PCR原理及检测说课讲解课件.ppt

1、多聚酶链式反应多聚酶链式反应 PCR是由美国科学家是由美国科学家1.1.PCRPCR的概念的概念2.2.PCRPCR体系的组成体系的组成3.3.常见的常见的PCRPCR分类分类4.4.PCRPCR产物常见的检测方法产物常见的检测方法PCRPCR的基本原理的基本原理 变性、复性、半保留复制变性、复性、半保留复制一生二，二生四，四生万物一生二，二生四，四生万物 PCRPCR三步曲三步曲变性变性 90 909797退火退火 45 455555延伸延伸 72 72左右左右PCRPCR过程过程PCR反应循环反应循环1234522557294时间（min）温度（）2.PCR的反应过程适温延伸3高温变性1低

2、温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点9550引物1引物2DNA引物nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1

3、轮结束95第2轮开始nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaqnPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束3 PCR的特点n灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌n简便、快速1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析n对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA4.PCR4.PCR的反应体系和方法的反应体系和方法 PCR管加热使模板变性,退火使引物与模

4、板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。n提取的核酸即可作为模板用于提取的核酸即可作为模板用于PCRPCR反应反应n一般临床检测标本，可采用快速简便的方法一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋

5、白质使靶基因游离，直接用于蛋白质使靶基因游离，直接用于PCRPCR扩增扩增nRNARNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K K法，要防止法，要防止RNaseRNase降解降解RNARNA 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下反应特异性下降。降。n引物是引物是PCRPCR特异性反应的关键特异性反应的关键nPCR PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNADNA互补的互补的程度程度n理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，就能序列，就能按其

6、设计互补的寡核苷酸链做引物，用按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR PCR就就可将模板可将模板DNADNA在体外大量扩增在体外大量扩增n目前有两种目前有两种 Taq DNA Taq DNA 聚合酶供应聚合酶供应q天然酶：从栖热水生杆菌中提纯天然酶：从栖热水生杆菌中提纯q基因工程酶：大肠菌合成基因工程酶：大肠菌合成n一个典型的一个典型的 PCR PCR反应约需酶量反应约需酶量 2.5U 2.5U（指总（指总反应体积为反应体积为100 ul100 ul时）时）n浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少合成产物量减少 dNTPdNTP浓度取决于

7、扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则浓度过低则 降低反应产量降低反应产量 dNTP dNTP可与可与Mg2+Mg2+结合结合,使游离的使游离的Mg2+Mg2+浓度下降浓度下降,影响影响DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。ndNTPdNTP的质量与浓度和的质量与浓度和 PCR PCR扩增效率有密切关系扩增效率有密切关系qdNTPdNTP呈颗粒状，呈颗粒状，保存不当易变性失活保存不当易变性失活qdNTPdNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后

8、，以1M 1M NaOHNaOH或或1M Tris-HCl1M Tris-HCl的缓冲液将其的缓冲液将其pHpH调节到调节到7.0-7.57.0-7.5，小量分装，小量分装，-20-20冰冻保存。多次冻融会使冰冻保存。多次冻融会使dNTPdNTP降解降解q在在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为50-200umol/L50-200umol/L，尤其是注意，尤其是注意4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等（等摩尔配制的浓度要相等（等摩尔配制 ），），如其中任何如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会

9、降低起错配。浓度过低又会降低PCRPCR产物的产量产物的产量qdNTP dNTP 能与能与MgMg2+2+结合，使游离的结合，使游离的MgMg2+2+浓度降低浓度降低Mg2Mg2+是是DNADNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。反应体系。Mg2Mg2+浓度过低会使浓度过低会使TaqTaq酶活性丧失、酶活性丧失、PCRPCR产量下降；产量下降；Mg2Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。Mg2Mg2+可与负离子结合可与负离子结合,所以反应体系中所以反应体系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等的浓度影

10、响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的Mg2Mg2+浓度。浓度。使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链 94 94o oC 20-30C 20-30秒秒温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结增加温度能减少引物与模板的非特异性结合合;降低温度可增加反应的灵敏性。降低温度可增加反应的灵敏性。70-75,70-75,一般为一般为7272 延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定主要取决于模版主要取决于模版DNADNA的浓度的浓度 一般为一般为25-3525-35次次 次数过多：扩增效率降低次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增

11、加错误掺入率增加30次nPCRPCR反应条件反应条件:q温度温度q时间时间q循环次数循环次数n设置变性设置变性-退火退火-延伸三个温度点延伸三个温度点n标准反应中采用三温度点法，双链标准反应中采用三温度点法，双链DNADNA在在90909595变性，再迅速冷却至变性，再迅速冷却至40 40 6060，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至至70707575，在，在Taq DNA Taq DNA 聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸使引物链沿模板延伸n对于较短靶基因（长度为对于较短靶基因（长度为100100300bp300bp时）可时）可采用

12、二温度点法，采用二温度点法，将退火与延伸温度合二将退火与延伸温度合二为一，一般采用为一，一般采用9494变性，变性，6565左右退火与左右退火与延伸延伸n变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCRPCR失败的失败的最主要原因最主要原因n一般一般939394lmin94lmin足以使模板足以使模板DNADNA变性变性q若低于若低于9393则需延长时间则需延长时间q但温度不能过高，因为高温环境对酶的活但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。性有影响。n此步若不能使靶基因模板或此步若不能使靶基因模板或PCRPCR产物完全变产物完全变性，就会导致性，就会导致PCRPCR失败失

13、败n退火温度是影响退火温度是影响PCRPCR特异性的较重要因素特异性的较重要因素n变性后温度快速冷却至变性后温度快速冷却至40406060，可使引物，可使引物和模板发生结合。由于模板和模板发生结合。由于模板DNA DNA 比引物复杂得比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞模板互补链之间的碰撞n退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度成及其浓度，还有靶基序列的长度n对于对于2020个核苷酸，个核苷酸，G+CG+C含量约含量约50%50%的引物，的引物，5

14、555为选择最适退火温度的起点较为理想为选择最适退火温度的起点较为理想nTmTm值（解链温度）值（解链温度）=4=4（G+CG+C）2 2（A+TA+T）q在在TmTm值允许范围内，选择较高的复性温度值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高提高PCRPCR反应的特异性反应的特异性n复性时间一般为复性时间一般为30-60sec30-60sec，足以使引物与，足以使引物与模板之间完全结合模板之间完全结合nTaq DNATaq DNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性：70-80 150 70-80 150核苷酸核苷酸/S/

15、S/酶分子酶分子 70 60 70 60核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 55 24 55 24核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 高于高于9090时，时，DNADNA合成几乎不能进行合成几乎不能进行n延伸温度：一般选择在延伸温度：一般选择在70707575之间之间q常用温度为常用温度为7272q过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。n延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定q1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min（足够）（足够）q3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34mi

16、n4minq扩增扩增10Kb10Kb需延伸至需延伸至15min15minn延伸进间过长会导致非特异性扩增延伸进间过长会导致非特异性扩增n对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些n循环次数循环次数q决定决定PCRPCR扩增程度扩增程度n循环次数循环次数q主要取决于模板主要取决于模板DNADNA的浓度的浓度n循环次数：选在循环次数：选在30304040次之间次之间n循环次数越多，非特异性产物的量亦随之循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多增多名称名称主要用途主要用途简并引物扩增法简并引物扩增法扩增未知基因片断扩增未知基因片断巢式巢式PCRPCR提高提高pcrpcr

17、敏感性、特异性，分敏感性、特异性，分析突变析突变复合复合PCRPCR同时检测多个突变或病原同时检测多个突变或病原反向反向PCRPCR扩增已知序列两侧的未知序扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变列，致产物突变单一特异引物单一特异引物PCRPCR扩增未知基因组扩增未知基因组DNADNA单侧引物单侧引物PCRPCR通过已知序列扩增未知通过已知序列扩增未知cDNAcDNA锚定锚定PCRPCR分析具备不同末端的序列分析具备不同末端的序列名称名称主要用途主要用途增效增效PCRPCR减少引物二聚体，提高减少引物二聚体，提高PCRPCR特异性特异性固着固着PCRPCR有利于产物的分离有利于产物的分离膜结合膜

18、结合PCRPCR去除污染的杂质或去除污染的杂质或PCRPCR产物残留产物残留表达盒表达盒PCRPCR产生合成或突变蛋白质的产生合成或突变蛋白质的DNADNA片断片断连接介导连接介导PCRPCRDNADNA甲基化分析、突变和克隆等甲基化分析、突变和克隆等RACE-PCRRACE-PCR扩增扩增cDNAcDNA末端末端定量定量PCRPCR定量定量mRNAmRNA或染色体基因或染色体基因原位原位PCRPCR研究表达基因的细胞比例等研究表达基因的细胞比例等臆断臆断PCRPCR鉴定细菌或遗传作用鉴定细菌或遗传作用通用引物通用引物PCRPCR扩增相关基因或检测相关病原扩增相关基因或检测相关病原信使扩增表型

19、分型信使扩增表型分型同时分析少量细胞的同时分析少量细胞的mRNAmRNA定量PCR：荧光实时定量荧光实时定量PCRPCR技术是指在技术是指在PCRPCR反应体系中加入荧光基反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个团，利用荧光信号累积实时监测整个PCRPCR进程，最后通进程，最后通 过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常用的荧光标记方法可简单分为两大类两大类：非特异检测双链DNA内插式荧光染料；代表是SYBR Green I荧光染料 扩增序列专一检测主要指荧光探针。TaqMan探针、和分子信标Molecular Beacon 荧光染料技术成本

20、低廉，实验设计简便；而探针杂交技术在原理上严格，所得数据特异性高、更为精确 qSYBR Green 1结合到双链DNA的小沟部位qSYBR Green 1染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBR Green I只与DNA双链结合，插入DNA双链时发出荧光；DNA双链解链时释放出来，荧光信号急剧减弱。在一个加入过量SYBR green 1荧光染料的体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量 GTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT变性 DNA未结合未结合SYBR Gr

21、een 1 dyeSYBR Green 1 dye茎由互补配对的序列组成茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对环与目标序列完全配对荧光基团荧光基团淬灭基团淬灭基团分子信标（molecular beacon）是一类能形成发夹结构(或者叫茎环结构)的探针，序列两末端序列互补（58bp左右），中间环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补。探针一端标记报告荧光基团，另一端结合淬灭基团，当互补序列出现时，探针与DNA杂交，探针转变成一个开放的线性结构，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光 当探针游离呈发夹结构时，结合在其两

22、端的荧光基团距离上接近，荧光基团激发的荧光能量被淬灭基团吸收而使检测探头无法检测到。TACCGGGGGTTACGAACG GTAATTTTTGCCCCCAAAAQ荧光素目标序列茎淬灭剂指扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针：该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q。）当探针完整的时候，5端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3端荧光基团淬灭，仪器检测不到5端报告基团所激发的荧光信号与目标序列互补TaqMan探针法：PCR扩增过程中：nTaq酶在链延伸时遇到与模

23、板结合的探针，其5-3外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）就会将切割探针n释放5端报告基团游离于反应体系中，远离3端荧光淬灭基团的屏蔽，5端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。n每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数 d.定量原理：荧光信号荧光信号阈阈值值 （threshold threshold）：n 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值n真正的信号:荧光信号超过阈阈值CtCt值的定义：值的定义：PCRPCR扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增长扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阶段的拐点拐点所对应的循环次数。所对应的循环次数。实验操作中，实验操作中，CtCt值的含义是：每个反应管内的荧光值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。信号达到设定的域值时所经历的循环数。C(t)value 横轴：横轴：PCRPCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量CtCt值的特点：值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性相同模板在同一台相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重仪上相同条件下重复复96次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图