-第02章蛋白质的结构与功能课件.ppt

1、蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能第第2 2章章Structure and Function of Proteinn什么是蛋白质什么是蛋白质?蛋白质蛋白质(protein)是由许多氨基酸是由许多氨基酸(amino acids)构成的具有特定空间结构成的具有特定空间结构的高分子有机物。构的高分子有机物。蛋白质在生命活动中的重要作用生物催化作用免疫保护作用运动与支持作用运输和储存作用代谢调节作用控制生长和分化接收和传递信息生物膜高等动物记忆和识别氧化供能抗冻蛋白（抗冻蛋白（antifreeze protein）荧光抗冻蛋白装饰的冰晶体荧光抗冻蛋白装饰的冰晶体 抗冻蛋白，附着在抗冻蛋白，附着在冰晶

2、体表面，抑制冰晶体表面，抑制冰晶体生长，防止冰晶体生长，防止有机体冻伤。有机体冻伤。蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成The Molecular Component of Protein第一节第一节n组成蛋白质的元素组成蛋白质的元素主要有主要有C C、H H、O O、N N和和 S S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘有碘 。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为1616。由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品

3、中的含氮量，就可以根据以下只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16%n蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点举例：一个生物样品的含氮量为5%，它的蛋白质含量为：（）A.8.8%B.12.5%C.16.0%D.38.0%E.31.25%三聚氰胺事件一、氨基酸一、氨基酸 存在自然界中的氨基酸有存在自然界中的氨基酸有300300余种，但组成余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有人体蛋白质的氨基酸仅有2020种，且均属种，且均属 L-L

4、-氨氨基酸基酸 （甘氨酸除外）。（甘氨酸除外）。H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式RC+NH3COO-H(一一)氨基酸的结构特点氨基酸的结构特点氨基酸的共同特点：（1）两性电解质（2）除甘氨酸外都是L 型氨基酸（3）侧链R基团结构和性质不同非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸(二二)氨基酸的氨基酸的分类分类1.1.依侧链依侧链R R基团的结构和理化性质分基团的结构和理化性质分:非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸极性中性氨基酸带正电荷的碱性氨基酸带正电荷的碱性氨基酸带负电荷的酸性氨基酸带负电荷的酸性氨基酸n几种特殊氨基酸几种特殊氨基

5、酸 脯氨酸脯氨酸（亚氨基酸）（亚氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HH-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH32.营养学分类必需氨基酸：赖、色、苯丙、甲硫、苏、亮、异亮、缬非必需氨基酸：12种3.根据氨基酸结构分类 （1）脂肪族氨基酸：甘、丙、丝、苏、半胱、甲硫

6、、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬、谷、精、赖。（2）支链氨基酸：缬、亮、异亮。（3）芳香族氨基酸：苯丙、酪、色。（4）杂环氨基酸：组、色。（5）杂环亚氨基酸：脯(三三)氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质1.两性解离及等电点两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。处溶液的酸碱度。等电点等电点(isoelectric point,pI)在某一在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的中性。此时溶液的pH值值称为该

7、氨基酸的称为该氨基酸的等电点等电点。pH=pIpHpI+H+pHpI氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子CHNH2COOHR CHNH2COOHRCHNH3+COO-R CHNH3+COO-RCHNH2COO-R CHNH2COO-RCH COOHRNH3+CH COOHRNH3+H+2.2.紫外吸收性质紫外吸收性质色氨酸、酪氨酸色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在的最大吸收峰在 280 nm 附近。附近。大多数蛋白质含大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量析溶液中蛋白质含

8、量的快速简便的方法。的快速简便的方法。3.3.氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在化合物，其最大吸收峰在570nm处。处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。系，因此可作为氨基酸定量分析方法。二、肽二、肽肽键肽键是由一个氨基酸的是由一个氨基酸的-羧基与另羧基与另一个氨基酸的一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的氨基脱水缩合而形成的化学键。化学键。（一）肽（一）肽(peptide)(peptide)

9、与肽键与肽键(peptide bond)(peptide bond)NH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。合物。两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽酸缩合则形成三肽肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基不全，被称为氨基

10、酸残基(residue)。由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽称多肽(polypeptide)。N N 末端：多肽链中有末端：多肽链中有游离游离-氨基氨基端端C C 末端：多肽链中有末端：多肽链中有游离游离-羧基羧基端端n多肽链有两端：多肽链有两端：丙氨酰酪氨酰天冬氨酰甘氨酸（二）（二）生物活性肽生物活性肽 1.谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)氧化型谷胱甘肽（GSSG）GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶

11、NADPH+H+NADP+nGSH与与GSSG间的转换间的转换 体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽多肽类激素及神经肽蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构The Molecular Structure of Protein 第二节第二节n蛋白质的分子结构包括蛋白质的分子结构包括:高级高级结构结构一级结构一级结构(primary structure)二级结构二级结构(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary structure)n定

12、义定义:蛋白质的一级结构指在蛋白质中氨基酸的数蛋白质的一级结构指在蛋白质中氨基酸的数目、排列顺序及共价连接。目、排列顺序及共价连接。氨基酸排列顺序从氨基酸排列顺序从N-端至端至C-端的端的。一、一、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构n主要的化学键主要的化学键:肽键肽键，有些蛋白质还包括，有些蛋白质还包括二硫键。二硫键。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能功能的基础的基础。二、蛋白质的空间结构 蛋白质构象又分为主链构象和侧链构象，主链构象指多肽链上各原子的排布及相互关系；侧链构象是指各氨基酸侧链基团中原子的排布及彼此关系。主链构象决定侧链基团的排布，侧链构象

13、影响主链构象的卷曲和折叠，二者相互依存，相互影响。（一）蛋白质的二级结构（一）蛋白质的二级结构 (secondary structure)(secondary structure)蛋白质分子中某一段肽链的局部空间蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。n定义定义:n主要的化学键主要的化学键：氢键氢键 肽单元肽单元参与肽键的参与肽键的6个原子个原子C 1、C、O、N、H、C 2位于同一平面，位于同一平面，此同一平面上的此同一平面上的6个原子构成了个原子构成了所

14、谓的所谓的肽单元肽单元(peptide unit)。-螺旋螺旋 (-helix)-折叠折叠 (-pleated sheet)-转角转角 (-turn)无规卷曲无规卷曲 (random coil)n蛋白质二级结构蛋白质二级结构 蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋螺旋或或-折叠，它就会出现相应的二级结构。折叠，它就会出现相应的二级结构。1.-螺旋螺旋(-helix)Linus Pauling Robert Corey-螺旋的结构特点螺旋的结构特点:为一右手螺旋，螺旋每圈包含3.6个氨基酸

15、残基，螺距为0.54nm，每个氨基酸残基向上平移0.15nm，直径0.23nm。相邻2圈螺旋间第1个肽单位的C=O与第4个肽单位的N-H形成氢键，氢键方向与螺旋纵轴平行。肽链中氨基酸残基的R基团均伸向螺旋的外侧，其空间形状、大小及电荷对-螺旋的形成和稳定有重要的影响。2.2.-折叠（折叠（sheet)sheet)Tu-折叠的结构特点折叠的结构特点(1)多肽链充分伸展，由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构。相邻肽平面呈110夹角，主链骨架伸展呈锯齿状。(2)相邻主链之间靠氢键维系。氢键的方向与肽链长轴垂直。肽链中氨基酸的残基的R侧链分布在片层上下。(3)两端肽链可以是平行的，也可以是反

16、平行的。反平行式更为稳定。-转角转角 第一个氨基酸残基的第一个氨基酸残基的C=O与第四个残基的与第四个残基的NH形成氢键形成氢键3.3.-转角（转角（-turn)-turn)无规卷曲（无规卷曲（random coil）无规卷曲是用来阐述没有确定规律性无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。的那部分肽链结构。蛋白质分子中各种二级结构（二）（二）超二级结构超二级结构(supersecondary structure)超二级结构又称模体（超二级结构又称模体（motifmotif），是指在多），是指在多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间折叠中靠近

17、，彼此相互作用，形成规则的二级折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的二级结构聚集体。结构聚集体。n模体常见的形式模体常见的形式钙结合蛋白中结合钙结合蛋白中结合钙离子的模体钙离子的模体锌指结构锌指结构（三）蛋白质三级结构（三）蛋白质三级结构(tertiary structure)(tertiary structure)整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。n定义定义:磷酸甘油酸激酶的结构域磷酸甘油酸激酶的结构域 结构域结构域(domain)(domain)：是蛋白质构象中特定空间区

18、域。在较大蛋白是蛋白质构象中特定空间区域。在较大蛋白质分子中，由多肽链上相邻的超二级结构紧密联质分子中，由多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成独立的结构单位。系，形成独立的结构单位。主要的化学键主要的化学键(次级键次级键):氢键离子键疏水相互作用 又称疏水键，是稳定三级结构最主要的作用力范德华力二硫键（共价键）A氢键；B.二硫键；C.疏水作用；D.盐键；E.范德华力 肌红蛋白肌红蛋白(Mb)一级结构一级结构:153:153个氨基酸的排个氨基酸的排列顺序列顺序二级结构二级结构:A-H:A-H 共共8 8个个-螺旋螺旋,之间以无规卷曲相连之间以无规卷曲相连三级结构三级结构:球状分子球状分子,亲水

19、亲水R R基基位于表面位于表面,疏水疏水R R基位于分子内基位于分子内部部,形成疏水口袋形成疏水口袋,血红素位于血红素位于口袋中口袋中亚基之间的结合主要是疏水作用亚基之间的结合主要是疏水作用,氢键和离氢键和离子键。子键。四、四、蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级蛋白质的四级结构结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的质的亚基亚基 (sub

20、unit)。由由2个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为结构相同，称之为同二聚体同二聚体(homodimer)，若亚基分子，若亚基分子结构不同，则称之为结构不同，则称之为异二聚体异二聚体(heterodimer)。血红蛋白的血红蛋白的四级结构四级结构 某些蛋白质分子可进一步聚合成聚某些蛋白质分子可进一步聚合成聚合体合体(polymer)。聚合体中的重复单位。聚合体中的重复单位称为单体（称为单体（monomer)，聚合体可按其，聚合体可按其中所含单体的数量不同而分为二聚体、中所含单体的数量不同而分为二聚体、三聚体三聚体寡聚体（寡聚体（ol

21、igomer)和多和多聚体（聚体（polymer)。蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein第三节第三节（一）一级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构一、蛋白质一级结构与功能的关系与功能的关系牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二硫硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、痕量痕量-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性分子伴侣(molecular chaperon)1.防止新生

22、肽链的错误折叠和聚合2.肽链快速折叠成正确的维构型并成熟为具有完整结构和功能的蛋白质HSP(heat shock protein)伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用（二）一级结构是功能的基础（二）一级结构是功能的基础 一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能与功能胰岛素胰岛素氨基酸残基序号氨基酸残基序号A5A6A10B30人人ThrSerIleThr猪猪ThrSerIleAla狗狗ThrSerIleAla兔兔ThrGlyIleSer牛牛AlaGlyValAla羊羊AlaSerValAla马马ThrSerIleAla对一级结构的比较

23、对一级结构的比较,可以反应分子进化可以反应分子进化一些广泛存在于一些广泛存在于生物界的蛋白质如生物界的蛋白质如细胞色素细胞色素(cytochrome C)(cytochrome C)，比较它们的一级结比较它们的一级结构，可以帮助了解构，可以帮助了解物种进化间的关系。物种进化间的关系。分子病分子病:蛋白质一级结构改变引起疾病称为“分子病”。因为蛋白质一级结构中氨基酸排列顺序是由于遗传密码所决定，氨基酸的改变最根本原因是DNA碱基顺序的改变所致，因此了解一级结构的就能从分子水平诊断和治疗遗传病。镰状红细胞贫血镰状红细胞贫血n例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr

24、 pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146)关键部位氨基酸变换，严重影响蛋白质功能关键部位氨基酸变换，严重影响蛋白质功能二、二、蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质空间结构与功能的关系（一）蛋白质的空间结构决定其生物学功能（一）蛋白质的空间结构决定其生物学功能 蛋白质的功能不仅与一级结构有关，更蛋白质的功能不仅与一级结构有关，更重要的依赖于蛋白质的空间构象。重要的依赖于蛋白质的空间构象。例：各种蛋白质前体的加工与激活例：各种蛋白质前体的加工与激活 酶原的激活酶原的激活 激素前体的激活激素前体的激活赖

25、赖缬缬天天天天天天天天甘甘异异赖赖缬缬天天天天天天天天缬缬组组丝丝甘甘异异缬缬组组丝丝 蛋白质分子可与某些小分子物质相互作用，致使构象发生轻微的改变，生物学效应随之发生较大的改变。这种作用称为变构作用或别构效应。（二）蛋白质的空间构象变化与功能（二）蛋白质的空间构象变化与功能n肌红蛋白肌红蛋白/血红蛋白血红蛋白含有血红素辅基含有血红素辅基血红素结构血红素结构 血红素与蛋白血红素与蛋白质稳定结合主要靠质稳定结合主要靠两种作用：一是血两种作用：一是血红素分子中丙氨酸红素分子中丙氨酸侧链与肽链中氨基侧链与肽链中氨基酸侧链相连，另一酸侧链相连，另一种作用肽链中组氨种作用肽链中组氨酸残基还与酸残基还与F

26、eFe2+2+形成形成配位结合。配位结合。n血红蛋白血红蛋白(hemoglobin，Hb)血红蛋白具有血红蛋白具有4 4个亚基组成的四级结个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合构，每个亚基可结合1 1个血红素并携带个血红素并携带1 1分分子氧。子氧。HbHb亚基之间通过亚基之间通过8 8对盐键，使对盐键，使4 4个亚基个亚基紧密结合而形成亲水紧密结合而形成亲水的球状蛋白。的球状蛋白。HbHb与与MbMb一样能可逆地与一样能可逆地与O O2 2结合，结合，HbHb与与O O2 2结结合后称为氧合合后称为氧合HbHb。氧合。氧合HbHb占总占总HbHb的百分数（称的百分数（称百分饱和度）随百分饱和度

27、）随O O2 2浓度变化而改变。浓度变化而改变。血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线n协同效应协同效应(cooperativity)(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negative cooperativity)n变构效应变构效应(allosteric effect)(al

28、losteric effect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变化，称为变构效应变构效应。nHbHb与与MbMb在空间结构上的不同在空间结构上的不同,决定决定 它们在体内发它们在体内发挥不同的生理功能挥不同的生理功能蛋白质构象改变蛋白质构象改变可引起疾病可引起疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀

29、，产生毒性而致病，表现酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、克年痴呆症、亨停顿舞蹈病、克-雅病、疯牛病等。雅病、疯牛病等。疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPcPrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为为-折叠的折叠的PrPsc，从而

30、致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠细胞型细胞型致病型致病型n疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变1982,the Prion Theory库鲁病(kuru)第四节第四节蛋白质的理化性质及其分离纯蛋白质的理化性质及其分离纯化化一、一、蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成时，蛋

31、白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。n蛋白质的等电点蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)（一）两性解离及等电点（一）两性解离及等电点（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自可自1万至万至100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜n蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素:

32、（三）蛋白质的变性与凝固（三）蛋白质的变性与凝固在某些理化因素的作用下，蛋白质中维在某些理化因素的作用下，蛋白质中维系其空间结构的次级键（甚至二硫键）断裂，系其空间结构的次级键（甚至二硫键）断裂，使其空间结构遭受破坏，造成其理化性质的使其空间结构遭受破坏，造成其理化性质的改变和生物学活性的丧失。改变和生物学活性的丧失。蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)n造成变性的因素造成变性的因素:如如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等强碱、重金属离子及生物碱试剂等。n变性的本质变性的本质:破坏非共价键和二硫键，不改变破坏非共价键和二硫键，

33、不改变蛋白质的一级结构。蛋白质的一级结构。若蛋白质变性程度较轻，去除变性若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原 有 的 构 象 和 功 能，称 为原 有 的 构 象 和 功 能，称 为 复 性复 性(renaturation)。天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性蛋白质从溶液中析出的现象。蛋白质从溶液中析出的现象。蛋白质沉淀蛋白质沉淀中性盐中性盐有机溶剂有机溶剂生物碱试剂生物碱试剂重金属离子重金属离子蛋白质变性后的絮状物加

34、热可变成比较蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。碱中。蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation)(protein coagulation)凝固是蛋白质变性后进一步发展的结构。变性的蛋白质容易沉淀，变性的蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性，凝固的蛋白质均已变性而且不再溶解。n 应用举例应用举例:临床医学上，变性因素常被应用来消临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。毒及灭菌。此外此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。白质制剂（

35、如疫苗等）的必要条件。（四）蛋白质的呈色反应（四）蛋白质的呈色反应1.茚三酮反应 2.双缩脲反应 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。3酚试剂反应 蛋白质分子中酪氨酸的酚基与酚试剂作用，生成蓝色络合物,该蓝色物质在650nm下有强吸收。在一定范围内，蛋白质浓度与A650光吸收成正相关，因此可以用来进行蛋白质定量（五）蛋白质的紫外吸收光谱特性（五）蛋白质的紫外吸收光谱特性 蛋白质分子中酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸含有共轭双键，在280nm紫外光谱处，有特征性的最大吸收峰。280nm的吸收值常用于蛋白质的定量测定

36、。蛋白质浓度估算公式 C=1.45A2800.74A260来。二、蛋白质的分离和纯化二、蛋白质的分离和纯化 破碎组织和细胞，将蛋白质溶解于溶液中的过程称为蛋白质的提取。将溶液中蛋白质相互分离而取得单一蛋白组分的过程称为蛋白质的纯化。（一）改变蛋白质的溶解度（一）改变蛋白质的溶解度盐析盐析(salt precipitation)是用高浓度的中性盐将是用高浓度的中性盐将蛋白质从溶液中析出的方法。蛋白质从溶液中析出的方法。盐析、有机溶剂沉淀、调节盐析、有机溶剂沉淀、调节pHpH值、改变温度值、改变温度硫酸铵、硫酸钠、氯化钠硫酸铵、硫酸钠、氯化钠 对不同的蛋白质进行盐析时，需要采对不同的蛋白质进行盐析

37、时，需要采用不同的盐浓度和不同的用不同的盐浓度和不同的pHpH有机溶剂沉淀法：酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的水化膜使蛋白质沉淀，在等电点时沉淀的效果更好。为防止蛋白质的变性，常需在低温条件下快速进行（二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法离心(centrifugation)利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质分离开的方法。蛋白质溶液在高速离心时，由于离心力的作用，蛋白质会下沉，这就是蛋白质的沉降现象。蛋白质分子在单位力场的沉降速度称沉降系数（S）。通常情况下，分子愈大，沉降愈快，沉降系数愈高。2.透析与超滤应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定

38、截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。的目的。n透析透析(dialysis)n超滤法（超滤法（ultrafiltration）利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法物分开的方法。透析法分离蛋白质和脱盐 超滤膜针头过滤器3.3.凝胶过滤层析凝胶过滤层析 凝胶过滤凝胶过滤(gel-filtration chromatography)(gel-filtration chromatography)是是按照天然蛋白质相对分子量大小进行分离的技术，又按照天然蛋白质相对分子量大小进行分离的技术，又称为分子筛层析或排

39、阻层析。称为分子筛层析或排阻层析。凝胶过滤分离蛋白质(三三)根据蛋白质电荷性质的分离方法根据蛋白质电荷性质的分离方法 离子交换层析离子交换层析(ion exchange chromatography)(ion exchange chromatography)利用蛋白质两性解离特性和等电点作为分利用蛋白质两性解离特性和等电点作为分离依据的方法。离依据的方法。填充料：带电荷的交联葡聚糖、纤维素或树脂填充料：带电荷的交联葡聚糖、纤维素或树脂2.2.电泳电泳(electrophoresis)(electrophoresis)蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pIpI的溶液中为带电的颗的溶液中为带

40、电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为称为电泳电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。泳等。琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶3.3.等电聚焦等电聚焦 (isoelectric focusing electrophoresis,(isoelectric focusing electrophoresis,IFE)IFE)在具有在具有pHpH梯度的电场中进行电泳，蛋

41、白质按梯度的电场中进行电泳，蛋白质按pIpI不不同予以分离同予以分离4.4.双向电泳双向电泳 (two-dimensional electrophoresis)(two-dimensional electrophoresis)利用不同蛋白质所带电荷和质量的差异，用两种利用不同蛋白质所带电荷和质量的差异，用两种方法，分两步进行的蛋白质电泳。方法，分两步进行的蛋白质电泳。三、多肽链中氨基酸序列分析三、多肽链中氨基酸序列分析1测序前的准备工作 测定蛋白质的氨基酸组成 2多肽链氨基末端与羧基末端分析 3多肽链的氨基酸序列测定和重叠组合 四、蛋白质空间结构测定四、蛋白质空间结构测定 测定晶体中的蛋白质分

42、子构象可采用经典的X线晶体衍射法和中子衍射法。溶液中的蛋白质分子构象的测定，常采用磁共振法、圆二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法等。第五节第五节 蛋白质的分类蛋白质的分类n根据蛋白质分子组成进行分类根据蛋白质分子组成进行分类:单纯蛋白质（单纯蛋白质（simple protein)simple protein)结合蛋白质结合蛋白质 =蛋白质部分蛋白质部分 +非蛋白质部分非蛋白质部分n根据蛋白质形状和空间构象进行分类根据蛋白质形状和空间构象进行分类:纤维状蛋白质（纤维状蛋白质（fibrous protein)球状蛋白质球状蛋白质(globular protein)(conjugated protein)辅辅基基