细胞融合及其应用课件.ppt

1、第四章第四章 细胞融合及其应用细胞融合及其应用第一节第一节 细胞融合概述细胞融合概述第二节第二节 细胞融合技术应用细胞融合技术应用n什么是细胞融合？什么是细胞融合？n为什么要进行细胞融合？为什么要进行细胞融合？n简述细胞融合的研究历史。简述细胞融合的研究历史。第一节第一节 细胞融合概述细胞融合概述一、细胞融合的概念和意义一、细胞融合的概念和意义1.1.概念概念 细胞融合（细胞融合（cell fusion)cell fusion)又称体细胞杂交又称体细胞杂交（somatic hybridization)somatic hybridization)，即在自然条件下或，即在自然条件下或用人工方法用人

2、工方法(生物的、物理的、化学的生物的、物理的、化学的)使两个或使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞或两个以上的细胞合并形成一个细胞或使之分化再使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。生、形成新物种或新品种的技术。v克服物种间克服物种间杂交不亲和杂交不亲和或或不能受精不能受精或或胚胎早期胚胎早期败育败育，为遗传物质广泛重组提供新途径。，为遗传物质广泛重组提供新途径。如：薯番茄、番茄薯如：薯番茄、番茄薯2.2.意义意义3.3.细胞融合的类型细胞融合的类型 n 19781978年，德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣告，年，德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣告，他用马铃薯与番茄相结合，得到了地上部分结他用马

3、铃薯与番茄相结合，得到了地上部分结青色果实的青色果实的“薯番茄薯番茄”，但地下尚未结出马铃，但地下尚未结出马铃薯的块茎。薯的块茎。n 后来，美国堪萨斯州立大学的科学家，把番茄后来，美国堪萨斯州立大学的科学家，把番茄和马铃薯的细胞部分融合在一起，培育出了地和马铃薯的细胞部分融合在一起，培育出了地上结黄色果实、地下长白色薯块的上结黄色果实、地下长白色薯块的“番茄薯番茄薯”，据说番茄的产量很高。据说番茄的产量很高。v 创造细胞质杂种创造细胞质杂种 某些农艺性状如：细胞质雄性不育、某些农艺性状如：细胞质雄性不育、除草剂抗性等都是由细胞质控制的。除草剂抗性等都是由细胞质控制的。有性杂交中雄配子携带细胞质

4、极有性杂交中雄配子携带细胞质极少，难以产生细胞质杂种；少，难以产生细胞质杂种；细胞融合的杂种细胞质能够选择细胞融合的杂种细胞质能够选择某一亲本的叶绿体，但线粒体可实现某一亲本的叶绿体，但线粒体可实现双亲重组。双亲重组。v为遗传学研究提供新的手段。为遗传学研究提供新的手段。如：核质相互关系、基因作用与定位、肿瘤的如：核质相互关系、基因作用与定位、肿瘤的发生等。发生等。二、基本原理二、基本原理v细胞融合的基本原理是什么？细胞融合的基本原理是什么？v简述细胞融合的大致过程。简述细胞融合的大致过程。1.1.相关概念：相关概念：n 合胞体合胞体(synkaryon)(synkaryon)：在细胞融合过程

5、中，开始阶段只来自两个细胞在细胞融合过程中，开始阶段只来自两个细胞的细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的的细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的细胞结构称为合胞体。细胞结构称为合胞体。n 同核体同核体（homokaryonhomokaryon，同核融合细胞）：基因型相同的细胞融合成的，同核融合细胞）：基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体。是由同源的原生质体融合产生的。杂交细胞称为同核体。是由同源的原生质体融合产生的。n 异核体异核体（heterokaryon,heterokaryon,异核融合细胞）：来自不同基因型的细胞融异核融合细胞）：来自不同

6、基因型的细胞融合形成的杂交细胞为异核体。由非同源的原生质体融合产生的。合形成的杂交细胞为异核体。由非同源的原生质体融合产生的。n 杂种细胞（体细胞杂种）杂种细胞（体细胞杂种）：来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞：来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞核内，产生出杂种细胞。由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞，因此核内，产生出杂种细胞。由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞，因此又叫做体细胞杂种。又叫做体细胞杂种。2.2.基本原理基本原理n细胞质膜的特性细胞质膜的特性n细胞膜融合的原理细胞膜融合的原理质膜靠近，质膜靠近，质膜局部区域紧密粘连，磷质膜局部区域紧密粘连，磷脂分子重排，形成细胞桥；脂分子重排，形

7、成细胞桥；胞质融合，胞质融合，细胞核融合。细胞核融合。3.3.细胞融合大致过程细胞融合大致过程植植物物细细胞胞融融合合过过程程人人造造小小鼠鼠培培育育过过程程示示意意图图三、细胞融合方法三、细胞融合方法v 细胞融合方法有哪些？试述其原理。细胞融合方法有哪些？试述其原理。1.11.1植物或微生物原生质体的制备植物或微生物原生质体的制备1.21.2动物单个细胞的获得动物单个细胞的获得 首先获得动物组织，然后经消化液消化获得单首先获得动物组织，然后经消化液消化获得单细胞。细胞。常用消化液：胰蛋白酶适于细胞间质较常用消化液：胰蛋白酶适于细胞间质较少的软组织；胶原酶适于消化胶原和细胞间质少的软组织；胶原

8、酶适于消化胶原和细胞间质丰富的纤维组织、癌组织等。丰富的纤维组织、癌组织等。1.融合材料融合材料 2.融合方法融合方法诱导融合的方法种类：诱导融合的方法种类：离子诱导融合法；离子诱导融合法；l 化学诱导化学诱导 高钙高钙-高高pH法；法；PEG（聚乙二醇）法。（聚乙二醇）法。离心振荡离心振荡l 物理诱导物理诱导 显微操作显微操作 电融合电融合l 生物法生物法 仙台病毒法仙台病毒法2.1 化学法化学法2.1.1离子诱导融合法离子诱导融合法：常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、氯化钙等。氯化钙等。钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝钠离子能中和原生质体

9、表面的负电荷，使凝聚的原生质体得质膜紧密接触，促进细胞融合。聚的原生质体得质膜紧密接触，促进细胞融合。（1970年，年，Power用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体进行了融合进行了融合;1972年年,Carlson也用硝酸钠作融合剂，获得第一个也用硝酸钠作融合剂，获得第一个烟草种间体细胞杂交植株。）烟草种间体细胞杂交植株。）该方法异核体形成频率低，该方法异核体形成频率低，0.1-4%。2.1.2 高钙-高pH法：n首先用于人和鼠的动物细胞杂交，后来引用在植首先用于人和鼠的动物细胞杂交，后来引用在植物原生质体的融合，并利用这种融合方法获得了物原生质体的融合，

10、并利用这种融合方法获得了烟草体细胞杂种（烟草体细胞杂种（1973年，年，50mmol/L钙离子、钙离子、pH值值10.5）。）。n钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结合；高合；高pH值能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。值能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。n该方法高该方法高pH值对原生质体有害。值对原生质体有害。n异种融合效率达异种融合效率达10-35%(高国楠高国楠,1974)PEG是一种多聚化合物，分子量在是一种多聚化合物，分子量在20020000之间，毒性小易操作。之间，毒性小易操作。用用PEG法与高钙

11、法与高钙-高高pH法结合法结合:制备两亲本的制备两亲本的原生质体，并至合适密度（原生质体，并至合适密度（105个个/ml）；将）；将PEG溶液加入，并孵育一段时间（溶液加入，并孵育一段时间（24或或37，1020分钟）；缓缓加入高钙高分钟）；缓缓加入高钙高pH溶液溶液15分钟；分钟；洗涤，收集细胞计算融合率。洗涤，收集细胞计算融合率。融合促进剂融合促进剂:伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A，二甲基亚砜和，二甲基亚砜和链胃蛋白酶等，提高细胞的融合频率。链胃蛋白酶等，提高细胞的融合频率。2.1.3 PEG（聚乙二醇）法（聚乙二醇）法n PEGPEG含有醚键而具有含有醚键而具有负极性负极性，与水、蛋白质和碳

12、水，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键。化合物等一些正极化基团形成氢键。当当PEGPEG分子足分子足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。而使之粘连。n PEGPEG也也能连接能连接Ca2+Ca2+等阳离子等阳离子。Ca2+Ca2+可在一些负极化可在一些负极化基团和基团和PEGPEG之间形成桥，因而促进粘连之间形成桥，因而促进粘连;n 在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEGPEG分子可分子可被洗脱，引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原被洗脱，引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合生质

13、体融合;n 高高Ca2+Ca2+高高pHpH清洗增加了质膜的流动性，大大提高清洗增加了质膜的流动性，大大提高了融合频率。了融合频率。PEG诱导融合原理诱导融合原理 物理诱导融合包括物理诱导融合包括离心振荡、显微操作和电离心振荡、显微操作和电融合融合 显微操作显微操作：显微操作将大熊猫体细胞注入去：显微操作将大熊猫体细胞注入去核兔卵母细胞卵周隙中。核兔卵母细胞卵周隙中。2.2 物理诱导融合物理诱导融合 电融合电融合 原理：原理：细胞处于不均一的细胞处于不均一的交变电场交变电场，细胞极化，细胞极化成为偶极子，排列成串珠状，再施加成为偶极子，排列成串珠状，再施加瞬间强脉冲瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电

14、击穿，从而导致融合。使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。在融合仪控制下的融合小室内进行。各种指标在融合仪控制下的融合小室内进行。各种指标都可精细调节控制，融合效率高都可精细调节控制，融合效率高（zimmermann1981,融合频率达融合频率达60%）。优点：优点：融合效率高、操作简单、重复性强、无融合效率高、操作简单、重复性强、无毒性、可在显微镜下直接观察细胞融合过程。毒性、可在显微镜下直接观察细胞融合过程。n 仙台病毒：仙台病毒：亦称亦称HVJHVJ（Hemagglutinating virus of Hemagglutinating virus of JapJapanan的缩写），乙型

15、副流感病毒。属副黏液病毒的缩写），乙型副流感病毒。属副黏液病毒属，属，RNARNA病毒。（病毒。（M MKuroyaKuroya），（），（19531953）。）。n 年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并使膜产使膜产生一些断裂生一些断裂，两个细胞核会通过裂口融合在一起；，两个细胞核会通过裂口融合在一起；n 不耐热，几乎可不耐热，几乎可凝集所有种类的红血球凝集所有种类的红血球，而且有溶血，而且有溶血性。在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖。性。在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞

16、的细胞质中增殖。2.3 生物法生物法病毒法病毒法 疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒n 病毒囊膜上有许多刺突（病毒囊膜上有许多刺突（spike)，刺突上都是一，刺突上都是一个单价血细胞凝集素；个单价血细胞凝集素；n 刺突还有唾液酸苷酶的活性，水解寡糖链上的唾刺突还有唾液酸苷酶的活性，水解寡糖链上的唾液酸残基，攻击细胞表面。液酸残基，攻击细胞表面。紫外线紫外线丧失感染活性丧失感染活性（不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保留融合活性（诱导细胞融合）（诱导细胞融合）仙台病毒仙台病毒程序：程序：紫外线将病毒灭活，稀紫外线将病毒灭活，稀释到一定浓度，加入到释到一定浓度，加入

17、到细胞悬液中，离心，诱细胞悬液中，离心，诱导细胞融合。导细胞融合。优点：优点：融合效率高，适合于各种动物细胞；融合效率高，适合于各种动物细胞；仙台病毒在鸡胚中大量繁殖，容易培仙台病毒在鸡胚中大量繁殖，容易培养。养。缺点缺点:仙台病毒不稳定，制备过程繁琐，易仙台病毒不稳定，制备过程繁琐，易失活，容易对细胞产生干扰；失活，容易对细胞产生干扰；3.13.1植物细胞融合植物细胞融合：植物原生质体融合植物原生质体融合无种属特异性无种属特异性，融合效率只与外界条，融合效率只与外界条件有关。件有关。n PEGPEG诱导关键是处理时间，过长损伤原生质体，过短不融合；诱导关键是处理时间，过长损伤原生质体，过短不

18、融合；PEGPEG的规格和纯度，分子量多为的规格和纯度，分子量多为4000400060006000。n 电融合，与原生质体密度有关，最适密度为电融合，与原生质体密度有关，最适密度为2 210104 48 8 10104 4n 电融合时，加入少量电融合时，加入少量CaClCaCl2 2,可维持电导率，保护细胞；交可维持电导率，保护细胞；交变电流强弱、处理时间长短及电脉冲的大小影响融合率。变电流强弱、处理时间长短及电脉冲的大小影响融合率。n 添加促融合剂，可提高融合率。添加促融合剂，可提高融合率。3.影响融合的因素影响融合的因素3.23.2 动物细胞融合动物细胞融合n 亲本细胞表面性质影响大：表面

19、覆盖绒毛且不规则的较容亲本细胞表面性质影响大：表面覆盖绒毛且不规则的较容易；表面光滑的不易融合；易；表面光滑的不易融合；n 细胞种类不同，融合效果不同：腹水癌细胞易融合，淋巴细胞种类不同，融合效果不同：腹水癌细胞易融合，淋巴细胞或血球细胞不易融合。细胞或血球细胞不易融合。n 融合时温度和运动状态：仙台病毒诱导腹水癌细胞融合，融合时温度和运动状态：仙台病毒诱导腹水癌细胞融合，3737度、振荡。度、振荡。n 需氧量大，缺氧常不融合。需氧量大，缺氧常不融合。n 需要需要Ca Ca 2+2+，最适浓度为，最适浓度为0.1mol/L0.1mol/L。n 最适最适pHpH值为值为7.47.47.87.8。

20、四、杂种细胞的筛选和鉴定四、杂种细胞的筛选和鉴定（一）体细胞杂种的遗传特性（一）体细胞杂种的遗传特性 1 1、细胞分裂与染色体丢失、细胞分裂与染色体丢失如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中就会有两种结果，一是细胞分裂几次以过程中就会有两种结果，一是细胞分裂几次以后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。如果这中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。如果这样就会产生几种情况：样就会产生几种情况：A A细胞细胞B B细胞质；细胞质；A A细胞细胞B B细胞质和部分染色体或基因。细胞质

21、和部分染色体或基因。2 2、基因转移与性状表达、基因转移与性状表达由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合，分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移通常是在后代中某些性状得以表达，有时由于通常是在后代中某些性状得以表达，有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。3 3、体细胞杂种遗传上的不稳定性、体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉体细胞杂种后代在遗传上常常不稳

22、定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。重组等。（二）融合细胞的筛选（二）融合细胞的筛选I I、植物细胞筛选方式、植物细胞筛选方式1 1、遗传互补筛选法：、遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。细胞表现正常。如：如：亲本亲本1 1：叶绿体缺陷型：叶绿体缺陷型 亲本亲本2 2：光致死型：光致死型 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色

23、，两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长。融合细胞长成植株呈绿色，并能成长。（2 2）抗性互补筛选法：）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。杂种细胞。亲本亲本1 1：对放线菌素：对放线菌素D D抗性，但在抗性，但在MSMS培养基上不培养基上不能超过能超过5050个世代；个世代；亲本亲本2 2：对放线菌素：对放线菌素D D很敏感，但能在很敏感，但能在MSMS上生长；上生长；杂种细胞能在含有放线菌素的杂种细胞能在含有放线菌素的MSMS培养基上生长，培养基

24、上生长，而亲本和其它细胞死亡。而亲本和其它细胞死亡。3 3）利用物理特性筛选法）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。如：如：亲本亲本1 1：异硫氰酸荧光素（：异硫氰酸荧光素（FITCFITC）标记）标记 亲本亲本2 2：碱性蕊香红荧光素标记：碱性蕊香红荧光素标记 在荧光显微镜下，亲本在荧光显微镜下，亲本1 1为绿色，亲本为绿色，亲本2 2为红色，为红色，杂种细胞可以区分杂种细胞可以区分4 4）利用生长特性筛选法：）利用生长特性筛选法：利用原

25、生质体对培养基成分要求与反应的差异选利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。择杂种细胞。例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。在培养基上不需加激素。IIII、动物细胞筛选方式、动物细胞筛选方式1 1、利用抗药性筛选系统、利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。感性差异筛选杂种细胞。n 亲本亲本A A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感n 亲本亲本B

26、 B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感n 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长2 2、营养互补筛选系统：营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。种细胞。n 亲本亲本A A：色氨酸缺陷型：色氨酸缺陷型n 亲本亲本B B：苏氨酸缺陷型：苏氨酸缺陷型n 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上杂种细胞可以在不含色氨酸和

27、苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。培养，而亲本细胞均会死亡。3 3、温度敏感突变型杂种细胞的筛选：、温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养一般的培养细胞能在细胞能在3232度到度到4040度的范围内生长，但温度敏度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。筛选杂种细胞。n 亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在3737度左右度左右生长。生长。n 亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。n 杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生杂种细胞能在高

28、温和含卡娜霉素的培养基上生长。长。第二节第二节 细胞融合技术应用细胞融合技术应用一、动物细胞融合和单克隆抗体制备一、动物细胞融合和单克隆抗体制备（一）动物细胞融合研究（一）动物细胞融合研究简史简史（二）动物细胞融合技术主要（二）动物细胞融合技术主要应用应用（三）（三）单克隆抗体制备单克隆抗体制备二、植物原生质体融合培育新品种二、植物原生质体融合培育新品种（一）研究简史（一）研究简史（二）融合程序（二）融合程序三、微生物原生质体融合构建新菌株三、微生物原生质体融合构建新菌株一、动物细胞融合和单克隆抗体制备一、动物细胞融合和单克隆抗体制备（一）动物细胞融合研究简史（一）动物细胞融合研究简史 生物界

29、自发细胞融合：生物界自发细胞融合：18381838年，年，MullerMuller发现分散性肿瘤细胞能自发融发现分散性肿瘤细胞能自发融合产生多核细胞。后来人们发现了多种体内细合产生多核细胞。后来人们发现了多种体内细胞合并现象。胞合并现象。体外培养细胞融合：体外培养细胞融合：v19581958年，日本人冈田发现仙台病毒具有诱发艾年，日本人冈田发现仙台病毒具有诱发艾氏癌细胞相互融合的效应。氏癌细胞相互融合的效应。v13651365年，冈田等利用仙台病毒诱导两种不同动年，冈田等利用仙台病毒诱导两种不同动物细胞融合，产生第一个种间异核体。物细胞融合，产生第一个种间异核体。v19781978年，瑞士科学

30、家和美国科学家将人的纤维年，瑞士科学家和美国科学家将人的纤维肉瘤细胞与小鼠的畸胎瘤细胞融合，获得含人肉瘤细胞与小鼠的畸胎瘤细胞融合，获得含人体染色体的小鼠。体染色体的小鼠。人畜细胞融合引发激烈争论 20002000年年1010月，澳大利亚和美国的月，澳大利亚和美国的两家生物公司把人体细胞和猪细两家生物公司把人体细胞和猪细胞融合在一起，并向欧洲专利局胞融合在一起，并向欧洲专利局申请专利。环保人士指责这些科申请专利。环保人士指责这些科学家是学家是“弗兰肯斯坦式的科学家弗兰肯斯坦式的科学家”-创造怪物的人最终受到怪物创造怪物的人最终受到怪物的伤害的伤害 ，所造出的是令人恐惧，所造出的是令人恐惧的的“

31、半人半猪怪物半人半猪怪物”。目前，融合技术已迅速发展到动目前，融合技术已迅速发展到动物间、动植物间及人体细胞和动物间、动植物间及人体细胞和动植物细胞间。植物细胞间。狮头、羊身、蛇狮头、羊身、蛇尾的吐火怪兽尾的吐火怪兽（二）动物细胞融合技术主要应用（二）动物细胞融合技术主要应用1 1、染色体的基因定位、染色体的基因定位 如：将人体细胞与小鼠细胞融合，在杂种细胞系如：将人体细胞与小鼠细胞融合，在杂种细胞系中，优先排斥人染色体，因此，每种细胞系都仅含有中，优先排斥人染色体，因此，每种细胞系都仅含有一条或若干条特异性的人染色体。一条或若干条特异性的人染色体。通过对这些细胞系生理生化功能分析，就可以断通

32、过对这些细胞系生理生化功能分析，就可以断定特定的人染色体的功能。定特定的人染色体的功能。已经证明，仅保留着已经证明，仅保留着1 1号人染色体的人号人染色体的人-小鼠杂种小鼠杂种细胞系，才能合成人尿苷单磷酸激酶，证实编码这种细胞系，才能合成人尿苷单磷酸激酶，证实编码这种激酶的人基因定位在激酶的人基因定位在1 1号染色体上。号染色体上。将不同人类疾病遗传缺陷的突变细胞融合，产生将不同人类疾病遗传缺陷的突变细胞融合，产生的杂种细胞由于基因的互补作用，可恢复其正常的的杂种细胞由于基因的互补作用，可恢复其正常的表型。表型。应用基因互补分析，断定突变体所涉及的基因数应用基因互补分析，断定突变体所涉及的基因

33、数目，分析基因的结构，剖析遗传疾病的病因目，分析基因的结构，剖析遗传疾病的病因:杂种杂种细胞测定细胞测定 不互补，缺失同一基因或同一基因产生同样突变；不互补，缺失同一基因或同一基因产生同样突变；互补，缺失不同基因或同一基因不同部位发生突互补，缺失不同基因或同一基因不同部位发生突变。变。2 2、遗传疾病的治疗与基因互补分析、遗传疾病的治疗与基因互补分析3 3、制备、制备单克隆抗体单克隆抗体1 1、什么是单克隆抗体？、什么是单克隆抗体？v 回顾抗体基础知识回顾抗体基础知识 抗体的化学本质是什么？抗体的化学本质是什么？抗体由何种细胞产生？抗体由何种细胞产生？用传统的方法如何获得抗体？用传统的方法如何

34、获得抗体？思考思考？（三）单克隆抗体技术（三）单克隆抗体技术抗体：能够与抗原发生特异性结合的免疫球蛋抗体：能够与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。白。能产生抗体的细胞是浆细胞（即效应能产生抗体的细胞是浆细胞（即效应B B细胞）。细胞）。抗体的传统生产方法抗体的传统生产方法抗原抗原 反复注射动物反复注射动物血清中分离抗体血清中分离抗体该法制备抗体的缺点：该法制备抗体的缺点：产量低、纯度低，且抗体的产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。特异性差、灵敏度低。所有抗所有抗体体混合混合人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B B细胞可以产生多达百万种

35、以上的特异性抗体，而细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，而每个每个B B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个要想获得大量的单一抗体，必须用单个B B细胞进行细胞进行无性繁殖，即克隆。无性繁殖，即克隆。n 单克隆单克隆抗体：单个抗体：单个B B细胞克隆产生的化学性质单细胞克隆产生的化学性质单一、特异性强的抗体。一、特异性强的抗体。提示提示1 1：B B细胞可以进行无限增殖吗？细胞可以进行无限增殖吗？提示提示2 2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？问题：如何大量生产单

36、克隆抗体？请尝试设计一个问题：如何大量生产单克隆抗体？请尝试设计一个方案。方案。一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 骨髓瘤细胞能无限增殖骨髓瘤细胞能无限增殖杂交瘤细胞杂交瘤细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术设计方案：设计方案：动物细胞融合技术动物细胞融合技术单克隆抗体单克隆抗体既能产生特异性抗体，既能产生特异性抗体，又能大量增又能大量增殖的细胞殖的细胞米尔斯坦米尔斯坦柯勒柯勒BBBB 、B B瘤瘤 、瘤瘤瘤瘤 （B B、瘤）、瘤）（一选）（一选）选择选择性培养基性培养基：只：只有有杂交瘤细胞杂交瘤细胞才能存活才能存活获得产生相应抗获得产生相应抗体的体的B

37、B细胞细胞（二选）：选能（二选）：选能产生所需产生所需专一抗专一抗体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞2 2、制备单克、制备单克隆抗体流程隆抗体流程（1 1）动物免疫与免疫脾细胞制备）动物免疫与免疫脾细胞制备（2 2）骨髓瘤突变缺陷细胞株的培养和选择）骨髓瘤突变缺陷细胞株的培养和选择（3 3）细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备 （4 4）杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选（5 5）特异性杂交瘤细胞的筛选特异性杂交瘤细胞的筛选（6 6）杂交瘤细胞克隆化培养和冻存杂交瘤细胞克隆化培养和冻存（7 7）McABMcAB的大量制备的大量制备（8 8）单克隆抗体的鉴定单克隆抗体的鉴定3 3

38、、制备单克隆抗体的基本技术、制备单克隆抗体的基本技术文献解读文献解读u免疫的目的是产生足够多的能识别目的抗原的免疫的目的是产生足够多的能识别目的抗原的B B淋淋巴细胞。巴细胞。（1 1）动物免疫与免疫脾细胞制备）动物免疫与免疫脾细胞制备文献解读文献解读（2 2）骨髓瘤细胞的培养和选择）骨髓瘤细胞的培养和选择n 骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为繁殖和连续继代培养，且为HGPRT-HGPRT-（次黄嘌呤（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）或鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）或TK-TK-（胸腺嘧啶核（胸腺嘧啶核苷激酶）。苷激酶）。n 培养可采

39、用一般的动物细胞培养液，小牛血清培养可采用一般的动物细胞培养液，小牛血清的浓度一般在的浓度一般在10%-20%10%-20%。n 细胞融合前必须做骨髓瘤细胞对细胞融合前必须做骨髓瘤细胞对HATHAT选择培养基选择培养基敏感性实验，不敏感的细胞不能用于细胞融合。敏感性实验，不敏感的细胞不能用于细胞融合。n 什么是什么是HATHAT选择培养基选择培养基/HATHAT选择系统选择系统？n HATHAT是含一定浓度次黄嘌呤（是含一定浓度次黄嘌呤（H H）、氨基喋呤（）、氨基喋呤（A A）及胸腺嘧啶核苷（及胸腺嘧啶核苷（T T）的一种选择性培养基，其中）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞三种成分与细

40、胞DNADNA合成有关。合成有关。n DNADNA合成途径有两种：合成途径有两种：HATHAT选择系统选择系统n B B淋巴细胞具有淋巴细胞具有HGPRTHGPRT、TKTK这两种酶这两种酶,因此在因此在DNADNA合成正常途径被阻断后，仍能利用合成正常途径被阻断后，仍能利用HATHAT培养培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA,DNA,可在可在HATHAT培养基中存活；但培养基中存活；但B B淋巴细胞是正常细胞淋巴细胞是正常细胞,不能长期存活。不能长期存活。n 杂交瘤细胞杂交瘤细胞具有双亲的遗传特性，具有来自于具有双亲的遗传特性，具有来自于淋巴细胞的淋巴细胞的

41、HGPRTHGPRT和和TK,TK,可以采用补救途径合成可以采用补救途径合成DNADNA，因此可在，因此可在HATHAT培养基中存活与繁殖。培养基中存活与繁殖。（3 3）细胞融合细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备：淋巴细胞杂交瘤的制备 n PEGPEG法诱导细胞融合流程：法诱导细胞融合流程：n 将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2 2：1 1或或1010：1 1的比例混匀的比例混匀于于50ml50ml锥形离心管内，锥形离心管内，1200rpm1200rpm离心离心7 71010分钟，尽量吸分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成净上清液，用手指轻击管壁，使

42、管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在6060秒钟内逐秒钟内逐滴加入滴加入50%50%的的PEG 0.5mlPEG 0.5ml，随后静置，随后静置9090秒，再于秒，再于5 5分钟内边分钟内边振摇边逐滴加入振摇边逐滴加入5 510ml10ml不含血清的培液或盐水缓冲液，不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止以终止PEGPEG的作用，再静置的作用，再静置1010分钟。分钟。（4 4）HATHAT培养基筛选培养基筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞n 悬浮于悬浮于HATHAT培养液培养液中培养，每隔中培养，每隔3 34 4天半量更天半量更换换HATHAT培

43、养液，培养液，1515天后改用天后改用HTHT培养基，培养基，3 3周后周后改用完全改用完全RPMI1640RPMI1640培养液，培养培养液，培养8-128-12天进行天进行抗体检测。抗体检测。（5 5）特异性特异性杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选n 通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液，根据液，根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等等具体情况来加以选择。具体情况来加以选择。n 可溶性抗原可溶性抗原可采用放射免疫、免疫酶标测定、

44、间可采用放射免疫、免疫酶标测定、间接血凝等方法测定。接血凝等方法测定。n 细胞抗原细胞抗原可采用免疫荧光、溶血空斑测定等方法可采用免疫荧光、溶血空斑测定等方法直接测定针对这些抗原的抗体。直接测定针对这些抗原的抗体。（6 6）杂交瘤细胞克隆化培养和冻存）杂交瘤细胞克隆化培养和冻存n 利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。异抗体的细胞系。n 在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等胞、脾细

45、胞或胸腺细胞等。n 方法有方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪应用荧光激活分选仪等。等。n 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染。异及污染。文献解读文献解读文献解读文献解读文献解读文献解读（7 7）McABMcAB的大量制备的大量制备文献解读文献解读（8 8）单克隆抗体的鉴定）单克隆抗体的鉴定文献解读文献解读 4 4、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用 4.14.1 病毒性疾病的诊断和治疗：病毒性疾病的诊断和治疗：可检测多种病毒中非常细微的株间差异，鉴可检测多种病毒中非常细微

46、的株间差异，鉴定细菌的种型和亚种。诊断异常准确，误诊率定细菌的种型和亚种。诊断异常准确，误诊率大大降低。大大降低。例如，抗乙型肝炎病毒表面抗原（例如，抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAgHBsAg）的）的单克隆抗体，灵敏度比当前最佳的抗血清还要单克隆抗体，灵敏度比当前最佳的抗血清还要高高100100倍，能检测出抗血清的倍，能检测出抗血清的6060的假阴性。的假阴性。4.24.2 癌症治疗癌症治疗 可检查出尚无临床表现的极小肿瘤病灶，检测可检查出尚无临床表现的极小肿瘤病灶，检测心肌梗死的部位和面积。心肌梗死的部位和面积。人们正在研究人们正在研究“生物导弹生物导弹”单克隆抗体作单克隆抗体作载体携带药

47、物，使药物准确地到达癌细胞，以载体携带药物，使药物准确地到达癌细胞，以避免化疗或放射疗法把正常细胞与癌细胞一同避免化疗或放射疗法把正常细胞与癌细胞一同杀死的副作用。在人体扫描图技术和肿瘤定位杀死的副作用。在人体扫描图技术和肿瘤定位方面已获得很大进展。方面已获得很大进展。4.3 4.3 生产免疫避孕药生产免疫避孕药 可精确地检测排卵期，将早期胚胎来制备单克隆可精确地检测排卵期，将早期胚胎来制备单克隆抗体。抗体。新一代免疫避孕药就是用精子，卵透明带或早期新一代免疫避孕药就是用精子，卵透明带或早期胚胎来制备单克隆抗体，将它们注入妇女体内，胚胎来制备单克隆抗体，将它们注入妇女体内，人体就会产生对精子的

48、免疫反应，从而起到避孕人体就会产生对精子的免疫反应，从而起到避孕作用。作用。4.4 4.4 生产生物药品生产生物药品生物药品主要有各种疫苗、菌苗、抗生素、生物生物药品主要有各种疫苗、菌苗、抗生素、生物活性物质、抗体等，是生物体内代谢的中间产物活性物质、抗体等，是生物体内代谢的中间产物或分泌物。或分泌物。过去制备疫苗是从动物组织中提取，得到的产量过去制备疫苗是从动物组织中提取，得到的产量低而且很费时。现在，利用细胞工程或细胞融合低而且很费时。现在，利用细胞工程或细胞融合途径，大大提高了效率，还能制备出多价菌苗，途径，大大提高了效率，还能制备出多价菌苗，可同时抵御两种以上的病原菌的侵害。可同时抵御

49、两种以上的病原菌的侵害。4.54.5 免疫学研究免疫学研究 鉴定、区分各种抗原检测抗原上的决定簇；鉴定、区分各种抗原检测抗原上的决定簇；对抗体的基因定位及表达进行研究。对抗体的基因定位及表达进行研究。4.64.6 大分子蛋白的提纯大分子蛋白的提纯 将抗体交联到溴化氢活化的琼脂糖基质上，将抗体交联到溴化氢活化的琼脂糖基质上，制成免疫亲和层析柱。提纯得到的蛋白质杂制成免疫亲和层析柱。提纯得到的蛋白质杂质含量低，对产物起始浓度要求低。质含量低，对产物起始浓度要求低。二、植物原生质体融合培育新品种二、植物原生质体融合培育新品种1.1.研究简史研究简史n19721972年美国的年美国的CarlsonCa

50、rlson使粉兰烟草与郎氏烟草的使粉兰烟草与郎氏烟草的细胞融合，细胞融合，获得烟草种间杂种植物；获得烟草种间杂种植物；n19771977年后，中国农业科学院烟草研究所的科研人年后，中国农业科学院烟草研究所的科研人员，用普通烟草和黄花烟草的体细胞进行融合，培员，用普通烟草和黄花烟草的体细胞进行融合，培育出两批烟草杂种植株，并开花结实。育出两批烟草杂种植株，并开花结实。n19781978年德国的梅歇尔斯首次将番茄和马铃薯细胞年德国的梅歇尔斯首次将番茄和马铃薯细胞融合成功，称之为融合成功，称之为“pomoto”pomoto”。科间体细胞杂交再生植株的仅有几例科间体细胞杂交再生植株的仅有几例:胡萝卜胡