白质分子得以分离。二、缓冲溶液二、缓冲溶液1作用：在一定范围内，抵制外界的作用：在一定范围内，抵制外界的_对溶对溶液液pH的影响，维持的影响，维持pH基本不变。基本不变。较小较小凝胶外部凝胶外部酸和碱酸和碱2配制：由配制：由12种缓冲剂溶解于水中配制而成，种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的通过调节缓冲剂的_就可以得到不同就可以得到不同pH范范围内使用的缓冲液。围内使用的缓冲液。三、电泳三

5、、电泳1概念：指概念：指_在电场的作用下发生迁移的在电场的作用下发生迁移的过程。过程。2原理：在一定的原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_的的电极移动。电极移动。使用比例使用比例带电粒子带电粒子相反相反3作用：电泳利用了待分离样品中各种分子带电作用：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、性质的差异及分子本身的大小、_的不同，使带的不同，使带电分子产生不同的电分子产生不同的_，从而实现样

6、品中，从而实现样品中各种分子的分离。各种分子的分离。4方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。丙烯酰胺凝胶电泳。四、实验操作四、实验操作1样品处理：通过样品处理：通过_、_、分离血红蛋白溶液等操作、分离血红蛋白溶液等操作收集血红蛋白溶液。收集血红蛋白溶液。(1)红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。分离时采取红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。分离时采取低速短时间离心，直至上清液中没有黄色，表明红低速短时间离心，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。细胞已洗涤干净。形状形状迁移速度迁移速度红细胞的洗涤红细胞的洗涤血红蛋白的释放血红蛋白的释放

7、思考感悟思考感悟1洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水？水？【提示】【提示】生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前，而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。(2)血红蛋白的释放：在蒸馏水和血红蛋白的释放：在蒸馏水和_的作的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。甲苯甲苯思考感悟思考感悟2在血红蛋白释

8、放过程中，加入蒸馏水和甲苯的在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？目的是什么？【提示】【提示】(1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。(2)细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：把搅拌好的混合液离心后分离血红蛋白溶液：把搅拌好的混合液离心后,将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透于分液漏斗中静置片刻后，分离出下

9、层的红色透明液体。明液体。2粗分离：即透析粗分离：即透析(1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋方法：将血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入一定量适宜浓度的放入一定量适宜浓度的_中，透析中，透析12h.(2)目的：将样品中分子较小的杂质除去。目的：将样品中分子较小的杂质除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。子物质保留在袋内。磷酸缓冲液磷酸缓冲液3纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：杂质蛋白除去。操作如下：(1)凝胶色谱柱的制作。凝胶色谱柱的制作。(2

10、)凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填材料：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。材料：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。方法：凝胶用方法：凝胶用_充分溶胀后，配成凝胶悬充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有_存存在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。(3)样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱a.准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与的缓冲液缓慢下降到与_平齐，关闭出口。平齐，关闭出口。蒸馏水蒸馏水气泡气泡凝胶面凝胶面b加样：用吸管小心地将加样：用吸管

11、小心地将1mL透析后的样品加到透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。c加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内.洗脱：加入洗脱：加入_，打开下端出口，进行，打开下端出口，进行洗脱。洗脱。4纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。五、操作提示五、操作提示1红细胞的洗涤：洗涤次数、红细胞的洗涤：洗涤次数、_与离心时与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白：间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白：离心速度过高和时间过长会

12、使离心速度过高和时间过长会使_等一同沉淀，等一同沉淀，达不到分离效果。达不到分离效果。磷酸缓冲液磷酸缓冲液离心速度离心速度白细胞白细胞2色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用_加热，加速膨胀。加热，加速膨胀。3凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。次序，降低分离效果。4蛋白质的分离：如果红色区带蛋白质的分离：如果红色区带_地地移动，说

13、明色谱柱制作成功。移动，说明色谱柱制作成功。沸水浴沸水浴均匀一致均匀一致核心要点突破核心要点突破解读实验原理解读实验原理1蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析相对分子质量大相对分子质量大相对分子质量小相对分子质量小直径大小直径大小大于凝胶颗粒空隙直大于凝胶颗粒空隙直径径小于凝胶颗粒空隙直小于凝胶颗粒空隙直径径运动方式运动方式垂直向下运动垂直向下运动无规则的扩散运动无规则的扩散运动运动速度运动速度较快较快较慢较慢运动路程运动路程较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先从凝胶柱中洗脱出先从凝胶柱中洗脱出来来后从凝柱中洗脱出来后从凝柱中洗脱出来2.电泳方法电泳方法琼脂糖凝胶电泳

14、琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳由于琼脂糖本身不带电由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中荷，各种分子在电场中迁移速率决定于所带电迁移速率决定于所带电荷性质的差异及分子的荷性质的差异及分子的大小、形状不同大小、形状不同在凝胶中加入在凝胶中加入SDS，使，使蛋白质解聚成单链，与蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白各种蛋白质形成蛋白质质SDS复合物，使其复合物，使其迁移速率完全取决于分迁移速率完全取决于分子的大小子的大小(2011年聊城高二检测年聊城高二检测)有关凝胶色谱法和有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是电泳法的说法正确的是()A它们都是分离蛋白质的重要方法它们都是分离

15、蛋白质的重要方法B它们的原理相同它们的原理相同C使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要需要D以上说法都正确以上说法都正确【尝试解答】【尝试解答】_A_【解析】【解析】凝胶色谱法是根据相对分子质量的大凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的一种有效方法；电泳法是利用待小分离蛋白质的一种有效方法；电泳法是利用待测样品中各种分子带电性质的差异和分子本身的测样品中各种分子带电性质的差异和分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。这两种方度，从而实现样品中各种分子的分离。

16、这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度。法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度。【误区警示】【误区警示】不同的蛋白质在凝胶色谱中有三不同的蛋白质在凝胶色谱中有三种运动情况：种运动情况：(1)分子很小，可进入凝胶全部内孔隙；分子很小，可进入凝胶全部内孔隙；(2)分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；(3)分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小相应部分。相应部分。跟踪训练跟踪训练下列各项中，一般不影响凝胶色谱法下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质的分离度的是分离蛋白质的分离度的是()A层析柱的高度层析柱的

17、高度B层析柱的直径层析柱的直径C缓冲溶液缓冲溶液D样品的分布样品的分布解析：解析：选选B。分离度取决于柱高，为分离不同组。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱必须有适宜的高度，分离度与柱高的分，凝胶柱必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关。样品的分布也影响分离度，缓冲溶平方根相关。样品的分布也影响分离度，缓冲溶液的液的pH影响蛋白质所带的电荷，因此也影响分影响蛋白质所带的电荷，因此也影响分离度。只有层析柱的直径一般不会影响分离度。离度。只有层析柱的直径一般不会影响分离度。血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离蛋白质的提取和分离一般分四步：样品处理蛋白质的提取和分离一般分四步：样品处理

18、粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定。纯度鉴定。1样品处理样品处理(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤采集血样采集血样低速短时间离心低速短时间离心吸取血浆吸取血浆盐水洗涤盐水洗涤低速离心低速离心重复重复步骤三次。步骤三次。特别提醒特别提醒(1)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的进行。步骤的进行。(2)离心时转速要低，时间要短，一般为离心时转速要低，时间要短，一般为500r/min，离心离心2min。(3)洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数。次数。特别提醒特别提醒(1)将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀

19、将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。层。(2)将滤液于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的将滤液于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的血红蛋白水溶液层。血红蛋白水溶液层。(4)透析透析取取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有放入盛有300mL的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/L的的磷酸缓冲液中磷酸缓冲液中(pH为为7.0)，透析，透析12h。目的是除去。目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质。样品中相对分子质量较小的杂质。(2)凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填(本实验使用的凝胶是交联本实验使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶)固定：

20、将色谱柱垂直固定在支架上固定：将色谱柱垂直固定在支架上装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h(3)样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用量为滴加透析样品：用量为1mL样品渗入凝胶床：样品完全渗进凝胶层样品渗入凝胶床：样品完全渗进凝胶层洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每试管收集流出液，每5m

21、L收集一管，连续收集收集一管，连续收集特别提醒特别提醒(1)滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。同时注意不要破坏凝胶面。(2)在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动，过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。说明色谱柱制作成功。下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入加入(图图)和洗脱和洗脱(图图)示意图，请据图回答下列示意图，请据图回答下列问题。问题。(1)在 加 样 示

22、意 图 中，正 确 的 加 样 顺 序 是在 加 样 示 意 图 中，正 确 的 加 样 顺 序 是_。(2)用吸管加样时，应注意正确操作，分别是用吸管加样时，应注意正确操作，分别是 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _、贴 着 管 壁 加 样、贴 着 管 壁 加 样、_。(3)等样品等样品_时，才加入缓冲液，待时，才加入缓冲液，待_接近色谱柱底端时，用试接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集流出液，每_mL收集一管，连收集一管，连续收集。续收集。【尝试解答】【尝试解答】(1)(2)不要破坏凝胶面使吸管管口沿管壁环绕移动不要破坏凝胶面使吸管管口沿管壁环绕移动(3)完全进

23、入凝胶层红色的蛋白质完全进入凝胶层红色的蛋白质5【解析】【解析】加样品时应严格按要求进行操作，吸加样品时应严格按要求进行操作，吸管应贴着管壁，管口沿着管壁环绕移动，还应注管应贴着管壁，管口沿着管壁环绕移动，还应注意不要破坏凝胶面。等样品完全进入到凝胶层时，意不要破坏凝胶面。等样品完全进入到凝胶层时，才加入缓冲液进行洗脱。才加入缓冲液进行洗脱。【探规寻律】【探规寻律】对分离效果的判断对分离效果的判断(1)若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。(2)若血红蛋白的红色区带歪曲

24、、散乱、变宽，则若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。说明分离效果不好，装填不成功。【互动探究】【互动探究】(1)凝胶色谱柱的装填应注意哪些凝胶色谱柱的装填应注意哪些事项？事项？(2)血红蛋白溶液是如何分离的？血红蛋白溶液是如何分离的？【提示】【提示】(1)装填前为了加速膨胀，可以加入装填前为了加速膨胀，可以加入洗脱液的湿凝胶，用沸水浴加热，优点是：节约洗脱液的湿凝胶，用沸水浴加热，优点是：节约时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。内的空气。装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白装填时不能有气泡，气泡会搅

25、乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。质的洗脱次序，降低分离效果。装填后不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现装填后不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。象。(2)蛋白质的分离是根据离心原理进行的。当含有细蛋白质的分离是根据离心原理进行的。当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的黏度有关。像红细胞大又与重力场的强度及液体的黏度有关。像红细胞大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。下观察到它们的沉降过程。2019POWERPOINTSUCCESS2022-8-132019THANK YOUSUCCESS2022-8-13