发酵过程及控制课件.ppt

1、 发酵过程及控制 第五章第五章发酵过程及控制第一节 发酵方式 第二节 发酵动力学 第三节 发酵过程主要影响因素及控制 第四节 发酵过程检测和自控 第五节 发酵终点的判断 第一节 发酵方式 一、概述一、概述 发酵原本是指在厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢过程。现在从广义上将发酵看作是微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经过特定的代谢转变成所需产物的过程。微生物具有合成某种产物的潜力，但要想在生物反应器中顺利实现以最大限度地合成所需产物却并不容易。发酵是一种很复杂的生化过程，其好坏涉及诸多因素。最基本的是取决于生产菌种的性能，但有了优良的菌种之后，还需要有最佳的环境条件即发

2、酵工艺加以配合，才能使其生产能力充分表现出来。第一节 发酵方式 二、分批发酵二、分批发酵 1.1.分批发酵的理论基础分批发酵的理论基础 分批发酵是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。该方法在发酵开始时，将微生物菌种接入已经灭菌的培养基中，在微生物最适宜的培养条件下进行培养，在整个培养过程中，除氧气的供给、发酵尾气的排出、消泡剂的添加和控制pH需加入的酸或碱外，整个培养系统与外界没有其他物质的交换。分批培养将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一段时间

3、反应后，将整个反应系取出。分批培养的特点是操作简单，易于掌握，因而是最常见的操作方式。9.1多多Agent系统简述系统简述第九章 多Agent系统of 315弱定义：Agent一般用以说明一个软硬件系统。它具有自治性，社会性，反映性，能动性等特性。9.1.1概念概念1.Agent强定义：Agent不仅具有以上的特性，而且具有知识、信念、义务、意图等人类才具有的特性。强定义更加强调人格化概念的Agent的心智要素。一般而言，可以认为Agent是一个能够感知外界环境并具有自主行为能力的以实现其设计目标的自治系统。它运行于复杂和不断变化的动态环境中，能有效地利用环境中各种可以利用的数据、知识、信息和

4、计算资源，准确理解用户的真实意图，为用户提供迅捷、准确和满意的服务。9.1多多Agent系统简述系统简述第九章 多Agent系统of 316关于MAS，百度百科给出的定义是由多个Agent组成的集合，其多个Agent成员之间相互协调，相互服务，共同完成一个任务。它的目标是将大而复杂的系统建设成小的、彼此互相通信和协调的，易于管理的系统。2.多Agent系统（MAS）MAS作为解决复杂系统的一个有效方法，能够利用并行分布式处理技术和模块化设计思想，把复杂系统划分成相对独立的Agent子系统，通过Agent之间的共同协作来完成对复杂问题的求解。在一个MAS中，各Agent成员之间是独立自主的，其自

5、身的目标和行为不受其它Agent成员的限制，可以采用不同的设计方法和计算机语言开发而成，没有全局数据，也没有全局控制，是一种开放的系统，Agent加入和离开都是自由的。9.1多多Agent系统简述系统简述第九章 多Agent系统of 317MAS的体系结构是指MAS中Agent间的信息关系和控制关系，以及问题求解能力的分布模式，通过定义Agent之间的权威关系，为Agent提供了一种交互框架。9.1.2 MAS的结构的结构MAS的体系结构可以有三种形式：集中式、分布式和混合式。（1）集中式结构（2）分布式结构（3）混合式结构9.1多多Agent系统简述系统简述第九章 多Agent系统of 31

6、8MAS用于解决实际问题，其特性因为应用的不同领域而有所不同，主要有以下一些特点：9.1.3特点及分类特点及分类1.特点（1）由于Agent可以是不同的个人或组织采用不同的设计方法和计算机语言开发而成，因而可能是完全异质和分布的；（2）在MAS中，每个Agent是自治的，各自按照自己的方式异步地运行自己的进程，解决给定的子问题，自主地推理和规划并选择适当的策略，并以特定的方式影响环境；（3）MAS支持分布式应用，具有良好的模块性、易于扩展、设计灵活简单。在其实现过程中，不追求单个庞大复杂的体系，而是按面向对象的方法构造多层次，多元化的Agent以降低各个Agent问题求解的复杂性从而降低整个系

7、统的复杂性；（4）MAS是一个集成系统，各Agen之间互相通信彼此协调，并行地求解问题，能有效地提高问题求解的能力；（5）多Agent技术打破了人工智能领域仅仅使用一个专家系统的限制，在MAS环境，各领域的不同专家可能协作求解某一个专家无法解决或无法很好解决的问题，提高系统解决问题的能力。9.1多多Agent系统简述系统简述第九章 多Agent系统of 3199.1.3特点及分类特点及分类2.分类（1）根据Agent的自主性分类1）由控制Agent和被控Agent构成的系统：Agent之间存在较强的控制关系，每个Agent或对其他Agent具有控制作用，或受控于对它具有权威的Agent。在这类

8、系统中，被控Agent的行为受到约束，自主程度较低。2）自主Agent构成的系统：Agent自主地决策，产生计划，采取行动。Agent之间具有松散的社会性联系。Agent通过与外界的交互，了解外部世界的变化，并从经验中学习增强其求解问题的能力以及与相识者建立良好的协作关系。在这类系统中，自主Agent之间的协作关系是互惠互利的关系，当目标发生冲突时，通过协商来解决。3）灵活Agent（即半自主的Agent）构成的系统：Agent进行决策时，某些问题在一定程度上需要受控于其他Agent，大部分情况下要求Agent完全自主地工作。在这类系统中，Agent之间通常是松散耦合，具有一定的组织结构，通过

9、承诺和组织约束相互联系。9.1多多Agent系统简述系统简述第九章 多Agent系统of 31109.1.3特点及分类特点及分类2.分类（2）根据对动态性的适应方法分类 1）系统拓扑结构不变，即Agent数目、Agent之间的社会关系等都不变。Agent内部结构固定，基本技能不变，通过重构求解问题的方式来适应环境；Agent通过自重组来适应环境，例如修改调整自己的知识结构、目标、选择等。2）系统拓扑结构改变Agent数目不变，每个Agent的微结构稳定，可以修改Agent间的关系和组织形式；可增减Agent数目，可以动态创建和删除Agent。9.1多多Agent系统简述系统简述第九章 多Age

10、nt系统of 31119.1.3特点及分类特点及分类2.分类（3）根据系统功能结构分类 1）同构型系统，即每个Agent功能结构相同；2）异构型系统，Agent的结构、功能、目标都可以不同，由通信协议保证Agent间协调与合作的实现。（4）根据Agent关于世界知识的存储分类 1）反应式多Agent系统；2）黑板模式的多Agent系统；3）分布存储的多Agent系统。（5）根据控制结构分类 1）集中控制：由一个中心Agent负责整个系统的控制、协调工作；2）层次控制：每个Agent控制处于其下层的Agent的行为，同时又受控于其上层的其他Agent；3）网络控制：由信息传递构成的控制结构，且该

11、控制结构是可以动态改变的，可以实现灵活控制。第一节 发酵方式 分批培养过程中随着培养基中营养物质的不断减少，微生物生长的环境条件也随之不断变化，不能使细胞自始至终处于最优条件下。因此，微生物分批培养是一种非稳态的培养方法。但是在培养基接种后只要维持一定温度，对于好气培养过程则还需进行通气搅拌，在培养过程中，培养液中的细胞浓度、基质浓度和产物浓度不断变化，但有一定规律。分批发酵是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内。第一节 发酵方式 在此简单系统内所有液体的流量等于零，故由物料平衡，得式(5-1)式（5-3）的微分方程 dX/dtX （5-1）dS/dt=

12、-qsX （5-2）dP/dtqPX （5-3）式中 X菌体浓度，g/L;t培养时间，h;比生长速率，h-1；S基质浓度，g/L;qs比基质消耗速率，g（gh）；P产物浓度，g/L;qP比产物形成速率，g（gh）。第一节 发酵方式 以上由细胞生长、基质消耗和产物生长的微分方程构成的微分方程组，反映了分批发酵中细胞、基质和产物浓度的变化情况。对各种不同的微生物分批发酵过程，通过实验研究这三个参数的变化规律，建立适当的微分方程组，就可以对分批发酵进行模拟，进而进行优化控制，最终达到提高生产效率的目的。分批发酵过程一般可粗分为四期：即适应期（也有称停滞期或延滞期的）、对数（指数）生长期、生长稳定期和

13、死亡期；也可细分为六期：即停滞期、加速期、对数期、减速期、静止期和死亡（衰亡）期，如图5-1所示。第一节 发酵方式 图5-1 分批培养中的微生物的典型生长曲线 第一节 发酵方式 （1）在停滞期（）即刚接种后的一段时间内，细胞不生长，细胞数目和菌量基本不变，这是由于菌对新的生长环境有一适应过程，其长短主要取决于种子的活性、接种量和培养基的可利用性以及浓度。菌龄短的菌种停滞期也短，在对数生长期接种停滞期最短，种子老化会使停滞期延长。带培养液接种比种子经分离培养液后接种的延滞期要短，但带培养液的种子易老化，不易保藏。对于经分离后的浓缩种子，若在接种时添加适量的培养滤液，则可缩短延滞期。此外，对有些微

14、生物培养在接种时添加某种激活剂可大大缩短延滞期。菌龄相同的菌种，则接种量越大，停滞期越短，而培养基的浓度对停滞期的长短影响不大。第一节 发酵方式 停滞期的长短，差别很大，短的几乎觉察不到，瞬间即可完成，而长的要在接种后23天才开始生长。种子一般应采用对数生长期且达到一定浓度的培养物，该种子能耐受含高渗化合物和低CO2分压的培养基。工业生产中从发酵产率和发酵指数以及避免染菌考虑，希望尽量缩短适应期。（2）加速期（）加速期（）通常很短，大多数细胞在此期的比生长速率在短时间内从最小升到最大值。如这时菌已完全适应其环境，养分过量又无抑制剂便进入恒定的对数或指数生长期()。第一节 发酵方式 （3）指数生

15、长期()在这一阶段，由于培养基营养物质丰富，有毒代谢物少，细胞生长不受限制，所以细胞浓度随培养时间呈指数增长，可用方程(5-1)表示，将其积分，再取自然对数得式 lnXt1nXot (5-4)式中 X。菌的初始浓度；Xt经过培养时间t的菌体浓度。将菌体浓度的自然对数与时间（lnXt t）作图可得一直线，其斜率为，即比生长速率。比生长速率与微生物种类、培养温度、pH、培养基成份及限制基质浓度等因素有关。在对数生长期，细胞的生长不受限制，因此，在对数生长期的比生长速率达最大，可用max表示。第一节 发酵方式 一些微生物如产黄青霉、构巢曲霉、甲烷加单孢霉、贝内克氏菌的典型max值分别为（0.12、0

16、.36、0.53、4.24）h-1。对数生长期的长短主要取决于培养基，包括溶氧的可利用性和有害代谢产物的积累。（4）减速期（）在指数生长期，随着细胞的大量繁殖，培养基中养分的迅速减少，有害代谢物的逐渐积累，细胞的比生长速率逐渐下降，即进入减速期（）。细胞的生长不可能再无限制地继续，这时比生长速率成为养分、代谢产物和时间的函数，常用Monod方程表示。当限制性基质浓度很低时，增加该基质浓度能显著提高细胞的比生长速率，否则就不明显。第一节 发酵方式 （5）静止期（V）静止期（V），因营养物质耗尽，有害物质大量积累，细胞的浓度达到最大值，不再增加。实际上是一种生长和死亡的动态平衡，净生长速率等于零，

17、即，式中为比死亡速率。由于此期菌体的次级代谢十分活跃，许多次级代谢物在此期大量合成，菌的形态也发生较大的变化，如菌已分化、染色变浅、形成空胞等。当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进入死亡期（VI）。（6）死亡期（VI）在死亡期（VI），细胞开始死亡，活细胞的浓度不断下降，这时，生长呈负增长。工业发酵一般不会等到菌体开始自溶时才结束培养。发酵周期的长短不仅取决于前面五期的长短还取决于菌的初始浓度X0。第一节 发酵方式 2.2.重要的生长参数重要的生长参数 分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响如图5-2所示:图5-2 分批培养中基质初始浓度对菌生长的影响第一节 发酵方式 （1）得率

18、系数Y 在浓度较低的（A-B）范围内，静止期的细胞浓度与初始基质浓度成正比，可用式(5-5)表示 XY（So一St）(5-5)式中 so初始基质浓度，g/L;st经培养时间t时基质浓度；Y得率系数，g细胞/g基质在A-B的区域，当生长停止时，st等于零。方程(5-5)可用于预测用多少初始基质便能得到相应的菌量。（2）比生长速率 在C-D的区域，菌量不随初始基质浓度的增加而增加。这时菌体的进一步生长受到积累的有害代谢物的限制。用Monod方程可描述比生长速率和残留的限制性基质浓度之间的关系 max s（KsS）(5-6)第一节 发酵方式式中 比生长速率，h-1；max最大比生长速率，h-1；S基

19、质浓度，g/L;Ks基质利用常数，相当于max/2时的基质浓度，g/L，是菌对基质的亲和力的一种度量。分批培养中后期基质浓度下降，代谢有害物积累，已成为生长限制因素，产值下降。其快慢取决于菌体对限制性基质的亲和力大小，Ks小，对的影响较小，当St接近0时，急速下降；Ks大，随St的减小而缓慢下跌，当st接近0时，才迅速下降到零，见图5-3。第一节 发酵方式 图5-3 分批发酵过程中的若干重要参数的变化 第一节 发酵方式 3.3.分批发酵的优缺点分批发酵的优缺点 分批发酵在工业生产上占有重要地位。分批培养的优点是：周期短，培养基一次灭菌，一次投料，容易实现无菌状态；操作简单，易于操作控制，产品质

20、量稳定；培养浓度较高，易于产品分离。但是分批培养的辅助时间较多，设备生产能力低。在目前国内外绝大多数发酵生产中，都是采用分批培养的方法。第一节 发酵方式 若细胞本身为产物，可采用能支持最高生长量的培养条件；以初级代谢物为产物的，可设法延长与产物关联的对数生长期；对次级代谢物的生产，可缩短对数生长期，延长生产（静止）期，或降低对数期的生长速率，从而使次级代谢物更早形成。但分批发酵不适用于测定其过程动力学，因使用复合培养基，不能简单地运用Monod方程来描述生长，存在基质抑制问题，出现二次生长现象。对基质浓度敏感的产物，或次级代谢物，如对基质浓度敏感的产物，或次级代谢物，比如抗生素，用分批发酵不合

21、适，因其周期较短，一般在12天，产率较低。这主要是由于养分的耗竭，无法维持下去。据此，发展了补料-分批发酵。第一节 发酵方式 三、补料（流加）分批发酵三、补料（流加）分批发酵 1.1.补料补料-分批发酵理论基础分批发酵理论基础 补料-分批发酵是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，向反应器中不断补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，克服由于养分不足，导致发酵过早结束，到反应终止时取出整个反应系。流加培养是介于分批培养过程与连续培养过程之间的一种过渡培养方法。第一节 发酵方式 一般出现在下列两种情况中：一种

22、情况是培养过程中的主要底物是气体；另一种情况是存在底物抑制。若底物是气体，如甲烷发酵，则不可能将底物一次加入，只能在培养过程中，连续不断地通入。对于存在底物抑制的培养系统，采用连续流加培养基的方法，可使发酵液中一直保持较低的底物浓度，从而解除底物抑制。目前国内外的酵母生产行业大多采用这种操作方法。第一节 发酵方式 目前补料-分批培养已在发酵工业上普遍用于氨基酸、抗生素、维生素、酶制剂、单细胞蛋白、有机酸以及有机溶剂等的生产过程。目前补料-分批发酵的类型很多，就补料的方式而言，有连续补料、不连续补料和多周期补料；每次补料又可分为快速补料、恒速补料、指数速度补料和变速补料；按反应器中发酵液体积区分

23、，又有变体积和恒体积之分；从反应器数目分类又有单级和多级之分；从补加的培养基成分来分，又可分为单一组分补料和多组分补料。第一节 发酵方式 流加培养的特点就是能够调节培养环境中营养物质的浓度。一方面，它可以避免某些营养成分的初始浓度过高而出现底物抑制现象；另一方面，能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成，这是流加培养与分批培养的明显不同。由于新鲜培养液的加入，整个过程中反应体积是变化的，这是它的一个重要特征。根据不同情况，存在不同的流加方式。从控制角度可分为无反馈抑制流加和有反馈抑制流加两种。无反馈抑制流加包括定量流加和间断流加等。有反馈抑制流加，一般是连续或间断

24、地测定系统中限制性营养物质的浓度，并以此为控制指标，来调节流加速率或流加液中营养物质的浓度等。第一节 发酵方式 若只有料液的输入，没有输出，发酵液的体积在增加。若分批培养中的细胞生长受一种基质浓度的限制，则在任一时间的菌浓可用下式表示：XtX0Y（S0-St）(5-7)式中 X0，菌的初始浓度，g/L;Xtt时菌的浓度，g/L;S0初始基质浓度，g/L;Stt时基质浓度，g/L;若st0，则其最终菌浓为Xmax，只要X0Xmax Xmax YS0 (5-8)第一节 发酵方式 如果当XtXmax时开始补料，其稀释速率Dmax，实际上当基质一进入培养液中很快便被耗竭，故可得输入的基质等于细胞消耗的

25、基质。虽培养液中的总菌量XT随时间的延长而增加，但细胞浓度Xt并未提高，因此D。这种情况称为准稳态。随时间的延长，D将随体积的增加而减少，D可用下式表达 DF/（V0Ft）（5-9）式中 V0发酵液原来的体积L；D稀释速率L-1；t补料时间h；F补料流速L/h；Vt时发酵液体积L，V=V0Ft.第一节 发酵方式 因此，按Monod方程，残留的基质应随D的减小而减小，导致细胞浓度的增加。但在的分批-补料操作中S0Ks因此，在所有实际操作中残留基质浓度的变化非常小，可当作是零。故只要D max;Ks S0便可达到准稳态，恒化器的稳态和补料-分批发酵的准稳态的主要区别在于恒化器的是不变的，而补料-分

26、批发酵的是降低的。补料-分批发酵的优点在于它能在这样一种系统中维持很低的基质浓度，从而避免快速利用碳源的阻遏效应和能够按设备的通气能力去维持适当的发酵条件，并且能减缓代谢有害物的不利影响。第一节 发酵方式 2 2分批分批-补料的优化补料的优化 为了获得最大的产率，需采取优化补料的策略。可以从实际分批-补料培养中改变补料的速率，如边界控制实现。在分批培养的前期应维持在其最大值，max；下一阶段应保持在临界c上。这种控制策略可理解为细胞生长和产物合成的两阶段生产步骤。Shioya（1992）将生物反应器的优化分为三个步骤，如图5-4所示，即过程的建模、最佳解法的计算和解法实现。为此，需考虑模型与真

27、实过程之间的差异和优化计算的难易。在建模阶段出现的问题之一是怎样定量描述包括在质量平衡方程中的反应速率。第一节 发酵方式 图5-4 生物反应器优化的三个步骤 第一节 发酵方式 Shioya等对分批培养进行优化和控制的方法如图5-5所示，用一模型鉴别和描述比生长速率与比生产速率之间的关系，藉最大原理获得比生长速率的最佳策略和这一策略的实现。图5-5 分批培养中实现最佳生产的方法 第一节 发酵方式 在建模阶段拟解决的问题之一是定量描述物料平衡中的以基质、产物等浓度表示的各反应速率。分批培养中的最大的目标是在一定的运转时间tf下使产量最大化。比生产速率，在此被看做是决定性变量，其变化取决于基质补料速

28、率的变化，是过程的重要参数之一，表征生物反应器的动态特性。为了获得最大的细胞产量，应在培养期间使产值最大。为此，应使培养基中的糖浓度保持在一最适范围。如没有现成的在线葡萄糖监控仪，可控制发酵过程中CO2呼吸商RQ值和乙醇浓度。但应强调指出，RQ和乙醇浓度的控制只能用于使比生长速率最大化。为了维持分批培养中产值不变，常用一指数递增的补料策略。这可使生长速率维持恒定，直到得率系数Y减小。故可用补料办法控制比生长速率。但如果计算补料速率所需的初始条件和参数不对，则比生长速率便根本不等于所需数值。第一节 发酵方式 酵母的生产与代谢不仅取决于是否有足够的氧，而且与糖的含量有关。当糖含量很低时(0.028

29、%)，在有氧条件下，酵母不产生乙醇，其生长得率可达50%；当糖含量较高时，酵母菌在生长的同时，产生部分乙醇，酵母得率低于50%；而当培养液中的糖含量达5%时，即使在有足够氧的条件下，酵母菌的生长也会受到抑制，且产生大量乙醇，酵母得率很低。因此，为了获取较高的生长速率和较高的酵母得率，必须使培养液中糖的含量保持在较低的水平。显然，采用一次投料的方法是不行的，这样在发酵的初始阶段将会产生大量酒精，影响酵母的生长和收率。采用流加的方法可获得满意的结果，在整个发酵过程中，培养液中的糖含量都保持在较低的水平（一般为0.1%0.5%），酵母利用多少就流加多少，流加速率等于酵母的耗糖速率。这样酵母处在较低糖

30、含量的培养条件下，以较快的速度生长，其酵母的收得率也能取得令人满意的结果，所以酵母培养采用流加培养。第一节 发酵方式 酿酒酵母的培养温度会影响其比生长速率和酸性磷酸酯酶的比生产速率。当温度低一些，27有利于值；温度高一些，32.5有利于酸性磷酸酯酶的比生产速率的提高。最终产物浓度与改变温度的时间（max到c）6h是最适合的。四、半连续发酵四、半连续发酵 半连续培养又称为反复分批培养或换液培养，在补料-分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液（行业中称为带放）便可称为半连续发酵。带放是指放掉的发酵液和其他正常放罐的发酵液一起送去提炼工段。这是反应器内培养液的总体积保持不变的操作方式。第一节 发酵方

31、式 这种操作方式可以反复收获培养液，对于培养基因工程动物细胞分泌有用产物或病毒增殖过程比较适用。例如，采用微载体系统培养基因工程iCHO细胞，待细胞长满微载体后，可反复收获细胞分泌的乙肝表面抗原（HBsAg）制备乙肝疫苗。考虑到补料-分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足，但由于有害代谢物的不断积累，产物合成最终难免受到阻遏。放掉部分发酵液，再补入适当料液不仅补充养分和前体而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。但半连续发酵也有它的不足：放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生产旺盛期的菌体；定期补充和带放使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体积更大；发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有

32、害物，最终限制发酵产物的合成；一些经代谢产生的前体可能丢失；有利于非产生菌突变株的生长。据此，在采用此工艺时必须考虑上述的技术上限制，不同的品种应根据具体情况具体分析。第一节 发酵方式 五、连续发酵五、连续发酵 连续培养或连续发酵是发酵过程中一边补入新鲜的料液，一边以相近的流速放料，维持发酵液原来的体积。使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物发酵培养方式。可以采用罐式或搅拌发酵罐及管式反应器。它与封闭系统中的分批培养方式相反，是在开放的系统中进行的培养方式。在连续培养过程中，微生物细胞所处的环境条件，如营养物质的浓度、产物的浓度、pH以及微生物细胞的浓度、比生长速率等可以自始至终基本保持不

33、变，甚至还可以根据需要来调节微生物细胞的生长速率，因此连续培养的最大特点是微生物细胞的生长速率、产物的代谢均处于恒定状态，可以达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量的代谢产物的目的。此外，对于细胞的生理或代谢规律的研究，连续培养是一种重要的手段。第一节 发酵方式 连续培养过程可以连续不断地收获产物，并能提高细胞密度，在生产中被应用于培养非贴壁依赖性细胞。如英国Celltech公司采用连续培养杂交瘤细胞的方法，连续不断地生产单克隆抗体。1.1.单级连续发酵的理论基础单级连续发酵的理论基础 在任何连续发酵开始，都要先做分批培养，使微生物在接种后生长繁殖达到一定细胞浓度，并进入产物合成期，然后才开始

34、以恒定流量向发酵罐流加培养基，同时以相同的流量流出培养液，使发酵罐内培养液的体积保持恒定，微生物持续生长，合成产物。第一节 发酵方式 连续发酵达到稳态时放掉发酵液中的细胞量等于生成细胞量。流入罐内的料液使得发酵液变稀，流量与培养液体积之比可用D来表示，称为稀释率（h-1），表示单位时间内加入的培养基体积占发酵罐内培养基体积的分率，其倒数表示培养液在发酵罐内平均停留时间。DF/V （5-10）式中 D 稀释率，h-1；F 料液流量，L/h；V 发酵液的体积，L。第一节 发酵方式 在一定时间内细胞浓度的净变化 dX/dtX-DX （5-11)式中 X生长速率，g/(Lh)；DX细胞排放速率，g/(

35、Lh)。在稳态条件下dX/dt0，即X=DX，故 =D （5-12）即在稳态条件下细胞的比生长速率与稀释率相等，可通过补料速率来控制比生长速率，因V不变。稀释率大小将有一定限制，即有一临界稀释率DC，将式（5-6）max S（KsS）代入式（5-11），并化简，得 S=KSD/(max-D)（5-13）第一节 发酵方式 式(5-13)解释了D如何控制。细胞生长将导致基质浓度下降，直到残留基质浓度等于能维持D的基质浓度。如基质浓度消耗到低于能支持相关生长速率的水平，细胞的丢失速率将大于生成的速率，这样基质浓度S将会提高，导致生长速率的增加，平衡又恢复。连续培养系统又称为恒化器，培养物的生长速率受

36、其周围化学环境影响，即受培养基的一种限制性组分控制。设备的差异，如混合不全；菌贴罐壁和培养物的生理因素，如若干基质用于维持反应和在高稀释速率下基质的毒性等造成恒化器的实验结果可能与过去理论预测的结果不同。第一节 发酵方式 2 2多级连续培养多级连续培养 基本恒化器的改进有多种方法，但最普通的办法是把多个发酵罐串联起来，第一罐类似单罐培养，以后下一级罐的进料即为前一发酵罐的出料，这样就组成了多级串联培养（多级恒化系统）。多级恒化系统见图5-6。多级恒化器的优点是在不同级的罐内存在不同的条件。这将有利于多种碳源的利用和次级代谢物的生产。提高生产能力。如采用葡萄糖和麦芽糖混合碳源培养产气克雷伯菌第一

37、级罐内只利用葡萄糖，在第二级罐内利用麦芽糖，菌的生长速率远比第一级小，同时形成次级代谢产物。由于多级连续发酵系统比较复杂，用于研究工作和生产实际有较大的困难。第一节 发酵方式 由于恒化器运行中将部分菌体返回罐内，从而使罐内菌体浓度大于简单恒化器所能达到的浓度，即Y（S0一St）。可通过以下两种办法浓缩菌体：限制菌体从恒化器中排出，让流出的菌体浓度比罐内的小；将流出的发酵液送到菌体分离设备中，如让其沉积或将其离心，再将部分浓缩的菌体送回罐内。图5-6多级恒化器示意图 第一节 发酵方式 这种方法相当于不断接种，增加了罐内的菌体浓度；导致残留基质浓度比简单恒化器小；菌体和产物的最大产量增加；临界稀释

38、率也提高。菌体反馈恒化器能提高基质的利用率，可以改进料液浓度不同的系统的稳定性，适用于被处理的料液较稀的品种，如酿造和废液处理。3 3连续培养在工业生产中的应用连续培养在工业生产中的应用 连续培养在产率、生产的稳定性和易于实现自动化方面比分批发酵优越，但污染杂菌的几率和菌种退化的可能性增加。培养物产率可定义为单位发酵时间形成的菌量。从一批发酵到另一批发酵的间隔时间，包括打料、灭菌、发酵周期、放罐等。比如青霉素连续发酵可较分批发酵产量量提高65%。在连续培养中，选取适当的限制性基质，可大大提高产量，例如采用氯或磷代替葡萄糖作为限制性基质，连续生产链球菌培养乳酸，其生产速率分别提高4.2及12.8

39、倍。第一节 发酵方式 用红曲霉发酵生产-半乳糖苷霉时，为防止葡萄糖对半乳糖诱导作用的抑制，可采用二级连续培养，即在第一级罐中加葡萄糖为碳源，以促进菌体生长；第二级用半乳糖诱导霉的生长，可使霉的生长速率提高57%。用连续培养进行发酵生产，早在20世纪20年代就开始采用连续培养法生产饲料酵母，此后，人们对各种连续培养进行了大量的研究工作。虽然有关酵母、真菌、细菌、放线菌、原核生物、藻类等各种微生物连续培养的报道很多，但大多数都是试验性的，而不是大规模的工业化生产。到目前为止，有关工业化的连续培养生产有以下几个方面。第一节 发酵方式 （1）酵母、细菌等单细胞蛋白产品 20世纪20年代开始采用连续培养

40、法生产饲料酵母，这是最早的单细胞蛋白产品。目前，由造纸厂亚硫酸盐废液连续培养生产饲料酵母较为普遍。到20世纪50年代末，以糖蜜为原料连续培养生产药用酵母和面包酵母的工业开始形成。由于酵母菌的生长受糖浓度的抑制，当糖浓度较高时，酵母进行有氧代谢产生大量酒精，从而使酵母得率下降。一般采用25个反应器串联，在各反应器中同时连续流加糖液，从第一个反应器开始，酵母浓度逐渐增高，但各反应器中糖的浓度却基本保持一致。与批式流加培养比较，其设备生产能力可提高50%左右。第一节 发酵方式 （2）酒精、啤酒、醋酸等一次代谢产物 酒精、啤酒、醋酸、葡萄糖酸等一次代谢产物的连续发酵开始于上世纪50年代初。50年代后期

41、，国内外相继实现了糖蜜制酒精的连续发酵生产。20世纪60年代初，用淀粉质原料连续发酵制造酒精的工业化生产已获得成功。酒精连续发酵多采用10个左右的反应器串联，酒精浓度可达10%左右，发酵液的平均停留时间一般不到分批发酵时间的一半，只需30h左右。啤酒连续发酵的流程有多级搅拌罐式、多级塔式和单塔式三种，其中以单塔连续发酵较为多见。塔式啤酒连续发酵的特点是发酵速率高，塔内具有较高的酵母浓度，一般比分批发酵大16倍左右，因此，发酵时间大幅度降低。醋酸的连续发酵生产多采用单级自吸式反应器和塔式反应器。第一节 发酵方式 （3）污水的生化处理 用活性污泥处理废水普遍采用连续培养的方法。由于废水中的底物浓度

42、相对较低，因而废水处理大多采用浓缩细胞部分回流的方法，以提高生物滤池的生产能力。工业化连续培养应用较为广泛的国家有德国、加拿大、澳大利亚、新西兰和美国等。在我国连续培养的研究与生产始于20世纪50年代。目前已实现的有：由造纸厂亚硫酸盐废液连续生产饲料酵母，以糖蜜为原料连续生产药用酵母和酒精，用淀粉质原料生产酒精的连续发酵已被广泛应用。此外，污水的连续生化处理已被广泛采用，啤酒和面包酵母的连续发酵已完成了中间试验。第一节 发酵方式 4.4.连续培养中存在的问题连续培养中存在的问题 与分批发酵比较，连续发酵过程具有许多优点：在连续发酵达到稳态后，其非生产占用的时间要少许多，故其设备利用率高，单位时

43、间产量高。发酵设备以外的外围设备（如蒸汽锅炉、泵）的利用率高，可以及时排除在发酵过程中产生的对发酵过程有害的物质。但连续发酵技术也存在一些问题，如杂菌的污染，菌种的稳定性问题。（1）污染杂菌问题 在连续发酵过程中需长时间不断地向发酵系统供给无菌的新鲜空气和培养基，这就增加染菌的机会。尽管可以通过选取耐高温、耐极端pH值和能够同化特殊的营养物质的菌株作为生产菌种来控制杂菌的生长。但这种方法的应用范围有限。故染菌问题仍然是连续发酵技术中不易解决的课题。第一节 发酵方式 了解杂菌在什么样的条件下发展成为主要的菌群便能更好地掌握连续培养中杂菌污染的问题。在分批培养中任何能在培养液中生长的杂菌将存活和增

44、长。但在连续培养中杂菌能否积累取决于它在培养系统中的竞争能力。故用连续培养技术可选择性地富集一种能有效使用限制性养分的菌种。（2）生产菌种突变问题 微生物细胞的遗传物质DNA在复制过程中出现差错的频率为百万分之一。尽管自然突变频率很低，一旦在连续培养系统中的生产菌中出现某一个细胞的突变，且突变的结果使这一细胞获得高速生长能力，但失去生产特性的话，它会最终取代系统中原来的生产菌株，而使连续发酵过程失败。第一节 发酵方式 而且，连续培养的时间愈长，所形成的突变株数目愈多，发酵过程失败的可能性便愈大。并不是菌株的所有突变都造成危害，因绝大多数的突变对菌株生命活动的影响不大，不易被发觉。但在连续发酵中

45、出现生产菌株的突变却对工业生产过程特别有害。因工业生产菌株均经多次诱变选育，消除了菌株自身的代谢调节功能，利用有限的碳源和其他养分合成适应人们需求的产物。生产菌种发生回复突变的倾向性很大，因此这些生产菌种在连续发酵时很不稳定，低产突变株最终取代高产生产菌株。第一节 发酵方式 为了解决这一问题，曾设法建立一种不利于低产突变株的选择性生产条件，使低产菌株逐渐被淘汰。例如，利用一株具有多重遗传缺陷的异亮氨酸渗漏型高产菌株生产L一苏氨酸。此生产菌株在连续发酵过程中易发生回复突变而成为低产菌株。若补入的培养基中不含异亮氨酸，那些不能大量积累苏氨酸而同时失去合成异亮氨酸能力的突变株则从发酵液中被自动地去除

46、。六、灌注培养六、灌注培养 灌注培养是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。第一节 发酵方式 当高密度培养动物细胞时，必须确保补充给细胞足够的营养以及去除有毒的代谢废物。在半连续培养中，可以采用取出部分用过的培养基和加入新鲜的培养基的办法来实现。这种分批部分换液办法的缺点在于当细胞密度达到一定量时，废代谢物的浓度可能在换液前就达到产生抑制作用的程度。降低废代谢产物的有效方法就是用新鲜的培养基进行灌注，通过调节灌注速率可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平的状态下。一般在分批培养中密度为

47、（24）x 1O6cells/mL，在灌注系统中可达到（24）x 107 cells/mL。灌注技术已经应用于许多不同的培养系统中，规模分别为几十升至几百升。第二节 发酵动力学 微生物是发酵培养过程的主体，细胞内有各种酶系，它摄取原料中的养分后，通过体内的特定酶系进行复杂的生化反应，将底物转化成有用的产品。微生物发酵过程包括微生物的生长、反应基质的消耗和代谢产物的生成，其中细胞的生长是关键。发酵动力学是对微生物的生长和产物形成的描述，它研究细胞生长速率和发酵产物的生成速率以及环境条件对这些速率的影响。发酵动力学的研究是了解微生物发酵过程的实质所必需的，通过发酵动力学的研究建立发酵过程的数学模型

48、，从而为发酵过程的工艺设计和管理控制提供理论基础，达到提高产品的产率即降低成本的目的。第二节 发酵动力学 一、发酵动力学类型一、发酵动力学类型 发酵动力学类型是为了描述菌体生长、碳源利用与代谢产物形成速度变化，以及它们之间的动力学关系而建立的。微生物种类繁多，具有氧化、还原、分解、合成、转换和积累某种产物等多种代谢机能，通常是按微生物需氧的特点来区分发酵类型。一类是需氧性发酵，由好氧菌引起，发酵时必须充分供氧，如谷氨酸、柠檬酸、抗生素、生长激素、酶制剂等的生产；另一类是厌氧性发酵，由厌氧菌引起，发酵时必须隔离空气，分子氧的存在对发酵有害，只有在需要保持罐压时才向发酵罐中通入无菌空气，如乳酸、丙

49、酮、丁醇等的生产；第三类是兼性发酵，由兼性厌氧菌引起，在有氧存在时进行有氧性发酵，在无氧存在时进行厌氧性发酵，如酒精、酵母菌体的生产。第二节 发酵动力学 按菌体生长、碳源消耗、产物形成三者之间的动力学关系来区分发酵类型，能清楚地比较各种发酵的特点。Gaden根据发酵过程中，产物的形成与底物利用之间关系的不同，将发酵分为三类。型为生长联系型，又称简单发酵型，产物直接由碳源代谢而来，产物生成速度的变化与微生物对碳源利用速度的变化相平行，产物生成和糖的利用有直接的化学计量关系，产物形成与微生物的生长相偶联。例如酵母菌的酒精发酵和供氧条件下生产酵母菌体都属于这一类型。蘑菇菌丝、苏云金杆菌等的培养亦属于

50、此类。第二节 发酵动力学 在单细胞微生物中，菌体增长与时间的关系多为对数关系。酵母生产就是根据对数生长关系和菌体产量常数（在一定的培养条件下，菌体产量与碳源消耗之比）计算加糖速度，以防止过量糖的加入引起酒精产生。在厌氧条件下，酵母菌生长与产物生成是相平行的；在有氧的条件下，糖的消耗速度和菌体生成的速度是平行的过程。在这些发酵过程中，菌体生长、碳源消耗、产物生成三种速度都有一个高峰，三个高峰几乎在相同时间出现。第二节 发酵动力学 型为部分生长联系型，或生长部分相关行，又称中间发酵型。产物不是碳源的直接氧化产物，而是菌体内生物氧化过程的主流产物，碳源既供微生物的生长又供产物生成，碳源利用率较高，产