溶瘤病毒在肿瘤诊治中的应用课件.ppt

1、朱华晨2015.09.29n2/3：RNA病毒逆转录病毒，可引起爬行类（蛇）、禽类、哺乳类包括灵长类白血病、肉瘤、淋巴瘤和乳腺瘤等n1/3：DNA病毒包括乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒和疱疹病毒、乙型肝炎样病毒等 逆转录病毒（如T细胞淋巴瘤病毒，HTLVI）乙型肝炎病毒（HBV）DNA病毒 乳头状瘤病毒（HPV）DNA病毒 EpsteinBars病毒（EBV）DNA病毒？汕头大学疫苗、化学药物、单抗、诊断/示踪试剂（病毒与肿瘤）新发传染病未知新病原致瘤病毒病原进化跨物种传播致病机制免疫防御协同创新协同创新人才培养人才培养学科建设学科建设平台与基地建设平台与基地建设1.1.针对传统病原学方法难以

2、在短时间内实现对新型病原体进行准确鉴针对传统病原学方法难以在短时间内实现对新型病原体进行准确鉴定的问题，通过完善病原体定的问题，通过完善病原体高通量快速诊断平台高通量快速诊断平台及及流行病学流行病学调查平调查平台，提高感染性疾病尤其是新发传染性疾病的台，提高感染性疾病尤其是新发传染性疾病的病原学病原学鉴定、诊治以鉴定、诊治以及应对突发公共卫生事件的能力及应对突发公共卫生事件的能力 ，研制开发相关的，研制开发相关的诊断试剂诊断试剂；2.2.针对病毒性传染病普遍缺乏针对病毒性传染病普遍缺乏特异性治疗手段特异性治疗手段的问题，通过深入研究的问题，通过深入研究病原跨种属传播以及与病原跨种属传播以及与宿

3、主互作的宿主互作的分子机制分子机制，开发新型抗病毒，开发新型抗病毒药物药物和疫苗和疫苗；3.3.针对目前肿瘤早期诊断困难、治疗特异性低下的问题，开发针对目前肿瘤早期诊断困难、治疗特异性低下的问题，开发病毒靶病毒靶向载体向载体，用于，用于肿瘤的示踪诊断及治疗肿瘤的示踪诊断及治疗。学科平台学科平台人才人才应用研究应用研究基础研究基础研究其其他他平台基地建设平台基地建设n高通量病原快速诊断与大数据分析平台nII+至III+级生物安全实验室及实验动物平台n疫苗与人源单抗制备平台n高通量肿瘤特异嗜杀性病毒载体筛选平台新城疫病毒与溶瘤病毒治疗新城疫病毒与溶瘤病毒治疗2015.09.29溶瘤病毒溶瘤病毒(o

4、ncolytic virus)Anoncolytic virusisavirusthatpreferentiallyinfectsandkillscancercells.具有复制能力的肿瘤嗜好性杀伤型病毒溶瘤病毒溶瘤病毒(oncolytic virus)l利用靶细胞中抑癌基因的失活或缺陷从而选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终杀伤、裂解肿瘤细胞，而对正常细胞没有杀伤作用。ldirectdestructionofthetumourcells(lysisorapoptosis)直接感染并杀死癌细胞lreleasenewinfectiousvirusparticles复制并杀伤更多癌细胞lst

5、imulatehostanti-tumourimmuneresponses激发免疫反应，吸引更多免疫细胞来继续杀死残余癌细胞l优点：选择性、可自我复制、可改造、可多路径攻击癌症，同时破坏癌细胞的多种进程，并触发“旁观者机制”（安全性、耐药性、持续性？）溶瘤病毒溶瘤病毒(oncolytic virus)l天然对于肿瘤细胞具有特异性感染或杀伤能力的病毒（呼肠孤病毒、细小病毒、新城疫病毒）l经人为改造（专化，强化和弱化）过，对肿瘤细胞具有特异杀伤能力的病毒（甲型流感病毒，腺病毒，麻疹病毒和单纯疱疹病毒）1：去掉毒性基因（弱化、安全）2：加上特异识别癌细胞的特殊蛋白（专化、特异）3：加入激活针对肿瘤的

6、免疫基因（强化、效果）1991，第一个转基因溶癌病毒（HSV）报道；2006，中国批准H101上市History-using wildtype or attenuated virusesl1904,TheLancet：慢性白血病妇女，流感，病变白细胞减少，病情意外好转l1912，Ginecologia,DrDepaceNG(Italy):宫颈癌接种减毒狂犬疫苗，肿瘤自发消退、减小l1950s，西尼罗河病毒、腺病毒天然弱毒株治疗l1970s，水痘病毒vs急性淋巴性白血病l1970s，麻疹vs白血病、Burkitt淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤-potentialriskforhighpathoge

7、nicinfectionsHistory-HSV-1 GM virusesHerpessimplexvirus1(HSV-1)l起步：1991,Science,MartuzaRLetal：HSV-1,失活胸苷激酶基因（TK），裸鼠恶性脑胶质瘤U87治疗l第一代：1716毒株：去除ICP34.5（34.5）神经毒基因，正常细胞可凋亡，病毒无法复制；肿瘤细胞IFN缺失，PKR低表达，病毒可复制并溶瘤l第二代：F及G207毒株：进一步去除ICP6（编码核糖核酸还原酶大亚基），病毒无法正常复制；加入hEndo-Angio（人内皮抑素-血管生成抑素）l第三代：G47毒株：进一步去除47基因，防止已感染肿

8、瘤细胞出现免疫原性低下History-Adenovirus-GM virusesl腺病毒，smallgenome，AdEasysystem,butrelativelylowreplicationONYX-015:首个临床基因重组株（1987加州Onyx公司）；*去除E1B55KDgene，解除对p53的抑制-正常细胞：激活p53，病毒受抑制；-肿瘤细胞：p53缺失，病毒复制H101:世界上首个官方批准上市的溶瘤病毒药物（人5型Adenovirus，上海三维公司）*去除E1B55KD及非必需的E3基因-用于难治性晚期鼻咽癌（配合5-FU，顺铂姑息治疗）第二代：第二代：加肿瘤特异启动子（肿瘤特异抗

9、原，端粒酶，生存素启动子，肝癌特异AFP启动子等）、抑癌基因（IL-24，RNApolIII-dependentU6shRNA，TRAIL）第三代：第三代：进一步去除E1B19KD,E1Abp924-947，加载抑癌基因（HCCS1等）改进：添加治疗基因（转基因治疗载体+溶瘤）History-Cowpox-GM virusesl1991，CancerGenTher,MastrangeloMJetal:牛痘病毒TK中插入GM-CSF，选择性复制并激活EGFR/ras通路l2006，MolTher，KimJMetal&Jennerex公司:使用全球推广的牛痘病毒惠氏株疫苗构建JX-594毒株l20

10、11，Nature，BreitbachCJetal:JX-594临床试验：首次证明静脉注射后可持续且选择性抗肿瘤大规模随机临床试验大规模随机临床试验l黑色素瘤转移患者III期临床试验：HSV-1(编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF)l头颈部肿瘤复发患者III期临床试验：呼肠孤病毒与紫杉醇、卡铂联用l针对Sorafenib治疗无效的肝癌患者II期临床试验：JX-594vs支持疗法l2002实体癌I期临床试验：NDVPV701（14/62例430月未复发）l2006恶性神经性肉芽肿I/II期临床试验：NDV2HUJ(无严重不良反应，未恶化，1例三个月内完全缓解)l国外其他报导：NDV-HU

11、J、NDV-73T、MTH68、PV701等作为溶瘤病毒已经分别进入、期临床实验。l三期临床：安进（Amgen）T-Vec；CG0070（膀胱癌）；Reolysin（头颈癌）新城疫病毒新城疫病毒-Avian Paramyxovirus Type-1（Newcastlediseasevirus,NDVorAPMV-1）Group:V(-)ssRNA)Order:MononegaviralesFamily:ParamyxoviridaeGenus:AvulavirusSpecies:Avian paramyxovirus15-19kb，12serotype副流感腮腺炎麻疹仙台尼帕亨德拉副流感犬瘟A

12、PMV-1的系统发育和进化的系统发育和进化ClassIClassIIClassIIINovel禽副粘病毒属的基因组结构 6个结构蛋白个结构蛋白NP：核衣壳蛋白：核衣壳蛋白P：磷酸化蛋白：磷酸化蛋白M：基质蛋白：基质蛋白F：融合蛋白：融合蛋白HN：血凝素：血凝素-神经氨酸酶蛋白神经氨酸酶蛋白L：大聚合酶蛋白：大聚合酶蛋白SH：小分子疏水性蛋白：小分子疏水性蛋白IGS：非转录基因间隔区：非转录基因间隔区 非结构蛋白特别是移码突变产生的W，V蛋白质表达可特异抑制鸡细胞的干扰素信号系统（IFN/拮抗剂）副粘病毒中主要基因及功能副粘病毒中主要基因及功能 NP、P、L可形成三种复合物，NP-NP、NP-P

13、、NP-L、P-L，参与病毒颗粒组建基因基因功能NP形成螺旋状核衣壳，保护RNA；N端为RNA结合域，参与核衣壳组装，C端富含磷酸化位点和抗原决定簇位点，能影响NP与模板RNA的结合；能分别与P、L以及自身组装形成复合物，参与病毒的转录与复制P与NP形成复合物后导致NP蛋白质构象发生改变，从而暴露出模板RNA，激活病毒基因组的复制M具有高度疏水性，主要连接病毒囊膜骨架与核衣壳蛋白，共同构成病毒脂质囊膜的内表面支撑物F与病毒的致病性大小密切相关，能促进病毒囊膜与宿主细胞膜之间的融合，也能使宿主细胞膜之间发生融合HN能识别并吸附靶细胞表面的唾液酸受体，也能进一步分解唾液酸受体，从而增进病毒粒子的迁

14、移性，使病毒粒子更容易得到释放；能在病毒侵染细胞的过程中，协助F蛋白质充分接近靶细胞，从而使病毒囊膜与靶细胞膜接触进而产生融合L是RNA聚合酶的主要成分，同时也形成病毒复制与转录过程中所需要的大部分酶类，例如RNA多聚酶、Poly(A)多聚酶等Historyl人类感染NDV后，可能出现结膜炎、淋巴腺炎、轻微流感症状或无症，很快可康复。l1970，TheLancet,WebbHE&GordonCE:胃癌农场主感染NDV后胃癌痊愈l2002,2006:PV701,HUJ毒株临床试验l2009，IntJOncol，Wildenetal：细胞对NDV敏感性与抗病毒基因RIG-I,IRF3,IRF7,I

15、FN-负相关，而肿瘤细胞低表达以上因子。l2011：D90抑制人非小细胞肺癌A549细胞系l2012：D90荷瘤裸鼠-诱导顺铂抗性的A549凋亡（可与化疗联用）Mechanisml肿瘤细胞低表达抗病毒因子，正常细胞高表达选择性感染与复制lNDV在人癌细胞中的复制是正常细胞的10000倍以上，无神经嗜性，安全l强效诱导NK细胞，CD8+andCD4+效应细胞及TypeIIFN反应l促进效应细胞活化与远端肿瘤凋亡，可与immunomodulatoryantibodies等系统性疗法联用l灭活NDV可促进人外周血单核细胞分泌IFN-，提高TRAIL表达，启动caspase级联反应lNDV可通过分裂原

16、活化蛋白激酶信号传导途径诱导凋亡（p38参与）l致癌蛋白鸟苷三磷酸酶RacI表达帮助NDV复制及溶瘤，与肿瘤的锚定非依赖性生长有关lNDV感染后不依赖于p53激发的内源性线粒体途径，而是直接改变线粒体内膜通透性，释放细胞色素-c及其他膜间隙蛋白，激活下游caspase-9形成凋亡小体，进而激活caspase-3介导肿瘤凋亡。MechanismHN抗肿瘤的主要分子基础抗肿瘤的主要分子基础l肿瘤细胞高表达富含唾液酸（NDV受体）的粘蛋白Sialocmucin(膜蛋白的0.5%)lNDV感染后HN可大量切除唾液酸（负电），解除masking，暴露抗原，防止逃避淋巴细胞免疫监视与攻击，减少转移lHN有

17、血凝活性，还可在肿瘤表面表达并作为粘附分子，增强肿瘤细胞表面粘附性lHN可提高肿瘤细胞对淋巴细胞的共刺激作用，提高抗原递呈活性，诱导CTL（可提高淋巴细胞活性标记CD69,CD25,抗HN单抗可特异阻断此反应；共刺激分子可使T细胞表面受体活化阈值从8000点降低到1500点，提高对抗原刺激的敏感性，而HN与细胞表面受体结合再破坏的过程，类似于共刺激分子对受体的触发）lHN蛋白可通过上调效应细胞的凋亡配基，促进凋亡lNDV具有多组织亲和性的免疫刺激性，感染后在细胞膜表面引入病毒的HN和F蛋白（作为非特性组分，可增强肿瘤细胞抗原的免疫原性），进而诱导T细胞的共刺激活性以及细胞因子和局部趋化因子的产

18、生，增强特异性抗肿瘤作用lNDV修饰的自体瘤苗Mechanisml“旁观者机制”（bystandermechanism）间接杀死无法被病毒感染的癌细胞l血管萎陷（vascularcollapse）病毒感染肿瘤血管，将免疫细胞召集至血管部位，将其摧毁，最终阻断输向肿瘤的血流l抗病毒感染的旁观者机制病毒将免疫细胞迅速召集至肿瘤部位，在抗病毒的同时，也攻击癌细胞l溶瘤后免疫反应病毒在感染、杀伤癌细胞的过程中制造的细胞碎片，可诱导机体制造cytokine等免疫刺激小分子，并激活树突状细胞，通过检查机体异物（如肿瘤组分）的存在，向T细胞发出警报，启动其应答机制，使免疫系统意识到病人体内有肿瘤正在生长发展

19、方向发展方向l溶瘤疗法与传统疗法的协同l结合免疫调节、抗肿瘤免疫反应的转基因溶瘤疗法（IL-2,TNF,IFN,GM-CSF等；需确定NDV容纳外源基因数量及基因大小的有效负载）l加入肿瘤特异性启动子或受体，如人表皮生长因子受体HER-2lNDV与单抗联用lNDV修饰自体肿瘤疫苗（全病毒修饰瘤苗ATV-NDV）或体外裂解后回输（要求裂解彻底，防止人为种植肿瘤）lNDV与检查点阻断（Checkpointblockade）联用，如与抗CTLA-4抗体联用（免疫细胞上的CTLA-4能起免疫反应刹车作用），显著上调抗肿瘤反应，并能够增强adoptiveTcelltransfer（取患者的T细胞，训练它

20、们识别特定肿瘤，再导入患者体内）。l真核表达的HN作为生物制剂替代全病毒用于治疗（避免非有效成分的过敏原性；延长免疫应答，可与其他效应分子联用；均一，安全，稳定，避免感染与散毒，易于制备保存与运输）l多毒株联用NDV在肿瘤和疾病治疗中的概念性应用在肿瘤和疾病治疗中的概念性应用l直接的选择性溶瘤l肿瘤疫苗的佐剂l辅助抗癌素接种后刺激产生CTL和迟发型超敏反应(DTH应答)l作为非特异性免疫刺激源，诱导细胞因子（IFN等）生成l作为病毒载体，传递治疗基因l作为疫苗载体，用于免疫防御其他病原体l术中示踪：近红外或荧光量子点辅助切割和探测外科成像子课题方向子课题方向lNDV毒种库和NDV抗肿瘤谱的建立恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、消化道、肾、肺、前列腺、乳腺、宫颈、淋巴、肉瘤等等lNDV肿瘤示踪载体的构建l基因治疗型NDV载体的构建lHN蛋白的基因工程表达与应用2kb(13.5%genome),577aa，63KD，6个潜在糖基化位点l与其他效应分子联合免疫l动物与临床试验l机理性探讨