细胞生物学试验-课件.ppt

1、小鼠的脱臼处死法小鼠的脱臼处死法 用途：用途：观察活细胞和未经染色的玻片标本观察活细胞和未经染色的玻片标本荧光显微镜照片（微管呈绿色、荧光显微镜照片（微管呈绿色、DNADNA蓝色）蓝色）细胞内应力纤维细胞内应力纤维综合性实验综合性实验外周血培养及核型分析外周血培养及核型分析 细胞培养技术是目前生命科学研究领域的细胞培养技术是目前生命科学研究领域的一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。显微摄影技术、图像分析技术等。MoorheadMoorhead

2、和和LevanLevan等等(1960)(1960)建立的人体外建立的人体外周血淋巴细胞培养技术，以及周血淋巴细胞培养技术，以及RothrelsRothrels等等(1958)(1958)建立的气干法制片技术，成了研究人与建立的气干法制片技术，成了研究人与哺乳类染色体的最主要技术。哺乳类染色体的最主要技术。一、实验目的和要求一、实验目的和要求1 1、掌握无菌操作的原理和方法；掌握无菌操作的原理和方法；2 2、掌握外周血培养的原理和方法；掌握外周血培养的原理和方法；3 3、掌握显微摄影和图象分析的原理和方法；掌握显微摄影和图象分析的原理和方法；4 4、掌握外周血淋巴细胞染色体制备的技术掌握外周血

3、淋巴细胞染色体制备的技术;5 5、综合运用已掌握的知识基础和已具备的综合运用已掌握的知识基础和已具备的 实验能力，提高科学研究的综合素质。实验能力，提高科学研究的综合素质。二、实验原理二、实验原理 细胞培养是一种程序复杂而又要求十细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；有关的生长因子；氧气及适宜的温度

4、；注意调节其外环境的酸碱度（注意调节其外环境的酸碱度（pHpH）与渗）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。持在无菌条件下进行。外周血淋巴细胞是不能增殖的分化外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素培养基中植物凝集素(PHA)(PHA)则可刺激处于则可刺激处于G G。期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重。期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞

5、，重新有丝分裂的能力，经一段时间的培养新有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素析。秋水仙素(或秋水酰胺或秋水酰胺)可通过干扰可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形状而利于辨认。形状而利于辨认。染色体标本制备过程中

6、有两个重要环节，染色体标本制备过程中有两个重要环节，原理如下：原理如下：(1)(1)低渗处理：低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细固定质量及标本质量。细固定质量及标本质量。(2)(2)固定：固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接目的在于尽快使细胞的

7、结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3(3：1)1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。三、实验用品三、实验用品(1)(1)器材：冰箱、恒温培养箱、恒温水浴锅、器材：冰箱、恒温培养箱、恒温水

8、浴锅、离心机、超净工作台、无菌培养瓶、离心机、超净工作台、无菌培养瓶、10ml10ml离离心管、显微摄影装置。心管、显微摄影装置。（2 2）试剂：）试剂：RPMI 1640RPMI 1640或或Eagles MEMEagles MEM培养液、培养液、小牛血清小牛血清(FCS)(FCS)、PHAPHA、秋水仙素、秋水仙素、O O075M 075M KClKCl、甲醇、冰醋酸；肝素、甲醇、冰醋酸；肝素、GiemsaGiemsa、pH6pH68 8的的PBSPBS。（3 3）材料：动物外周血）材料：动物外周血四、实验方法（实验操作要点）四、实验方法（实验操作要点）(1)(1)采血：用肝素润湿注射针筒

9、采血：用肝素润湿注射针筒(o(o2m1)2m1)后，常后，常规取静脉血约规取静脉血约1 12ml2ml，转动针筒混匀肝素。，转动针筒混匀肝素。（2)2)接种接种(在超净工作台中无菌操作在超净工作台中无菌操作)：在每个培：在每个培养瓶中养瓶中(含含2020血清的血清的16401640培养液培养液5ml5ml，pH7pH72)2)，加入全血加入全血O O2525O O30ml(730ml(7号针头号针头13131515滴滴)、PHA 5mgPHA 5mg，盖紧胶塞，轻轻摇匀后。，盖紧胶塞，轻轻摇匀后。（3)3)培养：将培养瓶放在培养：将培养瓶放在3737恒温培养箱内培养恒温培养箱内培养72 h72

10、 h。终止培养前。终止培养前2 24 h4 h，加入，加入O01O01秋水仙秋水仙素溶液素溶液(100g(100gm1)1m1)12 2滴滴(7(7号针头号针头)，使终浓，使终浓度为度为0 02g2gmlml培养液。轻轻摇匀后，放回培培养液。轻轻摇匀后，放回培养箱继续培养养箱继续培养2 24h4h。(4)(4)收获：将培养后的血细胞收集在离心管中，收获：将培养后的血细胞收集在离心管中，平衡后平衡后1 000r1 000rminmin离心离心8 min8 min，弃去上清。，弃去上清。（5)5)低渗：向离心管中加入低渗：向离心管中加入37O37O075mol075molL L KCIKCI溶液至

11、溶液至8ml8ml，用吸管轻轻吹打混匀细胞，置，用吸管轻轻吹打混匀细胞，置于于3737水浴箱温育水浴箱温育15 min15 min。（6)6)预固定：向离心管中滴加新配制的甲醇一预固定：向离心管中滴加新配制的甲醇一冰醋酸固定液冰醋酸固定液1 12 ml2 ml，用吸管轻轻吹打混匀后，用吸管轻轻吹打混匀后1000r1000rminmin离心离心8min8min，弃去上清。，弃去上清。(7)(7)固定：加入新配制的固定液至固定：加入新配制的固定液至8 ml8 ml，室温静，室温静置置30 min30 min。1 000 r1 000 rminmin离心离心8min8min，弃去上清。，弃去上清。可

12、再重复固定可再重复固定1 1次。次。（8)8)制片：根据沉淀细胞的多少，加入适制片：根据沉淀细胞的多少，加入适量新鲜固定液量新鲜固定液(O(O5 5lmllml)，轻轻吹打制成，轻轻吹打制成细胞悬液。用滴管吸取少量细胞悬液，滴细胞悬液。用滴管吸取少量细胞悬液，滴至冰冷的载玻片上，立即甩口。吹散，酒至冰冷的载玻片上，立即甩口。吹散，酒精灯火焰过一下，冷风吹干或气干。精灯火焰过一下，冷风吹干或气干。(9)(9)染色：染色：1 1：10 Giemsa10 Giemsa染液染液(pH 6(pH 68)8)染染色色101020 min20 min。流水冲洗，晾干，镜检。流水冲洗，晾干，镜检。（1010）

13、摄影分析：选好的分裂相进行显微）摄影分析：选好的分裂相进行显微摄影，并用图象分析软件进行核型分析。摄影，并用图象分析软件进行核型分析。五、实验说明（注意事项）五、实验说明（注意事项）(1)(1)无菌操作是培养成败的关键，采血时要无菌操作是培养成败的关键，采血时要注意无菌操作，试剂配置要进行无菌过滤，所注意无菌操作，试剂配置要进行无菌过滤，所用培养器械要进行灭菌处理。用培养器械要进行灭菌处理。(2)PHA(2)PHA添加很重要，如保存不善，效价低或添加很重要，如保存不善，效价低或数量不足，则作用差，但浓度过大，红细胞凝数量不足，则作用差，但浓度过大，红细胞凝块，这些都会影响细胞生长。块，这些都会

14、影响细胞生长。(3)(3)秋水仙素用量过大，染色体过度收缩，秋水仙素用量过大，染色体过度收缩，乃至染色单体离散，用量过小则影响分裂相。乃至染色单体离散，用量过小则影响分裂相。(4)(4)低渗处理极为重要，低渗不够，则染色低渗处理极为重要，低渗不够，则染色体聚在一起，分散不好。太过，则造成细胞破体聚在一起，分散不好。太过，则造成细胞破碎，染色体丢失。碎，染色体丢失。(5)(5)离心速度太高，细胞团块不易打散，速离心速度太高，细胞团块不易打散，速度太低，则会丢失细胞。度太低，则会丢失细胞。(6)(6)细胞太多或太少亦能影响分裂相的多少，细胞太多或太少亦能影响分裂相的多少，及标本质量。及标本质量。（

15、7 7）机械打散细胞团时，用力要适度，若）机械打散细胞团时，用力要适度，若用力过猛，细胞易破碎，染色体不完整。用力过猛，细胞易破碎，染色体不完整。(（8)8)固定液纯度要高，临用时新鲜配制，固定液纯度要高，临用时新鲜配制，应沿管壁慢慢加入后打匀，如果固定液加入应沿管壁慢慢加入后打匀，如果固定液加入太快，会使固定作用过强，染色体扭转；固太快，会使固定作用过强，染色体扭转；固定液作用不足，染色体出现毛刷状。定液作用不足，染色体出现毛刷状。（9 9）实验结果要求交一张清晰的显微照片）实验结果要求交一张清晰的显微照片和用相关软件分析的核型图。和用相关软件分析的核型图。六、作业和思考六、作业和思考1 1、如何有效地做好无菌操作？、如何有效地做好无菌操作？2 2、如果分裂相很少，可能的原因是、如果分裂相很少，可能的原因是什什 么？如何改进？么？如何改进？3 3、如果染色体聚成一团或者染色体、如果染色体聚成一团或者染色体太短，原因是什么？如何改进？太短，原因是什么？如何改进？