一章基因操作的主要技术原理课件.ppt

1、第一章第一章 基因操作的主要技术原理基因操作的主要技术原理第二节第二节 凝胶电泳凝胶电泳 凝胶电泳凝胶电泳是一种分析鉴定重组是一种分析鉴定重组DNADNA分分子、蛋白质、蛋白质与核酸相互作用的子、蛋白质、蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。究方法的技术基础。1 凝胶电泳凝胶电泳凝胶包含复杂的孔道网络，凝胶包含复杂的孔道网络，DNADNA分子必须通过这分子必须通过这些孔道才能够到达阳极。些孔道才能够到达阳极。小的小的DNADNA分子，在凝胶中迁移的更快。分子，在凝胶中迁移的更快。按凝胶材料分按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯

2、酰胺凝胶 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳(普通和低熔点琼脂糖普通和低熔点琼脂糖)按电泳装置分按电泳装置分:水平式水平式/琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 竖式竖式/聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶两种方法比较：两种方法比较：分离效果和分离范围分离效果和分离范围;操作难易操作难易 凝胶电泳的种类凝胶电泳的种类 基本原理基本原理带有负电荷的带有负电荷的DNADNA或或RNARNA核苷酸链，核苷酸链，依靠稳定的无反应活性的介质（琼脂糖凝胶和聚依靠稳定的无反应活性的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子

3、大小不同、构型或形状的差异，以根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。2 2 核酸电泳核酸电泳凝胶的成分和浓度决定能够分离的凝胶的成分和浓度决定能够分离的DNADNA大小大小琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶：相对大的孔道，分离大一些的分子；相对大的孔道，分离大一些的分子；聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶：很小的孔道，分离小的很小的孔道，分离小的DNADNA分子，分子，能够分离仅仅相差一个核苷酸的能够分离仅仅相差一个核苷酸的DNADNA分子。分子。用途用途琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶：用于用于

4、DNADNA和和RNARNA的常规分析的常规分析聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶：常用于小分子核酸和蛋白质分析常用于小分子核酸和蛋白质分析凝胶电泳的一般程序凝胶电泳的一般程序 制胶，点样，电泳，染色，观察制胶，点样，电泳，染色，观察取决于核酸分子本身的大小和构型取决于核酸分子本身的大小和构型分子量较小的分子量较小的DNADNA分子，比分子量较大的分子，比分子量较大的DNADNA分子分子迁移率要快；迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环比松散型的开环DNADNA分子或线性分子或线性DNADNA分子迁移率分子迁移率要快。要快。电

5、泳的迁移率电泳的迁移率 与凝胶的类型和密度相关与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在琼脂糖凝胶的分辨力在0.20.250Kb50Kb之间之间;聚丙烯酰胺的分辨力在聚丙烯酰胺的分辨力在1 11000bp1000bp之间；之间；凝胶电泳的分辨力凝胶电泳的分辨力Separation Range of AgarosePolyAcrylamide Gels(PAGE)琼脂糖琼脂糖：一种从红色海藻中提取出的线性多糖一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。聚合物。分为分为 常熔点的琼脂糖常熔点的琼脂糖 低熔点（低熔点（LMPLMP）琼脂糖）琼脂糖2 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳Agarose gel

6、electrophoresisLMPLMP琼脂糖琼脂糖 熔点：熔点：62626565 熔解后，在熔解后，在37 37 可保持液态数小时；可保持液态数小时；在在25 25 可保持液态约可保持液态约10min10min 回收回收DNADNA分子分子 在在65 65 下将下将LMPLMP琼脂糖凝胶熔化；琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提加入过量的酚抽提DNADNA；离心获得含离心获得含DNADNA分子的上清液；分子的上清液；琼脂糖凝胶电泳的参数：琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：缓冲液：1 1 TAE TAE（TBE,TPETBE,TPE）凝胶的含量：根据检测的凝胶的含量：根据检测的DNADNA大小大小

7、加加DNADNA样品：样品：1g1g，指示剂，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间小片段高电压短时间 使凝胶中的使凝胶中的DNADNA分子可视化分子可视化染色是最简单的方法染色是最简单的方法。溴乙锭溴乙锭(EtBr)(EtBr)能够用来对琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶能够用来对琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的中的DNADNA进行染色。进行染色。只要在足够的只要在足够的DNADNA存在条件下，经过存在条件下，经过EtBrEtBr染色后，在染色后，在紫外照射下能以不同的条带显示出来。紫外照射下能以不同的条带显示出来。注意：注意：溴乙锭是非常强的致癌物；紫外光也会

8、灼伤。溴乙锭是非常强的致癌物；紫外光也会灼伤。因此，用于把因此，用于把DNADNA染成蓝色或绿色，又不需要紫外照染成蓝色或绿色，又不需要紫外照射就能看见射就能看见DNADNA的非致癌染料，越来越多地被用于的非致癌染料，越来越多地被用于实验室研究中。实验室研究中。染色和观察：染色和观察：溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）染色，）染色，在在300nm300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）波长的紫外下观察（凝胶成像仪）能看到能看到0.05 g0.05 g的微量的微量DNADNA DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比的片断大小与荧光强度成正比DNA分子大小的估计分子大小的估计如何确定凝胶电泳中片段的

9、大小如何确定凝胶电泳中片段的大小?最准确的方法：最准确的方法：利用迁移速度和分子重量间的数学利用迁移速度和分子重量间的数学关系。相关公式是：关系。相关公式是：D=a-b(logM)D是迁移的距离，是迁移的距离，M是相对分子质量，是相对分子质量，a和和b是依赖是依赖于电泳条件的常数。于电泳条件的常数。通常使用通常使用：一种简单，但相对不太精确的估计：一种简单，但相对不太精确的估计DNADNA片段大小的方法。片段大小的方法。方法：利用已知大小的方法：利用已知大小的DNADNA片段作标准片段作标准(marker(marker/ladder),/ladder),目的目的DNADNA片段与之比对、估计。

10、片段与之比对、估计。例如：例如：HinHindd将将DNADNA切成切成8 8个片段，这些片段的个片段，这些片段的大小都已经知道，范围从大小都已经知道，范围从125bp125bp到到23kb23kb。实验中。实验中的片段大小可以通过对比两条泳道中条带的位的片段大小可以通过对比两条泳道中条带的位置而加以估计。置而加以估计。尽管不十分精确，这种方法进行起来只有尽管不十分精确，这种方法进行起来只有5 5的错的错误率误率Sample Well 25 ng 1 kb ladder0.8%Agarose124681012kbAgarose Gel ElectrophoresisEtBr Detection

11、 Limit:5-10 ng DNA根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小Agarose gel electrophoresis对放射性标记的对放射性标记的DNADNA进行放射性自显影进行放射性自显影染色的一个缺陷是其灵敏性的限制，如果每条带染色的一个缺陷是其灵敏性的限制，如果每条带中中DNADNA的含量少于的含量少于10ng10ng，则很有可能在染色后，则很有可能在染色后仍然看不到条带。对于微量的仍然看不到条带。对于微量的DNADNA就需要更加就需要更加灵敏的检测手段。灵敏的检测手段。放射自显影放射自显影是一个很好的方法。是一个很好的方法。电泳前将电泳前将DNADNA结合上放

12、射性标记，利用结合上放射性标记，利用X X射线敏射线敏感摄影对凝胶进行拍摄就能够肉眼观察到感摄影对凝胶进行拍摄就能够肉眼观察到DNADNA分子。分子。放射性放射性DNADNA使胶片曝光，显示出使胶片曝光，显示出DNADNA条带。条带。聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶：丙稀酰胺丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺（亚甲双丙稀酰胺（2929：1 1）TEMEDTEMED 过硫酸铵（过硫酸铵（1010）缓冲液：缓冲液：TBETBE3 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳链分离凝胶链分离凝胶-SSCP-SSCP用于单链分离用于单链分离,可以进行可以进行SNPSNP的检测。的检测。PAGEPAGE原理：原理：SNP:

13、DNASNP:DNA长度相同，仅一个碱基不同；长度相同，仅一个碱基不同；加热后解链后电泳，迁移速度不同。加热后解链后电泳，迁移速度不同。可以分离可以分离1bp1bp的差异的差异用途：测序、用途：测序、AFLPAFLP、为避免局部区域产生二级结构，可采用各为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）核酸测序凝胶核酸测序凝胶n传统凝胶电泳中，电场是沿着凝胶长度走向定位的，传统凝胶电泳中，电场是沿着凝胶长度走向定位的，DNADNA分子是沿着直线向正极迁移。不

14、同大小的分子是沿着直线向正极迁移。不同大小的DNADNA分子分子在凝胶网状孔道中迁移的时候，迁移速率不同，从而在凝胶网状孔道中迁移的时候，迁移速率不同，从而被分离开。被分离开。n只有一定大小范围内的分子能够通过这种方法分离，只有一定大小范围内的分子能够通过这种方法分离，因为对于大分子来说，分子越大，迁移速率的差异越因为对于大分子来说，分子越大，迁移速率的差异越小。小。n实际操作中，普通的凝胶电泳不能有效地分离大于实际操作中，普通的凝胶电泳不能有效地分离大于50kb50kb的的DNADNA分子。分子。4 通过凝胶电泳分离染色体通过凝胶电泳分离染色体1984年，D.R.Cantor发明的，分离超大

15、分子量的DNA分子。在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。脉冲电场凝胶电泳（脉冲电场凝胶电泳（PFGEPFGE）脉冲场凝胶电泳原理图脉冲场凝胶电泳原理图 北北 南南 脉冲场电泳脉冲场电泳 常规电泳常规电泳 两组电极，排列不均匀两组电极，排列不均匀;一组电极，电场方向不变，电极排列均匀，一组电极，电场方向不变，电极排列均匀，定时改变电场方向，定时改变电场

16、方向，DNA分子的净分子的净 DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳移动方向与电场方向相同。整个电泳 移动方向与两电场呈移动方向与两电场呈45o，在电泳过，在电泳过 过程保持电压稳定。常规方法制备过程保持电压稳定。常规方法制备DNA 程中，电压有时可随时间的增加而样程中，电压有时可随时间的增加而样品增加，品增加，制备制备DNA样品与常规方法样品与常规方法不同不同脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳PFGEPFGE工作假说工作假说1)1)DNA DNA松弛时间：大分子松弛时间：大分子DNADNA改变形状和重新定向所需改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与的时间。这个时间与DNADNA分子量呈正相关（分

17、子量呈正相关（TrTr）2)2)DNA DNA移动时间：移动时间：DNADNA分子向前移动的时间（分子向前移动的时间（TmTm）3)3)电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（TpTp）与分子量小的与分子量小的DNADNA分子相比，分子量大的分子相比，分子量大的DNADNA分子分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量到了分离大分子量DNADNA分子的目的。分子的目的。可以分离几千可以分离几千kbkb的的DNADNA分子。

18、这个长度范围包分子。这个长度范围包含许多真核生物染色体分子，包括酵母、许多含许多真核生物染色体分子，包括酵母、许多重要的丝状真菌和原生动物，如疟疾新生虫。重要的丝状真菌和原生动物，如疟疾新生虫。因此，能够得到这些生物体染色体的凝胶图谱。因此，能够得到这些生物体染色体的凝胶图谱。PFGE can resolve large DNA fragments染色体染色体DNADNA电泳的用途电泳的用途 1.测定染色体数目测定染色体数目：特别适合于低等真核生物：特别适合于低等真核生物 2.测定基因连锁关系测定基因连锁关系：结合：结合DNA杂交技术，可适合各种生物杂交技术，可适合各种生物 3.染色体染色体D

19、NA重排分析重排分析 1）酵母细胞经）酵母细胞经X-射线照射，染色体发生断裂，可得弥散型。射线照射，染色体发生断裂，可得弥散型。但让其修复后，又可形成带，但有的发生了重排，导致但让其修复后，又可形成带，但有的发生了重排，导致 带型变化带型变化 2）非洲锥虫：变异表面糖蛋白基因的表达）非洲锥虫：变异表面糖蛋白基因的表达 4.疾病的诊断疾病的诊断 引起某种皮肤病的原生动物引起某种皮肤病的原生动物Leishmania,具有其特征性的染具有其特征性的染色体。色体。PFG便可用于诊断。便可用于诊断。方法：不同的方法：不同的RNARNA电泳方法是依据使电泳方法是依据使RNARNA分子变性所采分子变性所采取

20、的方法。这些方法不仅要使取的方法。这些方法不仅要使RNARNA分子在点样时分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。级结构。1.1.乙二醛乙二醛/二甲基亚砜法二甲基亚砜法 原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GCGC碱基的互补作用发生。碱基的互补作用发生。步骤：步骤：RNA+10mMRNA+10mM羟甲基醛和羟甲基醛和50%DMSO50%DMSO混合混合 5050、1 1 h h变性变性 点样点样 电泳

21、电泳 染色染色 观察观察 5 RNA5 RNA凝胶电泳凝胶电泳2.2.羟甲基汞法羟甲基汞法原理：羟甲基汞可与原理：羟甲基汞可与RNARNA分子的嘌呤或嘧啶分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。键的亚氨基处。步骤：步骤：RNA+10mMRNA+10mM羟甲基醛，点样在含羟甲基醛，点样在含4mM4mM羟羟甲基醛的琼脂糖凝胶上，电泳，染色观甲基醛的琼脂糖凝胶上，电泳，染色观察察 3.3.甲醛法甲醛法步骤：步骤：RNA+2.2MRNA+2.2M甲醛甲醛+50%+50%甲胺，点样在含甲胺，点样在含2.2M2.2M甲醛琼脂甲醛琼脂糖凝胶上，糖凝胶

22、上，MOPSMOPS缓冲液电泳，染色观察缓冲液电泳，染色观察其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于RNARNA电泳电泳.4.4.三种方法的比较三种方法的比较 第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的的RNARNA样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收应可逆，回收RNARNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。小心，因两种变性剂有毒。6 蛋白质电泳蛋白质电泳方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前

23、者方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为常称之为SDS-PAGESDS-PAGE。差别：有无变性剂。差别：有无变性剂用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化）中，可直接用于酶促反应（颜色变化）SDS-PAGESDS-PAGE可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。mRNAmRNA翻译产物，基因表达产物测定等。翻译产物，基因表达产物测定等。用于用于DNA、RNA以及蛋白质的回收以及蛋白质的回收方法方法 1)电洗脱法电洗脱法:利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子洗脱到利用电泳方法将

24、凝胶中的特定核酸分子洗脱到其它介质中；其它介质中；2)滤纸法滤纸法 核酸凝胶染色，长波紫外光确定位置，在分离核酸凝胶染色，长波紫外光确定位置，在分离带前方切一口子并插入滤纸条带前方切一口子并插入滤纸条(其背面覆盖透析袋膜其背面覆盖透析袋膜)，电，电泳至泳至DNA带全部进入滤纸条，洗脱带全部进入滤纸条，洗脱DNA，纯化、沉淀，纯化、沉淀 7 电泳片段的分离与回收电泳片段的分离与回收3)3)透析袋法透析袋法切下含切下含DNADNA带琼脂块，放入带琼脂块，放入透析袋，封口，放入电泳槽，电泳透析袋，封口，放入电泳槽，电泳2-32-3小小时至全部时至全部DNADNA离开凝胶块，反向电泳离开凝胶块，反向电

25、泳1 1分分钟，取出钟，取出DNADNA液，纯化、沉淀。液，纯化、沉淀。4)4)冻融法冻融法待回收待回收DNA 切口切口 DNA 切口切口 凝胶块凝胶块 滤纸法滤纸法 透析袋透析袋 凝胶块凝胶块 待回收待回收DNA DNA 透析袋法透析袋法 待回收待回收DNA 凝胶块凝胶块 V-型槽型槽 电洗脱槽法电洗脱槽法 回收回收DNADNA方法方法 影响回收率的因素影响回收率的因素 1 1）DNADNA分子大小分子大小回收率与分子量大小呈负相关；回收率与分子量大小呈负相关；2 2）乙醇沉淀）乙醇沉淀其中温度、时间和其中温度、时间和DNADNA浓度（回收时浓度（回收时体积）均与回收率有关；体积）均与回收率有关；3 3）离心时间）离心时间时间越长，效果越好，对低浓度时间越长，效果越好，对低浓度DNADNA尤其明显。尤其明显。