蛋白酶知识学习培训课件.ppt

1、蛋白酶 COOHR1CHNH +HOCCHR2 H O NH2 COOHR1CHNCCHR2 +H2O H O NH23.1.1、蛋白酶的作用蛋白酶的作用水解蛋白质或多肽中的酰胺键（肽键）。水解蛋白质或多肽中的酰胺键（肽键）。pH作用方式作用方式活性中心活性中心 来来 源源动物、植物、微生物动物、植物、微生物酸性、中性、碱性酸性、中性、碱性蛋白酶蛋白酶（内切）（内切）、肽酶、肽酶（外切）氨肽酶（外切）氨肽酶 羧肽酶羧肽酶丝氨酸、巯基丝氨酸、巯基羧基、金属离子羧基、金属离子3.1.2、分类和特性分类和特性EC 3.4.#.#3.2 蛋白酶的蛋白酶的分类分类 3.2.1 丝氨酸蛋白酶 3.2.2半

2、胱氨酸蛋白酶 3.2.3金属蛋白酶 3.2.4天冬氨酸蛋白酶 活性中心活性中心:丝氨酸(Ser)和组氨酸(His)包括-胰凝乳蛋白酶（chymosin）胰蛋白酶（trypsin）弹性蛋白酶（elastase）枯草芽孢杆菌蛋白酶（subtilisin）地衣芽孢杆菌蛋白酶（alcalase）必需基团必需基团：羟基、咪唑基、羧基 不可逆抑制剂：二异丙基氟磷酸（DFP）3.2.1丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-LysSer-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pr

3、o-Leu-Val-Cys-Lys-Lys-Asn*Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-GlyPro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn*Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro*部分氨基酸顺序(加*为活性中心丝氨酸)牛胰蛋白酶牛胰凝乳蛋白酶猪弹性蛋白酶牛凝血酶蛋白酶活性中心氨基酸组成相似性 酶原 酶原激活 酶原激活的意义-胰凝乳蛋白酶（EC 3.4.21.1）胰凝乳蛋白酶原的激活过程示意图由三个肽链组成，由双硫键将各部分结合在一起。胰凝乳蛋白酶原A由245个氨基酸残基

4、（分子量约为25,000），分子中有五个双硫键，它没有酶的活性；在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用下，裂解生成了三个双硫键-胰凝乳蛋白酶。CysAsp2451胰蛋白酶12451516CysAspIleArgCysLeu11316146149245AspIleAlaTyrThrArgSerAsn1481471514胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶原A胰凝乳蛋白酶A链B链C链催化机制 活性中心 57位组氨酸、102位天冬氨酸、195位丝氨酸性质 在近弱碱性条件下有较高的酶活性 专一性较差，甚至可以水解酯键 钙离子有激活作用 重金属离子、胰蛋白酶抑制物等有抑制作用（2）胰蛋白酶（EC 3

5、.4.21.4）消化系统中重要的蛋白质消化酶 在机体内不仅可以自激活，还要激活其它的蛋白酶。胰蛋白酶原的激活过程，可以看出酶的立体构象对于酶活性的影响。胰蛋白酶的激活过程示意图第1个问题酶原的激活具有什么生理意义？性质 具有较高的专一性 水解时的最适pH为79，较高pH下自我催化分解。钙离子有保护和激活作用 大豆中的胰蛋白酶抑制物、生花生凝集素、蛋类中的卵糖蛋白等有抑制作用3.2.2巯基蛋白酶 活性中心：半胱氨酸 木瓜蛋白酶（papain）、无花果蛋白酶（ficin）、菠萝蛋白酶（bromelain）和剑麻蛋白酶（agavain）等植物酶 链球菌蛋白酶（streptococcal protei

6、nase）等微生物酶 必需基团：巯基-SH 抑制剂：氧化剂或烷基化试剂或重金属离子激活剂，还原剂如半胱氨酸、谷胱甘肽等和金属螯合剂如EDTA等蛋白酶活性中心附近氨基酸残基的排列顺序Pro-Val-Lys-Asn-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys-TrpPro-Ile-Arg-Gln-Gln-Gly-Gln-Cys-Cly-Ser-Cys-TrpAsn-Gln-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala-Cys-Trp*部分氨基酸顺序（加*为活性中心半胱氨酸）蛋白酶木瓜蛋白酶无花果蛋白酶菠萝蛋白酶（1）木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2）分子量23900道尔顿，一级结构和立体结

7、构都清楚底物特异性较宽，作用于精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、瓜氨酸的羧基参与的肽键。在pH5下最稳定。底物不同，最适pH也会改变，酪蛋白最适pH为7，明胶则为5。最适温度65,在较高温度下仍然保持活性，例如在中性条件下70加热处理30min，对牛乳的凝结活性仅下降20%；商品化的木瓜蛋白酶中，木瓜蛋白酶一般只占可溶性蛋白质总量的10%，另外的蛋白酶还有木瓜凝乳酶、溶菌酶以及木瓜肽酶等。在肉品嫩化、啤酒加工中应用（2）无花果蛋白酶（无花果蛋白酶（EC 3.4.22.3）分子量约为26,000道尔顿 在pH3.59的范围内稳定，最适pH为68。最适pH不会随着底物的变化而发生明显的改变，例如对于酪蛋白它

8、的最适pH在6.7和9.5，对于明胶的液化为pH7.5。热稳定性稍差，在80下溶液中无花果蛋白酶将完全失活。重金属离子对其有抑制作用。商品酶制剂中含有多种蛋白酶，用途广泛（3）菠萝蛋白酶（EC 3.4.22.33）分子量约为33,000道尔顿，属于糖蛋白（含糖约2%）适宜pH为68 适宜的反应温度为3045 因底物的种类及浓度不同而有所改变其它植物蛋白酶 剑麻蛋白酶 中华猕猴桃蛋白酶3.2.3金属蛋白酶 活性中心：金属离子 必需基团：Zn2+、Mn2+、Fe2+二价金属离子 螯合剂（EDTA)螯合以后，抑制了它的活性。通过透析除去金属离子也可以失活。添加恢复活性 大多数金属蛋白酶是外切酶 嗜热

9、菌蛋白酶（EC 3.4.24.4）、橡胶原酶和出血蛋白酶是金属内切酶 羧肽酶 羧肽酶A和羧肽酶B等一些需要Zn2+，脯氨酰氨基酸酶、亚氨基二肽酶等需要Mn2+。金属离子置换化学修饰 分子修饰 氨肽酶3.2.4天冬氨酸蛋白酶 活性中心：Asp 必需基团:羧基 也被称为羧基酸性蛋白酶 最适pH范围是24 胃蛋白酶（pepsin）、凝乳蛋白酶（chymosin）微小毛霉、毛霉、利疫菌的蛋白酶等。（1）胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）由胃粘膜细胞分泌出胃蛋白酶原，经过激活而得到的。不同动物源的胃蛋白酶的氨基酸组成有一点差异，所有脊椎动物的胃液中均有胃蛋白酶。胃蛋白酶原向胃蛋白酶的转化。字母P标示肽键

10、水解释放出几个肽片断（A）、胃蛋白酶抑制物（B）和胃蛋白酶（C）性质 在pH为25的范围内稳定 在以蛋白质为底物时，最适pH为2，超过此范围时胃蛋白酶容易失活，例如，在pH6.2时或者70以上酶就开始失活 最适温度3740。在温度超过80时酶不可逆的失活。（2）凝乳酶（EC 3.4.23.4）是雏牛皱胃中蛋白酶的主要形式，以酶原的形式分泌出。凝乳酶在从无活性的酶原转化为有活性的酶的过程中，发生部分水解。活性中心：两个天冬氨酸 在pH5.56.5的范围内稳定，在pH低于2时还相当稳定，在pH3.54.5的范围内由于酶的自催化作用而很快被分解，在中性或碱性pH范围内，凝乳酶也很快失去活性。基因工程

11、技术（克隆技术，克隆酶）：将小牛的凝乳酶基因克隆到微生物表达系统，通过发酵的方法得到具有凝乳能力的重组凝乳酶，以此来满足干酪生产需要。蛋白质工程技术（定点突变，突变酶）：凝乳酶分子中的Tyr-77或Val-113用Phe替代后，其凝乳能力相对于原来的酶明显增强。第2个问题以蛋白酶为例如何考虑酶制剂的来源如何考虑建立体外消化道模拟系统3.3蛋白酶在食品工业中的应用蛋白酶在食品工业中的应用3.3.1、蛋白质水解物的生产、蛋白质水解物的生产3.3.2、氨基酸的生产、氨基酸的生产3.3.3、明胶的生产、明胶的生产3.3.4、干酪的生产、干酪的生产3.3.5、肉的嫩化、肉的嫩化3.3.6、在啤酒中的应用

12、、在啤酒中的应用3.3.7、在茶饮料中的应用、在茶饮料中的应用3.3.8、酶法生产脱腥速溶豆乳、酶法生产脱腥速溶豆乳蛋白质蛋白质蛋白胨、多肽、氨基酸蛋白胨、多肽、氨基酸蛋白酶蛋白酶水解水解原料：原料：动物蛋白动物蛋白 植物蛋白植物蛋白 微生物蛋白微生物蛋白3.3.1、蛋白质水解物的生产蛋白质水解物的生产肽类吸收的意义肽类吸收的意义1.促进氨基酸的吸收促进氨基酸的吸收2.直接进行蛋白质合成直接进行蛋白质合成3.有利于矿物质元素的吸收和利用有利于矿物质元素的吸收和利用4.提高机体免疫力提高机体免疫力5.其他的生理意义其他的生理意义营养营养调节调节功能肽、调节肽、生物活性肽、营养性多肽功能肽、调节肽

13、、生物活性肽、营养性多肽多肽的来源多肽的来源来自植物体的多肽大豆水解多肽、苦瓜多肽、南瓜多肽等来自动物体的多肽柞蚕抗菌肽、蛇毒肽、海洋动物等来自微生物的多肽肽类抗生素：那西肽多肽的作用多肽的作用降血压肽、降血糖肽、睡眠肽、镇痛肽、调节生理活性肽、抗肿瘤肽、抗菌肽多肽的开发多肽的开发酶法制备多肽流程：原料蛋白 预处理 酶解 分离 精制 成品微生物发酵法制备多肽动植物蛋白原料 菌种 发酵工艺1 1大豆多肽大豆多肽 2 2白蛋白多肽白蛋白多肽 3 3玉米多肽玉米多肽 4 4 大米多肽大米多肽5 5 绿豆多肽绿豆多肽6 6花生肽花生肽7 7 豌豆肽豌豆肽8 8菜籽肽菜籽肽9 9苦瓜肽苦瓜肽10 10

14、南瓜肽南瓜肽11 11核桃肽核桃肽12 12 棕榈肽棕榈肽1313灵芝肽灵芝肽14 14 虫草肽虫草肽15 15 丝肽丝肽酪蛋白磷肽（cpp）含有成簇的磷酸丝氨酸基的肽 以牛乳酪蛋白为原料 经单一酶或复合酶系水解,通常采用胰蛋白酶 与钙、铁离子有亲和性，在无需增加维生素D的条件下，促进了佝偻病患儿骨骼的发育。鸡粉、鸡精调味品的生产牛肉水解物调味品的生产酱油的发酵生产鱼露的发酵生产谷朊粉水解肽废弃啤酒酵母水解生产酵母粉如何利用蛋白酶开发功能多肽？第第3个问题个问题 3.3.23.3.2蛋白酶在氨基酸的生产的应用蛋白酶在氨基酸的生产的应用 必需氨基酸 共有8种：赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏

15、氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。半必需氨基酸：精氨酸、组氨酸 非必需氨基酸 必需氨基酸摄入不足会导致大脑和内脏器官受损，血液系统、免疫系统功能下降。WHO把氨基酸列为人体必需的营养素之一。主要生理功能氨基酸的生产氨基酸的生产工艺流程工艺流程：蛋白质蛋白质原料预处理原料预处理蛋白酶蛋白酶水解水解氨基酸混合液氨基酸混合液分离纯化分离纯化氨基酸氨基酸氨基酸混合液氨基酸混合液浓缩浓缩 结晶结晶 干燥干燥产品用途：产品用途：食品、饲用、医药食品、饲用、医药年消费量约年消费量约140万万T，谷氨酸和赖氨酸占总量的，谷氨酸和赖氨酸占总量的95%。其余的为小品种氨基酸及药用氨基酸。其余的为小品种氨基酸及药用氨

16、基酸。明胶的明胶的制备制备原料：原料：动物的皮或骨动物的皮或骨原理：原理：天然胶原蛋白是三股螺旋结构，不溶于水，天然胶原蛋白是三股螺旋结构，不溶于水，经处理，形成单链，溶于热水，成为热可溶性凝经处理，形成单链，溶于热水，成为热可溶性凝胶，冷却得明胶溶液。胶，冷却得明胶溶液。碱性蛋白酶碱性蛋白酶采用酶法，条件、时间从几周降为不到一天。采用酶法，条件、时间从几周降为不到一天。胶原蛋白胶原蛋白酸酸 碱水解碱水解明胶明胶胶原多肽胶原多肽3.3.3 蛋白酶在明胶生产的应用蛋白酶胶原多肽的功能及应用胶原多肽的功能及应用 营养价值高 保护胃粘膜 抑制血压的上升 促进成骨作用 防治关节病 食品工业的应用3.3

17、.4、蛋白酶在干酪生产的应用原料乳原料乳酶法凝固（凝乳酶）酶法凝固（凝乳酶）除去乳清除去乳清产品产品乳酸菌发酵乳酸菌发酵 干酪是在牛乳凝固后，干酪是在牛乳凝固后，排除乳清，排除乳清，将凝块压成块状而制成将凝块压成块状而制成的产品。制成后未经发酵的称为新鲜干酪，的产品。制成后未经发酵的称为新鲜干酪，经长时间发酵成经长时间发酵成熟而制成的产品称为成熟干酪。熟而制成的产品称为成熟干酪。干酪中的蛋白质经过发酵后，干酪中的蛋白质经过发酵后，由于凝乳酶及微生物中蛋白由于凝乳酶及微生物中蛋白酶的分解作用，酶的分解作用，形成氨基酸、肽、胨等，因此很容易消化吸形成氨基酸、肽、胨等，因此很容易消化吸收。收。凝乳蛋

18、白酶生产干酪的基本原理：凝乳蛋白酶生产干酪的基本原理：-酪蛋白酪蛋白酶酶副副-酪蛋白酪蛋白+糖肽糖肽Ca2+形成凝胶凝固形成凝胶凝固 对对Ca2+不稳定的不稳定的-和和 -酪蛋白，失去酪蛋白，失去 -酪蛋白的保酪蛋白的保护也析出，形成凝胶。护也析出，形成凝胶。除了几种类型的鲜干酪，除了几种类型的鲜干酪，如农家干酪、夸克干酪，如农家干酪、夸克干酪，主要是通过乳酸来凝固，主要是通过乳酸来凝固，而其他所有干酪的生产全是而其他所有干酪的生产全是依靠凝乳依靠凝乳蛋白蛋白酶的反应而形成凝块。酶的反应而形成凝块。肉类嫩化原理肉类嫩化原理老龄动物中的胶原蛋白因交联作用呈交链状、老龄动物中的胶原蛋白因交联作用呈

19、交链状、网状，肉粗糙、坚韧，故需进行嫩化处理。网状，肉粗糙、坚韧，故需进行嫩化处理。3.3.5蛋白酶在肉类嫩化生产的应用 不同蛋白酶对牛肉嫩化的能力：按每克牛肉嫩化所需酶单位为：番木瓜蛋白酶2.5、菠萝蛋白酶5.0、无花果蛋白酶5.0、枯草杆菌蛋白酶75.0、米曲霉蛋白酶100.0、黑曲霉蛋白酶200.0、根酶蛋白酶250.0。番木瓜蛋白酶在肉嫩化上效果较好 广州华琪生物制品有限公司的嫩肉粉主要成分为番木瓜蛋白酶。能使肉类松嫩可口易消化吸收，可节省60 烹饪时间和燃料。其用法为：与肉片拌匀后，10min 即可烹饪。每500g 肉用本品（小匙）：鸡鸭鹅猪肉24g，牛羊狗肉猪肚鱿鱼35g。净重：2

20、5g 瓶。保存期：一年。蛋白酶嫩化肉类的方法，主要有两种：3.1 酶粉嫩肉法 通常将粉末状番木瓜蛋白酶匀称地撒在肉块上，或者将肉块浸泡在液态番木瓜蛋白酶中，一般经10分钟，即可烹煮。3.2 宰前注射法 在牲畜屠宰前510 分钟注射番木瓜蛋白酶，通过血管分布全身，在其宰后产生嫩化作用。3.3.6、在啤酒中的应用、在啤酒中的应用 添加蛋白酶制剂如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶，可分解引起混浊的蛋白质，使其不易与多酚物质缩合，从而提高啤酒的稳定性。解决冷浑浊 据报导，在啤酒旺季酒龄较短的情况下，采用在啤酒过滤后加木瓜蛋白酶，能够使啤酒稳定时间达到个月以上，而对啤酒的其他质量指标几乎没有不利影响。3.3.7

21、蛋白酶在茶饮料中的应用研究蛋白酶在茶饮料中的应用研究茶叶中蛋白质约占干物重的20%30%,其中有很少一部分可溶于茶汤。这部分可溶性蛋白质可与多酚类、咖啡碱通过不同方式产生沉淀，参与茶乳酪(冷后浑)的形成。在茶汤中添加蛋白酶来水解这部分水溶性蛋白质，减少了蛋白质与多酚类形成复合物浑浊的机会，还增加茶汤中氨基酸含量，从而增加茶饮料的鲜爽滋味。3.3.8、酶法生产脱腥速溶豆乳粉、酶法生产脱腥速溶豆乳粉 正已醛、正已醇与蛋白质结合，当蛋白质水解正已醛、正已醇与蛋白质结合，当蛋白质水解为低分子量的肽，正已醛、正已醇几乎完全释为低分子量的肽，正已醛、正已醇几乎完全释放出来，通过酶水解所得豆类蛋白是无腥味的

22、。放出来，通过酶水解所得豆类蛋白是无腥味的。豆腥味产生的原因豆腥味产生的原因 大豆中的油脂在脂肪氧化酶作用下氧化产大豆中的油脂在脂肪氧化酶作用下氧化产生呈味物质，与大豆中的蛋白质有亲和性，生呈味物质，与大豆中的蛋白质有亲和性，一般条件下不易除去。一般条件下不易除去。物理化学：物理化学：加热，酸碱处理加热，酸碱处理分离蛋白方法：分离蛋白方法：真空脱臭真空脱臭添加糖、酸等风味剂掩盖法和酶法添加糖、酸等风味剂掩盖法和酶法酶法脱腥酶法脱腥豆豆 乳乳酶量酶量0.5%原料原料温度温度50，2h脱腥豆乳脱腥豆乳去除豆腥味方法去除豆腥味方法蛋白酶的活性测定蛋白酶的活性测定酪蛋白酪蛋白血红蛋白血红蛋白硝基苯酯硝基苯酯