酶工程概述课件范本学习培训模板课件.ppt

1、酶工程概述酶工程概述酶工程(Enzyme Engineering)定义b研究酶的大量生产和应用的技术学科b食品酶工程酶在工业上应用受到限制的原因（1）不稳定、要求的条件不同；（2）分离纯化酶的技术繁琐、复杂；（3）酶制剂成本高，价格贵；问题1.增强酶的稳定性，拓展其用途2.提高酶的产量，降低成本（活性、含量、分离手段改进）7.2酶的分离纯化酶的分离纯化7.3酶的固定化酶的固定化、酶传感器、酶传感器7.4 酶分子的酶分子的修饰与改造修饰与改造7.5 酶的非水相催化酶的非水相催化7.6 生物酶工程生物酶工程微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下，微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下，有目的地

2、利用微生物培养来生产所需的酶有目的地利用微生物培养来生产所需的酶 培养基培养基发酵条件发酵条件发酵方式发酵方式生长繁殖生长繁殖产酶产酶五大要素五大要素碳源、氮源、无机盐、生长因子、水碳源、氮源、无机盐、生长因子、水酶催化某一化学反应的能力。以单位时间底物的减少或生成物的增加来表示。酶活力单位：酶活力单位：1 IU（international unit)=1 mol/min 在特定条件下（最适pH值、25、最适底物浓度、最适缓冲液的离子强度），1min内，能转化1mol底物所需要的酶量。酶活力酶活力酶活力大小酶活力大小 在实际中往往对不同的酶使用不同的酶活单位在实际中往往对不同的酶使用不同的酶活

3、单位-淀粉酶活力单位定义为:在60pH6.2条件下,每小时可催化1g淀粉所需要的酶量为一个单位（U).直接以光密度值表示：单位时间增加或减少0.001个光密度值为一个酶活单位（U)；例如溶菌酶、过氧化物酶 自定义酶活单位指的是酶制剂催化能力的大小既与酶蛋白的浓度有关又与酶分子的催化能力大小有关。在酶的研究和使用过程中，各酶制剂中的酶量一般用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示，即U/mg或U/mL。酶量酶量指的是每毫克蛋白所具有的酶量表示酶的相对纯度，比活越高说明纯度越大表示为U/mg.Pro酶比活酶比活 7.2 酶的分离纯化酶的分离纯化 1 酶分离纯化的基本策略酶分离纯化的基本策略 2

4、 酶分离纯化的方法酶分离纯化的方法 3 酶的剂型与保存酶的剂型与保存 7.2.1 酶分离纯化的基本策略 酶分离纯化的基本过程 1.材料的选择与预处理 2.粗分离 3.细分离 4.制剂 酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩、干燥酶浓缩、干燥酶的制剂酶的制剂动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心，过滤，沉淀，萃取，层离心，过滤，沉淀，萃取，层析，电泳，萃取，结晶等分离析，电泳，萃取，结晶等分离技术技术酶纯化方案的设计酶纯化方案的设计完整的酶制备方案完整的酶制备方案酶活测定方法的建立酶活测定方法的建立材料的选

5、择材料的选择预处理对酶性质的初步探索预处理对酶性质的初步探索制定酶的纯化程序制定酶的纯化程序酶成品的保存酶成品的保存建立酶的活性测定方法建立酶的活性测定方法特异、灵敏、精确、快速、经济特异、灵敏、精确、快速、经济分离纯化酶的三原则分离纯化酶的三原则1.防止酶的变性失活2.目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去3.酶具有催化活性，检测酶活性，能跟踪酶的行踪。酶分离纯化的方法酶分离纯化的方法物质间性质的差异物质间性质的差异设计的分离纯化的方法设计的分离纯化的方法溶解度的差异溶解度的差异盐析法盐析法/有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法/等电点淀等电点淀法法/共沉淀法共沉淀法/选择性沉淀法选择性沉淀法/结晶结

6、晶稳定性的差异稳定性的差异热变性法热变性法/酸碱变性法酸碱变性法/表面变性法表面变性法电荷性质的差异电荷性质的差异 吸咐交换分离法吸咐交换分离法/电泳分离法电泳分离法 聚焦层析法聚焦层析法/电渗析分离法电渗析分离法分子大小和形状的差异分子大小和形状的差异透析法透析法/超滤法超滤法/凝胶过滤法凝胶过滤法离心分离法离心分离法/膜分离法膜分离法亲和作用的差异亲和作用的差异亲和层析法亲和层析法/亲和电泳法亲和电泳法 免疫吸附层析免疫吸附层析/亲和膜分离法亲和膜分离法共价层析法共价层析法/金属螯合层析法金属螯合层析法疏水作用的差异疏水作用的差异 疏水作用层析法疏水作用层析法分配系数产差异分配系数产差异分

7、配层析分配层析/双水相萃取双水相萃取/有机溶剂萃有机溶剂萃取取/超临界流体萃取超临界流体萃取对酶活性的初步探索对酶活性的初步探索 在制定纯化方法时应考虑该酶以下几方面：分子量等电点稳定性（以pH、温度、变性剂、鳌合剂、巯基试剂等）动力学常数（对底物、抑制剂、激活剂、辅助因子）。利用酶的稳定性利用酶的稳定性1.确定纯化过程中保持酶活性应维持的条件；2.若酶对极端温度、pH、有机溶剂或变性剂表现出不寻常的稳定性，则可利用这方面的性质，通过变性条件除去粗提液中大量的杂蛋白。性质的精确数据pI、分子量、Km、Ki、Ka等应在获得纯酶后进一步测定以确认或校正结构特征分析结晶 X-晶体衍射技术 核磁共振

8、质谱 光谱基因分析制订酶的纯化程序制订酶的纯化程序 建立一个最有效的酶纯化程序，应考虑以下原则：（1）利用酶在分离纯化上最有利的特性；（2）尽早使用一种选择性好的方法；（3）选择交换能力高的层析技术作为第一步层析；（4）不要连续使用相同的纯化方法，要使每步 过程的分辨能力呈递增趋势；（5）将各层析步骤连接起来，使前一步得到的样品适用于下一步层析；（6）在造成酶被稀释的步骤后来要用浓缩酶的方法；（7）纯化过程中做三件事：量体积，测酶活力和测蛋白质浓度，监测纯化的进程。7.2.2 粗酶液的制备粗酶液的制备材料的选择材料的选择 应具备酶含量丰富，材料易得，价廉等特点 采用代谢诱导的方法来提高生物材料

9、中酶的含量 采用DNA重组技术得到酶含量丰富的工程菌株破细胞破细胞酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况1.释放到细胞膜外的酶，叫胞外酶；2.游离化细胞内的酶，叫溶酶；3.牢固与膜或细胞颗粒结合在一起的，叫结酶后两者合称胞内酶。细胞破碎的方法细胞破碎的方法机械破碎法机械破碎法物理破碎法物理破碎法化学破碎法化学破碎法酶促破碎法酶促破碎法酶的抽提酶的抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称酶的提取。7.2.3 酶分离纯化过程的评价酶分离纯化过程的评价在酶的抽提和纯化过程中，为了了解所选择的方法和条件是否适宜，每一步骤前后都应进行酶的活力测定，作出总活力与比活力的比

10、较。酶的分离纯化过程中必须做三件事：酶的分离纯化过程中必须做三件事：1.测定酶活力（IU/mL）；2.测定蛋白质含量(mg/mL)；3.测量体积(mL)。活力回收（亦称为回收率或产率）纯化倍数（亦称比活力提高倍数）y(回收率)=原料的总活力某步骤后的总活力e(纯度提高)=原料的比活力某步骤后的比活力100%100%纯化方法与条件的比较标准纯化方法与条件的比较标准计算公式 在酶的纯化过程中，将各个步骤的测定结果列成“分离纯化表”以便进行总结、检查和改进。番麻蛋白酶分离纯化表番麻蛋白酶分离纯化表步骤步骤总体积总体积/mL总蛋白总蛋白/mg总活力总活力/U 比活力/U/mg纯化纯化倍数倍数产率产率/

11、%1.抽抽 提提11036564682.10177.30-2.硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀10145.547179.84324.401.8472.943.Sephadex G-506523.338810.341665.689.4060.00 4.sp-Sephadex C-504011.436563.453207.3218.1056.535.结结 晶晶6.2829642.344346.3424.5045.83图1 EFE Sephadex-G75洗脱曲线0200400600800100012001400010203040506070试管号酶活力（U）00.511.522.5酶活力蛋白质含量图 的 Ce

12、lllulose洗 脱 曲 线02004006008001000120014001020304050607080试 管 号蛋白含量00.30.60.91.21.51.82.1酶 活 性蛋 白 质 含 量L.brevis的醇脱氢酶分离纯化表Thermoanaerobium菌株JW/SL-YS489的木糖异构酶的纯化表纯度的鉴定 纯度提高和回收率的鉴定能帮助我们选择纯化方法与纯化条件。但是经过一定的纯化步骤后，为了了解所获得的样品是否均一纯净还要进行纯度鉴定。酶均一纯净性的鉴定有以下几种方法:（1)溶解度法 （2）电泳法 （3）超离心法 （4）免疫学法7.4 酶的剂型与保存酶的剂型与保存为适应各种

13、需要，并考虑到经济和应用效果，酶制剂常以四种剂型供应：1.液体酶制剂 2.固体粗酶制剂 3.纯酶制剂 4.固定化酶制剂7.4.3提高酶的稳定性 提高酶的稳定性，延长保存期影响酶的稳定性有以下几种因素(1)温度(2)pH和缓冲液(3)酶蛋白浓度(4)氧(5)防止微生物污染 稳定剂：A.底物抑制剂和辅酶可使酶蛋白由不稳定的扭曲状态转入稳定状态；B.对含有巯基的酶，可加入SH-保护剂，如巯基乙醇，谷胱甘肽，DTT等。Ca2+能保护-淀粉酶，Mn2+能稳定溶菌酶，Cl-能稳定透明质酸酶等 有时为了防止微生物污染酶制剂，加入一定浓度的甲醇，苯甲酸和百里酚等。1、同一批固定化酶能重复多次使用；、同一批固定

14、化酶能重复多次使用；2、酶和反应物分开，能较好地控制生产过程；、酶和反应物分开，能较好地控制生产过程；3、酶三级结构得到稳定，再加上抗干扰因素的、酶三级结构得到稳定，再加上抗干扰因素的存在，使酶的稳定性显著提高；存在，使酶的稳定性显著提高；4、产物中不含酶，省去了热处理使酶失活步骤，、产物中不含酶，省去了热处理使酶失活步骤，有助于提高食品质量；有助于提高食品质量；5、酶可长期使用，并可预测其衰变的速度；、酶可长期使用，并可预测其衰变的速度；6、提供了研究酶动力学的良好模型。、提供了研究酶动力学的良好模型。酶的构象的改变；酶的构象的改变；载体的存在给酶的活性部位或调节部位造载体的存在给酶的活性部

15、位或调节部位造成某种空间障碍；成某种空间障碍；底物和酶的作用受其扩散速率的限制。底物和酶的作用受其扩散速率的限制。在个别情况下，固定化酶由于抗抑能力的提在个别情况下，固定化酶由于抗抑能力的提高使得它反而比游离酶活力高。高使得它反而比游离酶活力高。（1 1）酶活力的变化）酶活力的变化酶活力低于天然酶酶活力低于天然酶 酶稳定性包括酶稳定性包括热稳定性热稳定性、对各种对各种有机试剂有机试剂的稳定性、对的稳定性、对pH的稳定性、对的稳定性、对蛋白水解酶蛋白水解酶的抗的抗性及性及储存储存稳定性等。固定化酶稳定性提高的原稳定性等。固定化酶稳定性提高的原因可能是由于固定化后酶与载体多点连接或酶因可能是由于固

16、定化后酶与载体多点连接或酶分子间的交联，防止了酶分子的伸展变形同时分子间的交联，防止了酶分子的伸展变形同时也抑制了自降解反应。也抑制了自降解反应。（2 2）酶稳定性提高）酶稳定性提高（3 3）最适）最适pHpH值和最适温度的变化值和最适温度的变化 酶固定化后，催化底物的最适酶固定化后，催化底物的最适pHpH值和值和pHpH活性曲线常发生变化，其原因是微环境表面活性曲线常发生变化，其原因是微环境表面电荷的影响。电荷的影响。酶反应的最适温度是酶失活速度与酶反酶反应的最适温度是酶失活速度与酶反应速度综合的结果。在一般情况下，固定化应速度综合的结果。在一般情况下，固定化后的酶失活速度下降，所以最适温度

17、也随之后的酶失活速度下降，所以最适温度也随之提高。提高。酶固定于电中性载体后，表观米氏常数往往比酶固定于电中性载体后，表观米氏常数往往比游离酶的米氏常数高，而最大反应速度变小；游离酶的米氏常数高，而最大反应速度变小；而当底物与具有带相反电荷的载体结合后，表而当底物与具有带相反电荷的载体结合后，表 观米氏常数往往减小，这对固定化酶实际应用是有观米氏常数往往减小，这对固定化酶实际应用是有利的。利的。此外，动力学常数的变化还受溶液中离子强度此外，动力学常数的变化还受溶液中离子强度的影响，但在高离子强度下，酶的动力学常数几乎的影响，但在高离子强度下，酶的动力学常数几乎不变。不变。（4 4）动力学常数的

18、变化）动力学常数的变化bb 影响相对酶活力的因素：载体结构、颗粒大影响相对酶活力的因素：载体结构、颗粒大小、底物分子量大小、酶的结合效率。小、底物分子量大小、酶的结合效率。bb 相对酶活力低于相对酶活力低于7575的固定化酶，一般没有的固定化酶，一般没有实际应用价值。实际应用价值。1 1、相对酶活力、相对酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值。力的比值。固定化酶的总活力与用于固定化的酶的总活固定化酶的总活力与用于固定化的酶的总活力之百分比称为酶的活力回收率。力之百分比称为酶的活力回收率。2、酶的活力回收率、酶的活力回收率 固定化酶的活力下降到为

19、初始活力一半所经固定化酶的活力下降到为初始活力一半所经历的时间，用历的时间，用t1/2表示，它是衡量固定化酶操作表示，它是衡量固定化酶操作稳定性的关键。稳定性的关键。3 3、固定化酶的半衰期、固定化酶的半衰期-以酶以酶 为催化剂进行反应所需要的设备为催化剂进行反应所需要的设备搅拌罐型搅拌罐型:间歇式间歇式 连续式连续式 多级连续式多级连续式;固定床固定床(填充床填充床)型型:带循环式带循环式 列管式列管式 流化床型流化床型膜式膜式:平板状平板状 螺旋卷型螺旋卷型 转盘式转盘式 空心管式空心管式 利用酶的催化作用将糖类、醇类、有机酸、氨基利用酶的催化作用将糖类、醇类、有机酸、氨基酸等生物分子氧化

20、或分解，然后通过换能器将反酸等生物分子氧化或分解，然后通过换能器将反应过程中化学物质的变化转变为电信号记录下来，应过程中化学物质的变化转变为电信号记录下来，进而推出相应的生物分子浓度。进而推出相应的生物分子浓度。酶传感器是间接型传感器，它不是直接测定待测酶传感器是间接型传感器，它不是直接测定待测物质，而是通过对反应有关物质的浓度测定来推物质，而是通过对反应有关物质的浓度测定来推断底物的浓度。断底物的浓度。目前国际上已研制成功的酶传感器有目前国际上已研制成功的酶传感器有2020余种，其余种，其中最为成熟的传感器是葡萄糖传感器。中最为成熟的传感器是葡萄糖传感器。酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合

21、的酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。用于样品组分的分析检测，有快速、传感装置。用于样品组分的分析检测，有快速、方便、灵敏、精确的特点。方便、灵敏、精确的特点。所用的酶必须具有较强的专一性，并且要有一所用的酶必须具有较强的专一性，并且要有一定的纯度。固定化方法一般采用凝胶包埋法制成定的纯度。固定化方法一般采用凝胶包埋法制成强度较高、通透性较好、厚度较小的酶膜，并将强度较高、通透性较好、厚度较小的酶膜，并将它与适宜的电极紧密结合。它与适宜的电极紧密结合。酶电极是应用最广泛的一种酶传感器酶电极是应用最广泛的一种酶传感器 酶酶细胞细胞稳定性，不适合大量生产的需要；稳定性，不适合大量生产的

22、需要；酶的最适酶的最适pHpH中性，工业应用的中性，工业应用的pHpH值要求不一，值要求不一，使酶难于发挥作用；使酶难于发挥作用；在临床应用上，绝大多数酶对人体而言属于外在临床应用上，绝大多数酶对人体而言属于外 源蛋白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏源蛋白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏反应。反应。酶在应用上暴露出来的一些缺点酶在应用上暴露出来的一些缺点(1)(1)通过分子修饰的方法来改变已分离出通过分子修饰的方法来改变已分离出 来的天然酶的结构来的天然酶的结构(2)(2)通过生物工程方法改造编码酶分子的通过生物工程方法改造编码酶分子的 基因从而达到改造酶的目的基因从而达到改造

23、酶的目的 通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，以改变酶的一些性质，创造酶分子进行改造，以改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用，以达到较高的经济效益。用，以达到较高的经济效益。1 1、提高酶活力；、提高酶活力；2 2、改进酶的稳定性；、改进酶的稳定性；3 3、允许酶在一个变化的环境中起作用；、允许酶在一个变化的环境中起作用；4 4、改变最适、改变最适pHpH值或温度；值或温度；5、改变酶的特异性使它能催化不同底物的转化；、改变酶的特异性使它能催化不同底物的转化；6 6、改变催化

24、反应类型；、改变催化反应类型；7 7、提高过程的反应效率。、提高过程的反应效率。使酶与其它大分子结合，形成复合物，就可使酶与其它大分子结合，形成复合物，就可起到保护酶的天然构象的作用，从而增加酶的稳起到保护酶的天然构象的作用，从而增加酶的稳定性。定性。酶活力提高酶活力提高 使酶活性中心更有利于和底物结合，并形成使酶活性中心更有利于和底物结合，并形成准确的催化部位，从而提高酶活。准确的催化部位，从而提高酶活。酶的稳定性增加酶的稳定性增加 当外源蛋白非经口进入人或动物体内后，体内当外源蛋白非经口进入人或动物体内后，体内血清就可能出现与此外源蛋白特异结合的物质，这血清就可能出现与此外源蛋白特异结合的

25、物质，这些物质称为抗体，能引起体内产生抗体的物质称为些物质称为抗体，能引起体内产生抗体的物质称为抗原，如精氨酸酶经聚乙二醇结合修饰后，其抗原抗原，如精氨酸酶经聚乙二醇结合修饰后，其抗原性显著降低；用聚乙二醇对色氨酸酶进行修饰，可性显著降低；用聚乙二醇对色氨酸酶进行修饰，可完全消除该酶的抗原性。完全消除该酶的抗原性。酶的抗原性消除或降低酶的抗原性消除或降低生物酶工程主要包括：生物酶工程主要包括：用基因工程技术大量生产酶（用基因工程技术大量生产酶（）；）；修饰酶基因，产生遗传修饰（修饰酶基因，产生遗传修饰（突变酶突变酶）；）；设计出新酶基因，合成自然界从未有过的酶设计出新酶基因，合成自然界从未有过的酶（新酶新酶）。）。目前已有目前已有100多种酶基因克隆成功，包括尿激多种酶基因克隆成功，包括尿激酶基因、凝乳酶基因等。酶基因、凝乳酶基因等。