氨基酸和蛋白质药物的分析课件.ppt

1、第十一章第十一章 氨基酸与蛋白质氨基酸与蛋白质 药物的分析药物的分析第一节第一节 氨基酸类药物的分析氨基酸类药物的分析第二节第二节 蛋白质类药物的分析蛋白质类药物的分析（一）氨基酸的通式：（一）氨基酸的通式：-氨基酸氨基酸C O O HCHH2NR不变部分不变部分可变部分可变部分 一一.氨基酸的结构与分类氨基酸的结构与分类为什么称为为什么称为 氨基酸？氨基酸？与羧基相邻的与羧基相邻的 碳原子上都有一个氨基。碳原子上都有一个氨基。羧基羧基 H2NCHCOOHR氨基氨基硒代半胱氨酸什么叫非极性氨基酸？氨基酸的理化性质一般物理性质 氨基酸的酸碱性质氨基酸的化学反应 氨基酸为无色晶体，不同氨基酸氨基酸

2、为无色晶体，不同氨基酸其晶体形状不相同。其晶体形状不相同。氨基酸熔点一般在氨基酸熔点一般在200200300300C C。氨基酸的溶解度：水中溶解度氨基酸的溶解度：水中溶解度 差别差别大，能溶解于烯酸、烯碱，不溶于有机大，能溶解于烯酸、烯碱，不溶于有机溶剂溶剂 各种氨基酸有不同的味感（味精：各种氨基酸有不同的味感（味精：谷氨酸钠）谷氨酸钠）（一）一（一）一 般般 物物 理理 性性 质质 构型：构型：组成蛋白质的氨基酸除组成蛋白质的氨基酸除GlyGly以外都有手性碳原子（以外都有手性碳原子（-碳是一个手性碳原子），在），在三维三维空间上就有两种不同的排列方式，它们空间上就有两种不同的排列方式，它

3、们互为镜影，这两种不同的构型分别称为互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-D-型和型和L-L-型。型。-氨基酸有两种构型:D构型和L构型 它们是与甘油醛或乳酸相比较而决定的。凡是与L甘油醛（或L乳酸）构型相同的，就定义为L氨基酸，反之为D氨基酸。蛋白质中的氨基酸都是蛋白质中的氨基酸都是L-L-型。型。(Gly除外除外)（1）氨基酸的光学活性和光谱性质氨基酸的光学活性和光谱性质以丙氨酸为例：以丙氨酸为例：旋光性：旋光性：组成蛋白质的氨基酸除组成蛋白质的氨基酸除GlyGly以外，都有手性碳原子，以外，都有手性碳原子，所以所以都有都有旋光性旋光性，能使偏振光的偏振面向左或向右旋转，向左旋转，能使偏振

4、光的偏振面向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用的称左旋，用“一一”号表示，向右旋转的称右旋，用号表示，向右旋转的称右旋，用“”号号表示。表示。当将等量的右旋体和左旋体混合时，两者的旋光能力相同，但方向当将等量的右旋体和左旋体混合时，两者的旋光能力相同，但方向相反，旋光作用互相抵消，旋光性消失。此混合物称相反，旋光作用互相抵消，旋光性消失。此混合物称外消旋体外消旋体.构成蛋白质的构成蛋白质的2020种氨基酸在可见光区都种氨基酸在可见光区都没有光吸收，在红外区和远紫外区（没有光吸收，在红外区和远紫外区（200nm200nm）都有光吸收）都有光吸收.但芳香族氨基酸因为其但芳香族氨基酸因为其R R基含

5、有苯环共轭基含有苯环共轭键系统，键系统，在近紫外区在近紫外区(200-400nm)(200-400nm)酪酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。力。n蛋白质一般在蛋白质一般在280nm280nm有最大光吸收，可有最大光吸收，可用来测定蛋白质浓度。用来测定蛋白质浓度。氨基酸的光吸收：氨基酸的光吸收：分光光度法分光光度法的原理是的原理是Lamber-Beer(朗伯比尔朗伯比尔)定律定律：A=log I0/I=-log T=cl T=I/I0 A：吸光值（吸光值（absorbance）（光密度（光密度,optical density,OD）：摩尔吸收系数（摩尔消光

6、系数）摩尔吸收系数（摩尔消光系数）c：摩尔浓度摩尔浓度 l：比色杯的内径或光程厚度比色杯的内径或光程厚度 I0：入射光强入射光强 I：透射光强透射光强 T：透光率透光率不同蛋白质中这些氨基酸的含量不同，所以它们的摩尔吸收系数是完全不同的不同蛋白质中这些氨基酸的含量不同，所以它们的摩尔吸收系数是完全不同的（2 2）氨基酸的酸碱性质）氨基酸的酸碱性质1 1、氨基酸的两性离子形式、氨基酸的两性离子形式 l氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子形式存在，而是离解成两性离子。在两

7、性离子中，氨基是以质子化化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。存在。H2NCHCOOHR +H3NCHCOO-R不带电形式两性离子形式 氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有样接受质子，氨基酸具有酸碱性质酸碱性质，是一类两性电解质是一类两性电解质。H2NCHCOORH3NCHCOOR-+-+H+As an acid（proton donor）：）：As a base（proton acceptor）：）：H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H+2

8、2、氨基酸的解离、氨基酸的解离 氨基参加的反应氨基参加的反应氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应 羧基参加的反应羧基参加的反应侧链功能基团参加的反应侧链功能基团参加的反应（3 3）氨基酸的化学反应）氨基酸的化学反应u与亚硝酸反应与亚硝酸反应这是Van Slyke（范斯来克）法测定氨基酸的基础。RCHNH2COOH+HNO2RCHOHCOOH+H2O+N2测量氮气的体积可计算氨基酸的含量。3.1-氨基参加的反应氨基参加的反应u与酰化试剂反应与酰化试剂反应CH2OCOClH2NCHCOONaR在弱碱中（后酸化）苄氧酰氯苄氧酰氨基酸CH2OCONHCHCOONaR+Na+Cl-+这些酰化试剂在多肽和蛋白

9、质的人工合成中被用作氨基的保护试剂。（1）与）与2，4二硝基氟苯的反应二硝基氟苯的反应 在弱碱性溶液中，氨基酸的在弱碱性溶液中，氨基酸的氨基容易与氨基容易与2，4二硝基二硝基氟苯的反应（氟苯的反应（DNFB）作用，生成稳定的）作用，生成稳定的黄色黄色2，4二硝基苯二硝基苯氨基酸氨基酸（简写（简写DNP氨基酸）。氨基酸）。H2NHCCOOHR+FO2NNO2在弱碱中HNHCCOOHR+F-O2NNO2DNP-氨基酸（黄色）氨基酸（黄色）u 烃基化反应烃基化反应（sanger反应）反应）3.2 与异硫氰酸苯酯的反应与异硫氰酸苯酯的反应 在弱碱条件下，氨基酸中的在弱碱条件下，氨基酸中的氨基和可以与氨

10、基和可以与异硫氰酸苯酯（异硫氰酸苯酯（PITC，Edman（埃德曼埃德曼）试剂）试剂）反应，生）反应，生成成苯胺基硫甲酰氨基酸苯胺基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）氨基酸）H2NCCOOHR+在弱碱中NCSHPITCPTC-氨基酸氨基酸PTH-氨基酸氨基酸NCNCCHHOOHRHSH+NCNCCOHRHS（Edman反应）反应）氨基酸与异硫氰酸苯酯的反应的应用氨基酸与异硫氰酸苯酯的反应的应用多肽链多肽链N-末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定（Edman法）法）蛋白质多肽链的蛋白质多肽链的N-端氨基酸在弱碱条件下也可以与端氨基酸在弱碱条件下也可以与PITC起起反应生成反应生成PTC蛋白质，在

11、酸性溶液中，末端的蛋白质，在酸性溶液中，末端的PTH氨基酸被氨基酸被释放，形成了少一个氨基酸的多肽链。释放，形成了少一个氨基酸的多肽链。PTH氨基酸可以用乙酸氨基酸可以用乙酸乙酯抽提，用纸层析进行鉴定，乙酯抽提，用纸层析进行鉴定，确定肽链确定肽链N-端氨基酸端氨基酸。重复应。重复应用这种方法就可以测出多肽链用这种方法就可以测出多肽链N-端的氨基酸顺序。端的氨基酸顺序。多肽序列自动分多肽序列自动分析仪的工作原理析仪的工作原理基于此反应。基于此反应。u成盐和成酯反应成盐和成酯反应NH2CHCOOHRNH2CHCOOC2H5R+C2H5OH干燥，HCl回流+H2O（2）-羧基参加的反应羧基参加的反应

12、氨基酸乙酯的盐酸盐在特定的化学反应中保护羧基，活化氨基。在特定的化学反应中保护羧基，活化氨基。氨基酸酯是制备氨基酸的酰胺或酰肼的中间物氨基酸酯是制备氨基酸的酰胺或酰肼的中间物u成酰氯反应成酰氯反应HNCHCOOHRHNCHCOOCIR+PCl5+POCl3 +HCl保护基保护基这个反应可使氨基酸的羧基活化，使它容易与另一氨基酸的氨基结合，用于多肽人工合成。u脱羧基反应脱羧基反应NH2CHCOOHRCH2NH2R+CO2脱羧酶一级胺-氨基和氨基和-羧基共同参加的反应羧基共同参加的反应u与茚三酮的反应与茚三酮的反应-氨基酸与水合茚三酮试剂共氨基酸与水合茚三酮试剂共热，可发生反应生成热，可发生反应生

13、成紫化合物紫化合物。反应生成的化合物的颜色深浅反应生成的化合物的颜色深浅程度以及程度以及CO2生成量，均可作为生成量，均可作为氨基酸定量分析依据。氨基酸定量分析依据。用途：常用于氨基酸的定性或定量检测。-氨基和氨基和-羧基共同参加的反应羧基共同参加的反应 脯氨酸和羟脯氨酸与茚脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质三酮反应产生黄色物质水合茚三酮水合茚三酮3.3 3.3 侧链侧链R R基参加的反应基参加的反应1.酪氨酸可发生碘化、硝化、重氮反应，后者可用于检测酪氨酸。2.组氨酸可发生重氮反应。3.精氨酸可与环己二酮发生缩合反应，曾被用于氨基酸序列分析。4.色氨酸可被N-溴代琥珀酰亚胺氧化，生成有

14、色化合物，可用于色氨酸定量测定。5.半胱氨酸可生成烷基衍生物，可用于巯基的保护。巯基可与重金属生成盐，使蛋白质失活。巯基在空气中可被氧化，金属离子对此有催化作用。6.胱氨酸的二硫键可被还原为两个巯基。也可以被过甲酸氧化成两个磺酸基。u侧链侧链R基参加的反应基参加的反应其中有些反应是蛋白质化学修饰的基础。NNNNHOCH2CHNH2COOHHO3SHO3SPauly(波利)反应，可用于检测酪氨酸。半胱氨酸侧链上的巯基（-SH），反应性能很高，在微碱性pH下，-SH基发生解离形成硫醇阴离子（-CH2S-）。并可进一步与烷化剂反应生成稳定的烷基衍生物：-OOCCHCH2NH3+S-OOCCHCH2N

15、H3+SCH2COO-+I-+ICH2COO-半胱氨酸碘乙酸羧甲基半胱氨酸与乙撑亚胺乙撑亚胺反应HOOCCHNH3+CH2SHH2CH2CNHHOOCCHNH3+CH2SCH2CH2NH3+H+氮丙啶S-氨乙基半胱氨酸 (AECys)+可用于序列测定(为胰蛋白酶提供了一个新位点)。也可用来保护肽链上的SH基，以防止被重新氧化为二硫基。胱氨酸中的二硫键在稳定蛋白质的构象上起很大的作用。氧化剂和还原剂都可打开二硫键。如过甲酸过甲酸和巯基化合物巯基化合物H2NHCCOOHCH2SSCH2CHH2NCOOHH2NHCCOOHCH2SO3HH2NHCCOOHH2CSH6HCOOOH2R-SH22+6HC

16、OOHRSSR二、蛋白质二、蛋白质氨基酸是蛋白质的基本组成单位。从氨基酸是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由细菌到人类，所有蛋白质都由2020种种L-L-标准氨基酸标准氨基酸（standard amino acids)组组成。成。蛋白质的氨基酸组成蛋白质的氨基酸组成二、蛋白质的性质二、蛋白质的性质o 高分子有机物高分子有机物o 两性电解质两性电解质o 双缩脲反应双缩脲反应o 福林酚反应福林酚反应o 紫外吸收紫外吸收 280蛋白质为高分子有机物蛋白质为高分子有机物o 蛋白质水溶液具有亲水胶体的性质，另外还具有蛋白质水溶液具有亲水胶体的性质，另外还具有扩散和扩散和沉降沉降作用，粘度

17、大和不透过作用，粘度大和不透过半透膜半透膜等。等。o 沉降常数（沉降常数（S）：是单位引力场的沉降分子下降）：是单位引力场的沉降分子下降速度。速度。o 扩散常数（扩散常数（D）：指单位浓度梯度、单位时间和）：指单位浓度梯度、单位时间和单位扩散面积时的扩散量。单位扩散面积时的扩散量。o 粘度：在一定溶质浓度下，取决于溶质的分子量粘度：在一定溶质浓度下，取决于溶质的分子量和形状。和形状。蛋白质为两性电解质蛋白质为两性电解质o 蛋白质分子至少具有一个自由氨基和一个蛋白质分子至少具有一个自由氨基和一个自由羧基，具有自由羧基，具有两性解离性质两性解离性质。o 在水溶液中蛋白质的等电点一般偏酸。在水溶液中

18、蛋白质的等电点一般偏酸。o 由于蛋白质的两性性质，可以进行蛋白质由于蛋白质的两性性质，可以进行蛋白质电泳、离子交换。电泳、离子交换。蛋白质两性解离性质和等电点蛋白质两性解离性质和等电点pH=pI 净电荷净电荷=0 pH pI净电荷为负净电荷为负PrCOOHNH3+H+OH-+H+OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+当蛋白质溶液在某一定当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的时溶液的pH值即为该蛋白质的值即为该

19、蛋白质的等电点等电点（isoelectric point，pI）。）。双缩脲反应双缩脲反应o 双缩脲试剂的成分双缩脲试剂的成分:浓度为浓度为0.1 g0.1 gmLmL的氢氧化钠溶的氢氧化钠溶液和浓度为液和浓度为0.01 g0.01 gmLmL的硫酸铜溶液。的硫酸铜溶液。o 碱性溶液中，碱性溶液中，双缩脲双缩脲(H(H2 2NOCNOCNHNHCONHCONH2 2)能与能与CuCu2+2+作作用，形成紫色或紫红色的络合物。用，形成紫色或紫红色的络合物。双缩脲反应 蛋白质在碱性溶液中也蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物产生红紫色络合物红紫色络合

20、物红紫色络合物(硷性溶液硷性溶液)Cu2+福林酚反应（福林酚反应（Lowry）o 包括两步反应：包括两步反应：o（1）在碱性条件下，与铜试剂作用生成）在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白蛋白质铜络合物质铜络合物；o（2）此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，）此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。浅与蛋白含量成正相关。o 在在650nm比色测定的灵敏度比双缩脲法高比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。该法适于微量蛋白的测定。倍。该法适于微量蛋白的测定。蛋白质的紫外吸收光谱蛋白质的紫外吸收光谱 蛋白质在远

21、紫外光蛋白质在远紫外光区（区（200-230nm200-230nm）有较）有较大的吸收，在大的吸收，在280nm280nm有有一特征吸收峰，可利用一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。定性定量鉴定。第三节第三节 鉴别与检查鉴别与检查三三 检查检查n一般检查n蛋白质检查n有关物质n纯度第三节第三节 氨基酸的含量分析氨基酸的含量分析（一）（一）茚三酮法茚三酮法 （二）三硝基苯磺酸法（二）三硝基苯磺酸法 （三）铜复合物紫外吸收法（三）铜复合物紫外吸收法 （四）（四）甲醛滴定法甲醛滴定法 （五）（五）非水溶液滴定法非水溶液滴定法 （六）（六）双波长分光光度法双波长分

22、光光度法（七）（七）导数分光光度法导数分光光度法 （八）（八）HPLCHPLC法法（一）茚三酮法（一）茚三酮法 当茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧当茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成还原型水合茚三酮还原型水合茚三酮。还原型茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合生成蓝紫色还原型茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合生成蓝紫色的，最大吸收值的波长为的，最大吸收值的波长为570 nm。测定范围是测定范围是0.5-50g氨基酸。氨基酸。（二）三硝基苯磺酸法（二）三硝基苯磺酸法 TNBS在偏碱性的条件下与氨

23、基酸反应，先在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成形成中间络合物中间络合物。中间络合物有二个吸收峰，位于中间络合物有二个吸收峰，位于355nm和和420nm附近。附近。酸性溶液中，中间络合物转化成酸性溶液中，中间络合物转化成TNB-氨基氨基酸酸，吸收值移至，吸收值移至340nm处。处。（三）铜复合物紫外吸收法（三）铜复合物紫外吸收法 在合适的在合适的pH条件下，二分子条件下，二分子-氨基酸与一分子铜氨基酸与一分子铜离子形成离子形成氨基酸氨基酸-铜复合物铜复合物。复合物呈蓝色，除了在复合物呈蓝色，除了在620nm有吸收峰外，在有吸收峰外，在230nm有最大吸收有最大吸收。测定范围是测定范围是50-

24、500 mol/ml。适用于蛋白质水解速度和适用于蛋白质水解速度和水解程度水解程度的测定。的测定。（四）甲醛滴定法（四）甲醛滴定法 在在pH中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基结合，使平衡上的氨基结合，使平衡向右移动向右移动，促进氢离，促进氢离子释放，使溶液酸度增加。子释放，使溶液酸度增加。可用酚酞作指示剂，以氢氧化钠来滴定。可用酚酞作指示剂，以氢氧化钠来滴定。每释放出一个氢离子，就相当有一个每释放出一个氢离子，就相当有一个氨基氮。氨基氮。（五）非水溶液滴定法（五）非水溶液滴定法 非水溶液滴定法：是氨基酸在非水溶液滴定法：是氨基酸在冰醋酸中冰醋酸中用用高

25、高氯酸的标准溶液氯酸的标准溶液滴定其含量。滴定其含量。酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱。酸，能接受质子的物质为碱。弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强。碱性溶剂中酸性显得更强。适合于氨基酸适合于氨基酸成品成品的含量测定，测定范围是的含量测定，测定范围是几十毫克的氨基酸。几十毫克的氨基酸。非水溶液滴定法非水溶液滴定法 直接滴定法直接滴定法：适用于能：适用于能溶于溶于冰醋酸的氨基冰醋酸的氨基酸。丙氨酸、精氨酸、组胺酸、亮氨酸、酸。丙氨酸、精氨酸、组胺酸、亮氨酸、苯丙氨酸

26、、色氨酸、苏氨酸等。苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸等。回滴法回滴法：适用于不能：适用于不能溶于冰醋酸而能溶于溶于冰醋酸而能溶于高氯酸高氯酸的氨基酸。赖氨酸、丝氨酸、半胱的氨基酸。赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等。氨酸等。第四节第四节 蛋白质类药物的含量测蛋白质类药物的含量测定定 n 凯氏定氮法凯氏定氮法n 双缩脲法双缩脲法n 福林酚法福林酚法n 紫外光吸收法紫外光吸收法n 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250法法n BCA法法凯氏定氮法凯氏定氮法n原理：原理：n当蛋白质与浓硫酸共热时，被氧化为二氧化碳当蛋白质与浓硫酸共热时，被氧化为二氧化碳和水，而和水，而氮转化为氨氮转化为氨，氨与硫酸结合成，氨与硫酸结合成硫酸

27、胺硫酸胺，此过程称为此过程称为“消化消化”。硫酸铜用作催化剂。硫酸铜用作催化剂。n消化完成后，消化液转入凯氏定氮仪反应室中，消化完成后，消化液转入凯氏定氮仪反应室中，加入过量浓氢氧化钠，使加入过量浓氢氧化钠，使硫酸胺分解放出氨硫酸胺分解放出氨，借助蒸汽蒸馏法，将借助蒸汽蒸馏法，将NH3驱入过量的标准硼酸驱入过量的标准硼酸溶液中，然后用标准盐酸进行滴定，根据所测溶液中，然后用标准盐酸进行滴定，根据所测定的氨量，计算样品的含氮量及蛋白质含量。定的氨量，计算样品的含氮量及蛋白质含量。反应式n 操作方法：操作方法：n1、样品处理、样品处理：恒重：恒重n2、消化、消化：准确称量的蛋白质样品转入凯氏烧瓶消

28、化：准确称量的蛋白质样品转入凯氏烧瓶消化n3、蒸馏和吸收、蒸馏和吸收：n （1）、）、洗涤洗涤：n （2）、）、加样加样：n （3）、）、蒸馏吸收蒸馏吸收：n4、滴定、滴定：n5、计算、计算：n样品中总氮量（）（样品中总氮量（）（A-B）0.100 14 C 1000nA为样品中用去的盐酸平均毫升数，为样品中用去的盐酸平均毫升数，B为空白样品用去的盐酸为空白样品用去的盐酸平均毫升数，平均毫升数，C为称样的克数，为称样的克数，0.100 为盐酸的摩尔浓度，为盐酸的摩尔浓度，14为氮的原子量。为氮的原子量。凯氏定氮法优缺点凯氏定氮法优缺点n优点：优点：准确准确，干扰少。，干扰少。n注意事项：测试样

29、品中是否还含有其它含注意事项：测试样品中是否还含有其它含氮化合物。氮化合物。n适用范围：适用范围：0.2-1.0mg氮。氮。n相对误差小于相对误差小于2。双缩脲法双缩脲法n原理：原理：n蛋白质含有两个以上的蛋白质含有两个以上的肽键肽键，因此有双缩脲，因此有双缩脲反应。反应。n在碱性溶液中与在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，形成紫红色络合物，其其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。n 540nm比色比色n特点：快速，硫酸胺不干扰，有利于蛋白质特点：快速，硫酸胺不干扰，有利于蛋白质纯化的早期步骤测定。纯化的早期步骤测定。n范围：范围：110mg蛋白质蛋白质/ml.双

30、缩脲法操作双缩脲法操作n双缩脲试剂双缩脲试剂：n 1.5克硫酸铜（克硫酸铜（CuSO45H2O）n 6.0克酒石酸钾钠，用克酒石酸钾钠，用500ml水溶解水溶解 定容至定容至1000mln 300ml 10NaOH溶液，溶液，n测定：样品（标准品）测定：样品（标准品）1ml，加双缩脲试剂，加双缩脲试剂4ml，充，充分混匀，室温放置分混匀，室温放置30分钟，与分钟，与540nm比色。比色。微量双缩脲法微量双缩脲法n原理：原理：n铜与蛋白质的复合物最大吸收峰在铜与蛋白质的复合物最大吸收峰在260280nm，此区域干扰因素大，因此选择此区域干扰因素大，因此选择310330nm 测定，测定，比比540

31、nm灵敏灵敏10倍以上。倍以上。n310nm进行比色测定，测定范围进行比色测定，测定范围0.11.0mg。n330nm进行比色测定，测定范围进行比色测定，测定范围0.22.0mg。Folin酚酚试剂法（试剂法（LowryLowry）n原理：原理：n蛋白质用碱性铜溶液（蛋白质用碱性铜溶液（酚酚试剂）处理，使其形试剂）处理，使其形成铜蛋白质络合物。成铜蛋白质络合物。n该络合物中的酪氨酸、色氨酸能还原该络合物中的酪氨酸、色氨酸能还原磷钼酸磷钼酸磷钨酸试剂磷钨酸试剂（Folin试剂）试剂），产生深蓝色。，产生深蓝色。n660nm 660nm 测定范围测定范围0.030.25mg/mln灵敏度为双缩脲法

32、的灵敏度为双缩脲法的100倍倍。Folin 酚酚试剂法试剂法nFolin 酚酚试剂法试剂法定量蛋白质的方法简单、灵定量蛋白质的方法简单、灵敏，是一般实验室最广泛采用的方法。敏，是一般实验室最广泛采用的方法。n n缺点：缺点：n蛋白质蛋白质/蛋白质间测定值差异较大蛋白质间测定值差异较大n干扰因素多干扰因素多：Tris、EDTA、蔗糖、甘油、糖、蔗糖、甘油、糖类、还原剂、金属离子、硫酸胺乙醇、乙醚、类、还原剂、金属离子、硫酸胺乙醇、乙醚、丙酮、脂类等化合物对测定有影响。丙酮、脂类等化合物对测定有影响。紫外吸收法紫外吸收法 n（1）280nm波长的测定法、波长的测定法、n（2）280nm与与260n

33、m吸收差法吸收差法n（3）215nm与与225nm吸收度差法吸收度差法的测定法。的测定法。n紫外吸收法是将样品溶液直接在紫外分光光紫外吸收法是将样品溶液直接在紫外分光光度计下测定的方法。度计下测定的方法。n测定后的测定后的样品能够回收样品能够回收，操作简单。，操作简单。n柱层析蛋白质定量、贵重的蛋白质定量柱层析蛋白质定量、贵重的蛋白质定量280nm波长波长n原理：原理：n蛋白质溶液强烈地吸收蛋白质溶液强烈地吸收280nm附近的紫外附近的紫外光，这是由于蛋白质的光，这是由于蛋白质的色氨酸、酪氨酸及色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸苯丙氨酸残基而引起的残基而引起的。n通常以浓度通常以浓度1mg蛋白质蛋白质/

34、ml溶液的溶液的A280为为1.0进行估算。进行估算。n该法测定范围：该法测定范围：0.010.1mg/ml.n受受pH影响。影响。280nm与与260nm吸收差法吸收差法n如核酸的含量为蛋白质含量如核酸的含量为蛋白质含量20%以下以下时，根据时，根据在在280nm和和260nm处的吸收度求出蛋白质的处的吸收度求出蛋白质的含量。含量。n经验式：经验式：n蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A2800.74A260 215nm与与225nm吸收差法吸收差法n肽或蛋白溶液在肽或蛋白溶液在200225nm的范围内，表现出的范围内，表现出强烈的选择性吸收，在强烈的选择性吸收，在波长减少时波长

35、减少时吸收度急剧地增吸收度急剧地增加。加。n主要原因是由于主要原因是由于蛋白质的肽键蛋白质的肽键。n测定范围：测定范围：20100g/ml。n蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml）=0.144（A215A225）n优点：用量少，可回收，不必作标准曲线，优点：用量少，可回收，不必作标准曲线，考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250法法 n原理：考马斯亮蓝原理：考马斯亮蓝G-250为一种阴离子染料，与蛋白为一种阴离子染料，与蛋白质结合变为蓝色，质结合变为蓝色，595nm处有处有最大吸收，最大吸收，A595与蛋与蛋白质浓度成正比。白质浓度成正比。n优点：优点：灵敏度高灵敏度高，显色反应快显色反应快而且稳定，干扰

36、物质少。而且稳定，干扰物质少。n测定范围：测定范围：0.011.0mg 蛋白质蛋白质/ml。4-甲酸喹啉法甲酸喹啉法 n原理：原理：碱性条件下，蛋白质与两价铜离子反应碱性条件下，蛋白质与两价铜离子反应中生成的中生成的CU+。n4-甲酸喹啉甲酸喹啉（BCA）与）与CU+作用形成紫色络作用形成紫色络合物，在较广合物，在较广pH范围内，反应生成的颜色与蛋范围内，反应生成的颜色与蛋白质浓度成正比白质浓度成正比(A562nm)。方法与注意点方法与注意点n方法：方法：n蛋白质样液蛋白质样液0.1ml与试剂溶液与试剂溶液2.0ml混合，混合，37保温保温30分钟。测分钟。测562nm处吸收度，标准蛋白平行处

37、吸收度，标准蛋白平行操作。操作。n注意点：注意点：nBCA法除对法除对还原糖的干扰敏感还原糖的干扰敏感（糖可将（糖可将Cu2+还原还原为为Cu+）。）。n灵敏灵敏，测定不同种类蛋白质变异系数小。，测定不同种类蛋白质变异系数小。n测定范围：测定范围：0.510g/ml常用蛋白质定量方法优缺点比较常用蛋白质定量方法优缺点比较 方方 法法需蛋白质量需蛋白质量（mg/ml）破坏破坏与否与否不同蛋白不同蛋白质间差异质间差异优缺点优缺点双缩脲法双缩脲法1-10是是少少腐蚀性试剂干扰，腐蚀性试剂干扰，快快Lowry法法0.03-0.5是是中等中等显色慢，试剂干扰显色慢，试剂干扰凯氏定氮法凯氏定氮法0.2-1

38、是是少少慢，准确，干扰少慢，准确，干扰少A280/A260nm0.1-1否否大大试剂有紫外吸收干扰试剂有紫外吸收干扰A215/A225nm0.02-0.1否否少少同上同上考马斯亮篮考马斯亮篮G-2500.01-1是是中等中等显色快、简单显色快、简单BCA0.0005-0.01是是少少灵敏灵敏含量测定方法选择含量测定方法选择 样品小部分是蛋白质样品小部分是蛋白质n1 样品丰富时样品丰富时n （1）凯氏定氮法（）凯氏定氮法（2）色素结合法）色素结合法n2 样品少时样品少时n （1）微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法，（，（2）色素结合法，（）色素结合法，（3）Folin 酚酚试剂法试剂法n样品大部分是蛋

39、白质样品大部分是蛋白质n1 样品丰富时样品丰富时n （1）凯氏法（）凯氏法（2）双缩脲法（）双缩脲法（3）紫外光谱吸收法（）紫外光谱吸收法（280nm）n2 样品少时样品少时n （1）紫外光谱吸收法（）紫外光谱吸收法（215-225nm）（）（2）色素结合法）色素结合法n （3）Folin 酚酚试剂法试剂法 （4）微量双缩脲法）微量双缩脲法n3 样品连续地产生时样品连续地产生时n（1）紫外光谱吸收法紫外光谱吸收法，（，（2）Folin 酚酚试剂法试剂法（3）微量双缩脲法）微量双缩脲法蛋白质药物分析实例：胰岛素蛋白质药物分析实例：胰岛素 n本品为自猪、牛等食用动物胰脏提取而得的本品为自猪、牛等食

40、用动物胰脏提取而得的高高纯度蛋白质纯度蛋白质，是胰脏，是胰脏细胞分泌的激素，能降细胞分泌的激素，能降低血糖，为重要的蛋白质类药品。低血糖，为重要的蛋白质类药品。n本品为本品为五十一肽五十一肽，分子量约，分子量约57005700。晶体胰岛素。晶体胰岛素含锌约含锌约0.4%。等电点。等电点5.305.35。在。在pH2.53.5微酸溶液中稳定，微碱溶液中不稳定，遇蛋微酸溶液中稳定，微碱溶液中不稳定，遇蛋白酶、强酸、强碱均能破坏。白酶、强酸、强碱均能破坏。胰岛素胰岛素n【性状】本品为白色或类白色的结晶性粉末。在水、乙醇、氯仿或乙【性状】本品为白色或类白色的结晶性粉末。在水、乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶

41、，在无机酸或氢氧化钠中易溶。醚中几乎不溶，在无机酸或氢氧化钠中易溶。n【鉴别】（【鉴别】（1）取本品）取本品10mg，加用酸调节，加用酸调节pH2.53.0水水6ml，应能，应能完全溶解，调完全溶解，调pH5.3，即发生沉淀，调，即发生沉淀，调pH 8.08.5，溶解。（，溶解。（等电等电点点5.305.35）。）。n（2）HPLC：十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱，检测波长：十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱，检测波长214。（与（与同种属同种属对照品主峰保留时间一致）。对照品主峰保留时间一致）。n（3）取本品适量，加用酸调节）取本品适量，加用酸调节pH2.53.0的水制成每的水制成每1ml中含中含5

42、单单位的溶液。在位的溶液。在2030条件下，取体重条件下，取体重2040g的小鼠的小鼠5只，按每只，按每20g体重皮下注射上述溶液体重皮下注射上述溶液0.25ml，注射后，注射后2小时内，至少应有小时内，至少应有4只只小鼠发生小鼠发生惊厥惊厥。立即给惊厥的小鼠腹腔注射。立即给惊厥的小鼠腹腔注射10%的葡萄糖注射液的葡萄糖注射液1ml，使惊厥停止。，使惊厥停止。检查n吸收度吸收度：取本品，用：取本品，用0.01mol/L盐酸溶液制成每盐酸溶液制成每1ml含含0.5mg的溶液，的溶液，照分光光度法测定，在照分光光度法测定，在276nm的波长处有最大吸收，吸收度为的波长处有最大吸收，吸收度为0.48

43、0.55。n有关蛋白质有关蛋白质：取胰岛素标准品适量，精密称定，用尿素溶液制成每：取胰岛素标准品适量，精密称定，用尿素溶液制成每100l含含0.5 g，1.0g，3.0g，5.0g，及，及100g的溶液。取供试的溶液。取供试品适量精密称定，用尿素溶液制成每品适量精密称定，用尿素溶液制成每100l含含100 g及及500 g的溶的溶液照液照聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定，胶条染色后，目测比较各色带的颜测定，胶条染色后，目测比较各色带的颜色。色。n (1)标准品色带应有明显的梯度；标准品色带应有明显的梯度；n（2）100 g及及500 g供试品管，主带位置应与标准品供试品管，主带位置

44、应与标准品100g主带位主带位置一致；置一致；n（3）100 g供试品管与标准品供试品管与标准品100g主带后泳动较快的一条色带主带后泳动较快的一条色带，颜色不得深于标准品颜色不得深于标准品 3.0 g；n（4）500 g供试品管与标准品供试品管与标准品100g 相应的相应的主带后泳动较慢的一主带后泳动较慢的一条色带条色带，颜色不得深于标准品，颜色不得深于标准品0.5 g。检查n大分子蛋白质大分子蛋白质：取供试品约：取供试品约100mg，精密称定，用，精密称定，用1mol/L醋酸溶液醋酸溶液制成每制成每1ml中含中含50mg的溶液。照柱色谱法，的溶液。照柱色谱法，葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-50，

45、色谱，色谱柱长柱长80cm、内径、内径2cm；洗脱剂为；洗脱剂为1mol/L醋酸溶液，检测波长醋酸溶液，检测波长280nm，流速每小时，流速每小时2225ml，供试品溶液加入量为，供试品溶液加入量为0.6ml。主峰前主峰前洗脱的面积之和洗脱的面积之和应不大于所有洗脱峰面积的应不大于所有洗脱峰面积的1%。n氮氮：取本品：取本品10mg，精密称定，照氮测定法测定，按干燥品计算，含氮，精密称定，照氮测定法测定，按干燥品计算，含氮量应为量应为14.516.0%。n干燥失重：干燥失重：10.0%。n锌锌：取供试品适量及标准锌溶液，分别置：取供试品适量及标准锌溶液，分别置10ml量瓶中，各加硼酸氯化量瓶中

46、，各加硼酸氯化钾缓冲液钾缓冲液2ml，新制的锌试剂溶液，新制的锌试剂溶液1ml，用水稀释至刻度，摇匀，放置，用水稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，照分光光度法，在分钟，照分光光度法，在620nm分别测定吸收度，计算分别测定吸收度，计算每每1000单单位中的含锌量，不得过位中的含锌量，不得过0.4mg。胰岛素效价检测方法胰岛素效价检测方法n胰岛素效价检测方法较多，目前各国药胰岛素效价检测方法较多，目前各国药典比较普遍采用的是典比较普遍采用的是生物检测法生物检测法。n近年来国内外所用新的检测方法：近年来国内外所用新的检测方法：n 放射受体分析放射受体分析n 免疫火箭电泳法免疫火箭电泳法n 高效液相色

47、谱法高效液相色谱法检测法检测法 n1生物检测法生物检测法：兔血糖法兔血糖法，此法是将胰岛素标准品和供，此法是将胰岛素标准品和供试品分别注入家兔皮下，比较二者使家兔血糖降低的程度试品分别注入家兔皮下，比较二者使家兔血糖降低的程度来决定供试品效价。来决定供试品效价。小鼠惊厥法及小鼠血糖法小鼠惊厥法及小鼠血糖法。n2 2、放射受体分析法、放射受体分析法 ：灵敏度高，一般能达到：灵敏度高，一般能达到ngng、pgpg甚至甚至fgfg的水平；特异性强，样品中的待测物质不需提取或纯化；的水平；特异性强，样品中的待测物质不需提取或纯化；简便，可大批检测样品，省人力，便于标准化、药盒化和简便，可大批检测样品，

48、省人力，便于标准化、药盒化和自动化等。自动化等。n胰岛素与受体结合有饱和性胰岛素与受体结合有饱和性。将。将碘标记胰岛素碘标记胰岛素后与受体结后与受体结合，合，天然胰岛素天然胰岛素可以取代与受体结合的碘化胰岛素，当碘可以取代与受体结合的碘化胰岛素，当碘化胰岛素与受体的量固定时，化胰岛素与受体的量固定时，碘化胰岛素碘化胰岛素受体复合物受体复合物就就随天然胰岛素浓度的增加而减少，并呈一定函数关系。随天然胰岛素浓度的增加而减少，并呈一定函数关系。n3 3理化测定方法理化测定方法 理化测定方法理化测定方法 n（1）紫外分光光度法：重复性好，回收率。）紫外分光光度法：重复性好，回收率。n（2）火箭电泳法：

49、特异性强，不受其它组分的干扰，适）火箭电泳法：特异性强，不受其它组分的干扰，适用胰岛素生产的用胰岛素生产的中间检测中间检测。n（3）高效液相色谱法高效液相色谱法：1985年年Smith等用等用RP-HPLC法，法，以以标准峰面积标准峰面积对对效价效价作标准曲线，测定了胰岛素的效价。作标准曲线，测定了胰岛素的效价。此法此法样品用量少样品用量少，并可批量检测，并可批量检测，时间时间仅为生物检测法的仅为生物检测法的1/60，同时还能获得对胰岛素纯度评估必不可少的同时还能获得对胰岛素纯度评估必不可少的杂质杂质种类及含量的信息。种类及含量的信息。高效液相色谱法高效液相色谱法n层析条件：层析条件：n Mo

50、nc QRH5/5色谱柱，色谱柱，n 流动相流动相A：20mmol/L Tris-HCl，n 流动相流动相B：流动相含：流动相含0.5mol/L NaCl，n 检测波长检测波长280nm；n 线性线性NaCl梯度如下：梯度如下：0min：100%A，0%B；n 20min：60%A，40%B。样品测定样品测定n标准曲线制备标准曲线制备：精密称取胰岛素标准品用流动：精密称取胰岛素标准品用流动相相A配成浓度梯度。配成浓度梯度。n分别进样分别进样50l，n按上述层析条件进行色谱分析。按上述层析条件进行色谱分析。n以胰岛素峰面积对浓度作图，以胰岛素峰面积对浓度作图，浓度与峰面积浓度与峰面积成成线性关系