荧光免疫技术抗核抗体课件.ppt

1、荧光免疫技术荧光免疫技术抗核抗体（抗核抗体（ANA）检测）检测间接免疫荧光法（间接免疫荧光法（IIF）黄卓春黄卓春 免疫学免疫学检测方法检测方法免疫沉淀法免疫沉淀法免疫凝集法免疫凝集法酶免疫检测技术酶免疫检测技术荧光免疫技术荧光免疫技术电化学发光技术电化学发光技术共同的基础共同的基础抗原抗体抗原抗体反应反应检测方法检测方法沉淀沉淀凝集凝集显色显色荧光荧光电子发光电子发光荧光免疫技术荧光免疫技术抗原抗体反应与荧光标记技术抗原抗体反应与荧光标记技术结合，对抗原结合，对抗原 或抗体进行定性、定位或定量检测或抗体进行定性、定位或定量检测抗核抗体的检测抗核抗体的检测间接免疫荧光法间接免疫荧光法荧光免疫技

2、术荧光免疫技术间接间接荧光标记的二抗荧光标记的二抗FF直接法：直接法：荧光标记的抗体荧光标记的抗体优点：步骤少优点：步骤少缺点：每种抗体都需缺点：每种抗体都需要标记荧光，不通用要标记荧光，不通用间接法：间接法：荧光标记的二抗荧光标记的二抗优点：通用荧光二抗优点：通用荧光二抗缺点：步骤多缺点：步骤多抗核抗体的定义抗核抗体的定义 抗核抗体的检测抗核抗体的检测 抗核抗体检测策略抗核抗体检测策略 抗核抗体的临床意义抗核抗体的临床意义 讨论要求讨论要求ANA（antinulear antibody）定义）定义传统定义：传统定义：是指是指抗细胞核抗原抗细胞核抗原成分的自身抗体成分的自身抗体 狭义定义狭义定

3、义现代定义：现代定义：是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体 对对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指的理解已不再局限于核成分，而是指一类一类抗核酸和核蛋白等细胞成分抗体抗核酸和核蛋白等细胞成分抗体的总称的总称 广义定义广义定义抗核抗体的定义抗核抗体的定义 ANA细胞靶抗原成份模式图细胞靶抗原成份模式图真核细胞真核细胞高尔基体高尔基体分泌颗粒分泌颗粒粗面内质网粗面内质网核仁核仁核粒子核粒子糖原颗粒糖原颗粒溶酶体溶酶体细胞骨架蛋白细胞骨架蛋白细胞膜细胞膜线粒体线粒体滑面内质网滑面内质网中心粒中心粒推荐采用以推荐采用以HEp-2细胞细胞（Human Epitheli

4、al Cells,人人喉癌上皮细胞株）为底物的喉癌上皮细胞株）为底物的间接免疫荧光法间接免疫荧光法(Indirect ImmunoFluorescence assays,IIF)优点：优点：HEp-2细胞形态大，细胞抗原种类齐全，细胞形态大，细胞抗原种类齐全，分裂期成份（如着丝点、纺缍体、中心粒）分裂期成份（如着丝点、纺缍体、中心粒）等丰富等丰富（抗原齐全）（抗原齐全）IIF法可直接观察针对细胞成份的抗体法可直接观察针对细胞成份的抗体（形（形态直观）态直观）抗核抗体的检测抗核抗体的检测 试剂与器材试剂与器材 ANA检测试剂盒检测试剂盒包被组织切片的生物薄片（包被组织切片的生物薄片（Hep2细胞

5、细胞、猴肝片）、猴肝片）PH7.2 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液/吐吐温温20标记标记FITC羊抗人二抗羊抗人二抗阴性、阳性质控阴性、阳性质控石蜡石蜡（封片介质，（封片介质，PH8.4）加样枪，试管，加样枪，试管，洗片槽，荧光显微镜洗片槽，荧光显微镜 荧光显微镜荧光显微镜观察观察 HEp-2细胞（底物片试剂盒）细胞（底物片试剂盒）加入标本加入标本反应反应 加入荧光二抗加入荧光二抗反应反应 洗去洗去未反应血清蛋白未反应血清蛋白 FFFFF 洗去洗去多余荧光二抗多余荧光二抗 自身抗体自身抗体非特异非特异蛋白蛋白ANA检测原理和步骤检测原理和步骤检测过程检测过程:2 步步反应反应 +2步步洗涤洗涤+1步

6、步观察观察包被组织切片的生物薄片包被组织切片的生物薄片加样板加样板加加25ul25ul待测样本后盖板待测样本后盖板,避免产生气泡避免产生气泡洗涤（先洗涤（先冲洗冲洗后浸泡）后浸泡）PBS-Tween20擦干生物擦干生物薄片薄片四周四周洗液洗液待测血清稀释待测血清稀释100倍倍20ul血清血清+2mlPBS稀释液稀释液室温温育室温温育3030分钟分钟浸洗至少浸洗至少5 5分钟分钟操作步骤操作步骤生物薄片生物薄片编号编号，如，如1,2,3实验报告实验报告注明所加样本号注明所加样本号(如如1-1,5051；1-2,5047)阴阳质控阴阳质控不稀释不稀释加样板上加入加样板上加入FITC标记标记20ul

7、二抗后，盖板二抗后，盖板室温温育室温温育3030分钟分钟 洗涤（先洗涤（先冲洗冲洗后浸泡）后浸泡）PBS-Tween20浸洗至少浸洗至少5 5分钟分钟擦干擦干薄片四周薄片四周洗液洗液石蜡石蜡(一小滴一小滴)封片封片(勿用力挤压勿用力挤压)荧光显微镜下观察结果荧光显微镜下观察结果操作步骤操作步骤封片不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。封片不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。注意事项注意事项（1）试剂不经复温直接使用会降低反应温度，底物片凝集水珠会影响反应效果，使用前要复温。（2）标本稀释应准确，样本浓度过高或过低会造

8、成假阳性或假阴性结果。（3）FITC标记的荧光二抗使用前需混匀。（4）反应时间应严格控制，延长或缩短反应时间将影响反应效果。（5）洗涤步骤是影响检测结果最关键的一步，洗涤不充分将会增加非特异染色，从而影响观察效果。注意事项注意事项（6）洗涤时先冲洗后浸泡，注意水流不要太急，不要直接对着基质冲。（7）擦板要小心，要分清正反面,擦拭抗原板四周的液体要求小心，不能碰到抗原板上包被地组织切片。（8）盖片的时候，要将薄片上的凹孔对准加样板左边的小突起，然后轻轻放下，见液滴完全浸泡住组织切片。（9）封片时候将盖玻片放于加样板上，于相应的数字位置轻轻点滴甘油，甘油的量不易过多，挤出后在其成滴落下前在玻片上点

9、滴。（10）荧光染色后应尽可能及时观察，不能及时观察应4避光保存，以减少荧光淬灭。细胞核细胞核 细胞浆细胞浆 细胞骨架细胞骨架 细胞周期细胞周期 IIF法检测法检测ANA荧光染色模型荧光染色模型 均质型均质型 核糖体型核糖体型 肌动蛋白型肌动蛋白型 中心粒型中心粒型 颗粒型颗粒型 线粒体型线粒体型 波形蛋白型波形蛋白型 纺缍体型纺缍体型 核仁型核仁型 高尔基体型高尔基体型 细胞角蛋白型细胞角蛋白型 PCNA型型 着丝点型着丝点型 溶酶体型溶酶体型 原肌球蛋白型原肌球蛋白型 分离带型分离带型 周边型周边型 胞浆颗粒型胞浆颗粒型 纽带蛋白型纽带蛋白型 核点型核点型占占80%以上以上注：核颗粒型又称

10、核斑点型注：核颗粒型又称核斑点型ANA荧光染色模型实例荧光染色模型实例特点：特点：分裂间期：核质均匀染色分裂间期：核质均匀染色 分裂期：浓缩染色分裂期：浓缩染色均质型均质型特点：特点：分裂间期：核质呈颗粒荧光（藕孔状）分裂间期：核质呈颗粒荧光（藕孔状）分裂期：染色体部位无荧光（分裂期：染色体部位无荧光（0型）型）斑点型斑点型相关疾病：相关疾病：SLE、药物狼疮等、药物狼疮等相关疾病：相关疾病：SLE、MCTD、SS等等特点：特点：分裂间期：核质均匀染色分裂间期：核质均匀染色 分裂期：染色体无荧光（分裂期：染色体无荧光（0型）型）相关疾病：相关疾病：硬皮病硬皮病、皮肌炎等皮肌炎等核仁型核仁型特点

11、：特点：分裂间期：核周边荧光环增强分裂间期：核周边荧光环增强 分裂期：染色体无荧光（分裂期：染色体无荧光（0型）型）周边型（核膜型）周边型（核膜型）相关疾病：相关疾病：自身免疫性肝病自身免疫性肝病特点：特点：细胞核部位分布大小较为细胞核部位分布大小较为均匀的均匀的10个左右点状颗粒个左右点状颗粒核点型核点型相关疾病：相关疾病：自免自免肝病、系统性硬化肝病、系统性硬化特点：特点：分裂期大小数目大致相同的点状荧分裂期大小数目大致相同的点状荧光光着丝点型着丝点型相关疾病：相关疾病：局限性硬皮病局限性硬皮病特点：特点：胞浆颗粒细且均匀，核仁胞浆颗粒细且均匀，核仁有染，疑为核糖体抗体有染，疑为核糖体抗体

12、胞浆细颗粒型胞浆细颗粒型特点：特点：胞浆颗粒粗且不均匀，核仁无染，胞浆颗粒粗且不均匀，核仁无染，疑为线粒体抗体疑为线粒体抗体(M1M10)胞浆粗颗粒型胞浆粗颗粒型相关疾病：相关疾病：SLE相关疾病：相关疾病：原发性胆汁性肝硬化原发性胆汁性肝硬化特点：特点：细胞核旁不规则帽状染色细胞核旁不规则帽状染色高尔基体型高尔基体型特点：特点：胞浆内油珠状染色胞浆内油珠状染色溶酶体型溶酶体型相关疾病：相关疾病：SLE、SS相关疾病：相关疾病：不明，中国人极罕见不明，中国人极罕见特点：特点：分裂期细胞中荧光点位于分裂期细胞中荧光点位于细胞纵向对称的两极细胞纵向对称的两极中心粒型中心粒型特点：特点：细胞分裂期对

13、称纺缍型染色细胞分裂期对称纺缍型染色纺缍体型纺缍体型相关疾病：相关疾病：不清不清相关疾病：相关疾病：不清不清抗抗rings and rods(RR)抗体抗体特点：特点：分裂期、分裂间期细分裂期、分裂间期细胞胞质内、细胞核旁胞胞质内、细胞核旁可见圆形或棒状荧光，可见圆形或棒状荧光，细胞核阴性细胞核阴性相关疾病：相关疾病：丙肝，尤其是干丙肝，尤其是干扰素或者利巴韦林治扰素或者利巴韦林治疗后疗后根据产生的荧光模型、靶抗原的分布部位分类如下：根据产生的荧光模型、靶抗原的分布部位分类如下：ANA核均质型：核均质型：DNA、组蛋白和核小体等组蛋白和核小体等周边型：周边型：板层素、板层素、gp210等等斑点

14、型斑点型核仁型核仁型：Scl-70、RNA多聚酶和原纤维蛋白等多聚酶和原纤维蛋白等核点型核点型：着丝点、核点等着丝点、核点等胞浆颗粒型胞浆颗粒型：线粒体、：线粒体、Jo-1、核糖体等核糖体等胞浆纤维型：胞浆纤维型：波形蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白等波形蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白等核糖核蛋白：核糖核蛋白：Sm、RNP、SS-A、SS-B细胞核细胞核细胞浆细胞浆Ku细胞周期蛋白：细胞周期蛋白：I型（型（PCNA）和和II型型分裂期细胞阳性分裂期细胞阳性 纺锤体、分离带、中心粒等纺锤体、分离带、中心粒等SLE活动期SLE非活动期药物性狼疮 混合性结缔组织病（MCTD）类风湿性关节炎进行性系统性硬化症多

15、发性肌炎及皮肌炎干燥综合征慢性活动性肝炎溃疡性结肠炎其它风湿病正常人 95100%80100%100%100%2040%2050%8595%3050%7080%3040%26%5-10%ANAANA特异性较差，但特异性较差，但阴性可基本排除阴性可基本排除SLESLE和和MCTDMCTD抗核抗体的临床意义抗核抗体的临床意义 间接免疫荧光法间接免疫荧光法（筛查性试验）（筛查性试验）阳性：抗体明确阳性：抗体明确如如:着丝点、高尔基体型着丝点、高尔基体型确认实验确认实验阳性：抗体不明确阳性：抗体不明确如斑点型如斑点型结果结果如如:抗抗Sm抗体抗体纯化抗原的特异性确诊试验纯化抗原的特异性确诊试验如如ENA、ELISA等等阴性可基本阴性可基本排除排除SLE和和MCTD诊断诊断抗核抗体检测策略抗核抗体检测策略 标明实验所加标本号（如1-1，5051）及所看到的型别针对实验过程讨论针对该方法检测的优缺点讨论提出疑问或自己的其他观点讨论讨论要求要求Thank you!