生物化学试验课件.ppt

1、 生物化学课程是一门与生物技术相关的专业基础必修课，生物化学课程是一门与生物技术相关的专业基础必修课，本实验课程是附属于该课程的一个教学环节，开设操作性、验证本实验课程是附属于该课程的一个教学环节，开设操作性、验证性、综合性等实验项目，实验内容主要进行生物分子（蛋白质、性、综合性等实验项目，实验内容主要进行生物分子（蛋白质、核酸、糖、维生素）的定性、定量测定和分离提取制备，学习酶核酸、糖、维生素）的定性、定量测定和分离提取制备，学习酶活性和维生素的测定方法等实验，涉及了生物化学的基本实验技活性和维生素的测定方法等实验，涉及了生物化学的基本实验技术及典型仪器设备。通过实验有助于学生加深对生物化学

2、的基本术及典型仪器设备。通过实验有助于学生加深对生物化学的基本知识和基本理论的理解，掌握生物化学的主要方法与技术，包括知识和基本理论的理解，掌握生物化学的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术。经典的、常规的、以及现代的方法与技术。l实验一实验一 氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定纸层析法纸层析法(操作性操作性)4)4学时学时l实验二实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度(操作性操作性)3)3学时学时l实验三实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳(验证性验证性)5)5学时学时l实验四实验四 动物肝肝脏动物肝肝脏DNA的分离与鉴

3、定的分离与鉴定(操作性操作性)3)3学时学时l实验五实验五 血液中葡萄糖的测定血液中葡萄糖的测定(操作性操作性)3)3学时学时l实验六实验六 血清中总胆固醇的测定血清中总胆固醇的测定(操作性操作性)4)4学时学时l实验七实验七 唾液淀粉酶活性的观察唾液淀粉酶活性的观察(综合性综合性)4)4学时学时l实验八实验八 维生素维生素C的定量测定的定量测定(操作性操作性)4)4学时学时l实验九实验九 脂肪酸的脂肪酸的-氧化氧化 (操作性操作性)4 4学时学时l实验十实验十 琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶 (操作性操作性)4 4学时学时l实验十一实验十一 酪蛋白的制备酪蛋

4、白的制备 (操作性操作性)4 4学时学时l实验十二实验十二 肝脏谷丙转氨酶活力测定肝脏谷丙转氨酶活力测定 (综合性综合性)3 3学时学时【实验目的【实验目的】【实验原理【实验原理】【实验试剂与器材【实验试剂与器材】1、溶剂系统、溶剂系统 （1）碱相溶剂：）碱相溶剂：（2）酸相溶剂：）酸相溶剂：2、显色贮备液：、显色贮备液：3、V（0.1%硫酸铜）硫酸铜）:V（75%乙醇）乙醇）=2:38溶液。溶液。4、混合氨基酸溶液、混合氨基酸溶液6mg/ml。5、滤纸。、滤纸。6、烧杯、烧杯10ml（1）。）。7、剪刀。、剪刀。8、层析缸（、层析缸（2）。）。9、微量注射器、微量注射器10l（1）或毛细管。

5、）或毛细管。10、电吹风（、电吹风（1）。）。11、722型（或型（或7220型）分光光度计。型）分光光度计。【实验步骤【实验步骤】图图1 滤纸的缝合滤纸的缝合【注意事项【注意事项】实验二实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 【实验目的【实验目的】学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。【实验原理【实验原理】考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质-染料结合染料结合法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝考马斯亮蓝

6、G-250存在着两种不同样色形式，红色存在着两种不同样色形式，红色-棕棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色-棕黑色和蓝色棕黑色和蓝色形式，最大光吸收由形式，最大光吸收由465nm变成变成595nm，测定，测定595 nm吸光吸光的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。蛋白质与染料结合速度很快，蛋白质与染料结合速度很快，2min就可以反应完全，就可以反应完全，并可以稳定并可以稳定1h，蛋白质，蛋白质-染料复合物有很大的消光系数，染料复合物有很大的消光系数，使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为使得测定蛋白质浓度是灵

7、敏度很高。测定范围为10-100g蛋白质，微量测定时达到蛋白质，微量测定时达到1-10g蛋白质。此反应反复性好蛋白质。此反应反复性好精度高，线性关系好。精度高，线性关系好。【实验试剂与器材【实验试剂与器材】1、标准蛋白液（、标准蛋白液（0.1mg/ml）0.2g结晶牛血清白蛋白用结晶牛血清白蛋白用 0.9%NaCl 稀释到稀释到2000ml。2、0.9%NaCl 3、考马斯亮蓝试剂：、考马斯亮蓝试剂：100mg考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250溶于溶于50ml 5%乙醇中，加乙醇中，加100ml85%磷酸，蒸馏水稀释磷酸，蒸馏水稀释 1000ml，滤纸过滤。，滤纸过滤。4、待测蛋白：人血清，用前用、

8、待测蛋白：人血清，用前用0.9%NaCl稀释稀释200倍。倍。5、漩涡混合器、漩涡混合器 6、移液管、移液管0.5ml（2），），1.0ml（2），），5ml（1）7、分光光度计、分光光度计 8、试管、试管1.5cm15cm(8)9、量筒、量筒100ml(1)10、电子分析天平、电子分析天平 11、试管架、试管架(1)【实验步骤【实验步骤】一、标准曲线线的绘制一、标准曲线线的绘制 取取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。以支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。以A595为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准曲线。曲线。试管号试管号试剂试剂1

9、234561mg/ml标准标准蛋白液蛋白液/ml 0.10.20.30.40.50.60.15mol/L NaCl/ml 10.90.80.70.60.4考马斯亮蓝考马斯亮蓝染液染液/ml 4.04.04.04.04.04.0摇匀，摇匀，1小时内以小时内以1号管为空白对照，在号管为空白对照，在595nm处比色处比色 A595nm二、未知样液的测定二、未知样液的测定 另取一干净试管，加入样品另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝染液及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置，混匀，室温静置3min，于波长，于波长595nm处比色，读处比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。取吸光度

10、。在标准曲线上查找蛋白质浓度。【注意事项【注意事项】1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入5-20min内内测测 定吸光度，在这段时间内样色很稳定。定吸光度，在这段时间内样色很稳定。2、测定中，蛋白质、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿上，实验染料复合物会吸附在比色皿上，实验 证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。【思考题【思考题】1、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白 质浓度。质浓度。（1）样品不容易溶解，但要求结果很准确。）样品不容易溶解，但要

11、求结果很准确。（2）要求在半天内测定）要求在半天内测定60个样品。个样品。（3）要求很迅速的测定一系列试管（）要求很迅速的测定一系列试管（30只）中溶液的蛋只）中溶液的蛋 白质浓度白质浓度2、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。实验三实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 【实验目的【实验目的】掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作过程。掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作过程。【实验原理【实验原理】血清中各种蛋白质的等电点不同，在血清中各种蛋白质的等电点不同，在pH8.6的巴比的巴比妥缓冲液中，各种蛋白质所带的净电荷量不相等，加上妥缓冲液

12、中，各种蛋白质所带的净电荷量不相等，加上蛋白质分子大小不相同，在电场中移动的速度就不等，蛋白质分子大小不相同，在电场中移动的速度就不等，例如，白蛋白等电点比其他蛋白质低，在例如，白蛋白等电点比其他蛋白质低，在pH8.6时带的时带的负电荷比其他蛋白质多，加上白蛋白的分子较小，因此负电荷比其他蛋白质多，加上白蛋白的分子较小，因此在电场中比其他蛋白质移动速度快。这样，血清蛋白质在电场中比其他蛋白质移动速度快。这样，血清蛋白质在醋酸纤维素薄膜上就可以形成区带，用以分离和分析在醋酸纤维素薄膜上就可以形成区带，用以分离和分析蛋白质。蛋白质。【实验试剂与器材【实验试剂与器材】（一）仪器（一）仪器1、电泳仪；

13、、电泳仪；2、电泳槽；、电泳槽；3、恒温水浴箱；、恒温水浴箱；4、721型分光光度计型分光光度计（二）材料（二）材料1、人血清或鸡血清、人血清或鸡血清2、醋酸纤维素薄膜、醋酸纤维素薄膜（三）试剂（三）试剂1、0.05 mol/L巴比妥钠巴比妥钠-HCL缓冲液（缓冲液（pH8.6）：取巴）：取巴比妥钠比妥钠10.3 g，加蒸馏水约，加蒸馏水约800 ml溶解后，加入溶解后，加入lmol/L HCL 9.55 ml，补加蒸馏水至，补加蒸馏水至 1000 ml，测试其，测试其 pH应应 为为 8.6。2、染色液：取氨基黑、染色液：取氨基黑 10B 1.0 g，磺基水杨酸，磺基水杨酸 10 g，加冰，

14、加冰 醋酸醋酸20ml，蒸馏水，蒸馏水 400ml，摇匀溶解。，摇匀溶解。3、漂洗液：、漂洗液：2.5醋酸醋酸4、洗脱液：、洗脱液：0.02 mol/L NaOH溶液溶液5、透明液：无水乙醇、透明液：无水乙醇7份，冰醋酸份，冰醋酸3份混合即成。份混合即成。【实验步骤【实验步骤】1薄膜准备薄膜准备2点样点样 3电泳电泳 4染色和漂洗染色和漂洗5薄膜和透明薄膜和透明 6定量定量（1）洗脱法）洗脱法 注意！白蛋白因加入注意！白蛋白因加入NaOH的量比其他管多，其光密度值的量比其他管多，其光密度值应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。+白蛋白白蛋白(A)2

15、1%100%各管光密度读数之和该种蛋白管光密度读数）百分数（每种蛋白占总蛋白量的（2）光密度计法）光密度计法（3）用本法定量，正常人数值为：）用本法定量，正常人数值为：白蛋白白蛋白 54.0%73.0%540 730 g/L1球蛋白球蛋白 2.8%5.1%28 51 g/L2球蛋白球蛋白 6.3%10.6%63 106 g/L球蛋白球蛋白 5.2%11.0%52 110 g/L球蛋白球蛋白 12.5%20.0%125 200 g/L【注意事项【注意事项】1醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用同一批号、薄膜厚度均匀、质量良好的醋酸纤维素薄膜。同

16、一批号、薄膜厚度均匀、质量良好的醋酸纤维素薄膜。2血清或其他电泳样品应新鲜。血清或其他电泳样品应新鲜。3点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样位置要合适。位置要合适。4盐桥要放置平整，保证电场均匀。盐桥要放置平整，保证电场均匀。5电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。6较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不宜过高。宜过高。7选择合适的缓冲液离子强度。选择合适的缓冲液离子强度。8两电泳槽内缓冲液面应在同一水平。两电泳槽内缓冲液面应在同一水平。9要控制好电流，电压和电泳

17、时间。要控制好电流，电压和电泳时间。10电泳槽内缓冲液可以多次使用。但操作时应尽量减电泳槽内缓冲液可以多次使用。但操作时应尽量减少缓冲液的污染、水分蒸发、少缓冲液的污染、水分蒸发、pH及离子强度的改变，及离子强度的改变，并应防止霉菌的滋长。并应防止霉菌的滋长。11染色、漂洗及洗脱时间要控制好，才能获得重复性染色、漂洗及洗脱时间要控制好，才能获得重复性良好的定量结果。良好的定量结果。【思考题【思考题】1.电泳后，泳动在最前面的为何种蛋白质？分析原因。电泳后，泳动在最前面的为何种蛋白质？分析原因。2.点样时，置于电场的正极还是负极，为什么？点样时，置于电场的正极还是负极，为什么？实验四实验四 动物

18、肝肝脏动物肝肝脏DNADNA的分离与鉴定的分离与鉴定【实验目的【实验目的】学习常用的学习常用的DNA分离方法分离方法。【实验原理【实验原理】在浓氯化钠在浓氯化钠(1-2mol/L)溶液中，脱氧核糖蛋白的溶溶液中，脱氧核糖蛋白的溶解度很大，核糖蛋白的溶解很小。在稀氯化钠解度很大，核糖蛋白的溶解很小。在稀氯化钠(0.14mol/L)溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白 从样品中分别从样品中分别

19、抽提出来。抽提出来。将抽提的核蛋白用将抽提的核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)处理，处理，DNA(或或RNA)即与蛋白质分开，可用氯仿即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白异戊醇将蛋白质沉淀除去，而质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液则溶解于溶液中。向溶液 中加入适中加入适量乙醇，量乙醇，DNA即析出。即析出。为了防止为了防止DNA(或或RNA)酶解，提取时加入酶解，提取时加入EDTA(乙二乙二胺四乙酸）。胺四乙酸）。【实验试剂与器材【实验试剂与器材】15mol/LNaCl溶液：将溶液：将292.3g NaCl溶于水，稀释至溶于水，稀释至 1000ml。2 0.14molNa

20、Cl-0.15molEDTA-Na溶液：溶液：溶溶 8.18gNaCl及及37.2gEDTANa于蒸馏水，稀释至于蒸馏水，稀释至 1000ml。325SDS溶液：溶溶液：溶25g十二烷基硫酸钠于十二烷基硫酸钠于100ml 45乙醇。乙醇。0.015mol/LNaCl-0.0015mol柠檬酸三钠溶液柠檬酸三钠溶液,氯化氯化 钠钠0.828g及柠檬酸三钠及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水溶于蒸馏水,稀释至稀释至 1,000ml。5 氯仿氯仿-异戊醇混合液异戊醇混合液:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇=24:1(V/V)。6 1.5mol/LNaCl-015mol柠檬酸三钠溶液柠檬酸三钠溶液:氯化氯化 钠钠

21、82.8g及柠檬酸三钠及柠檬酸三钠34.1g溶于蒸馏水溶于蒸馏水,稀释至稀释至 1,000ml。7 3mol/L乙酸钠乙酸钠-0.001molEDTA-Na溶液：称取溶液：称取 乙乙 酸钠酸钠408g、EDTA-Na0.372g溶于蒸馏水溶于蒸馏水,稀释至稀释至 1,000ml。8 70%乙醇、乙醇、80%乙醇、乙醇、95%乙醇、无水乙醇。乙醇、无水乙醇。9 二苯胺试剂。二苯胺试剂。10 1mol过氯酸溶液，将过氯酸溶液，将10ml过氯酸过氯酸(70%)用蒸馏用蒸馏 水稀释至水稀释至11ml。11 实验材料与仪器实验材料与仪器 大白鼠肝脏、匀浆器、离心机大白鼠肝脏、匀浆器、离心机5000r/m

22、in、量筒、量筒 50ml(1)、25ml(1)、10ml(1)、吸管、吸管 5ml(2)、水浴锅、真空干燥器。、水浴锅、真空干燥器。【实验步骤【实验步骤】1 DNA的分离纯化：的分离纯化：（1）将新鲜猪肝用）将新鲜猪肝用0.14 mol/LNaCl-0.15molEDTA溶液洗去血液，剪碎，加入溶液洗去血液，剪碎，加入50 ml0.14 mol/LNaCl-0.15molEDTA溶液溶液,置匀浆器中研磨置匀浆器中研磨.待研磨成糊状后，待研磨成糊状后，将糊状物离心将糊状物离心10min(4000r/min)，弃去上清液，沉，弃去上清液，沉 淀用淀用0.14 mol/LNaCl-0.15molE

23、DTA溶液洗二、三次。所溶液洗二、三次。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白制品。得沉淀为脱氧核糖核蛋白制品。（2）向上述沉淀物加入）向上述沉淀物加入0.14 mol/LNaCl-0.15molEDTA溶液，使总体积为溶液，使总体积为44ml，然后滴加，然后滴加25%SDS溶液溶液3ml，边加边搅拌。加毕，置，边加边搅拌。加毕，置60水浴保温水浴保温 10min(不停不停搅拌搅拌)溶液变得粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作溶液变得粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作 系使核酸与蛋白质分离。系使核酸与蛋白质分离。（3）加入）加入5molNaCl溶液溶液10ml，使，使NaCl最终浓度最终浓度达到达到1mo

24、l/L，搅拌，搅拌10min，加入约一倍体积的氯仿，加入约一倍体积的氯仿-异戊异戊醇混合液，振摇醇混合液，振摇 20min，离心，离心10min(4000r/min)。去掉。去掉沉淀，上层清夜徐徐加入沉淀，上层清夜徐徐加入152倍倍95%乙醇，乙醇，DNA沉沉淀即析出，用玻棒慢慢搅动，则淀即析出，用玻棒慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒丝状物即缠在玻棒上。上。（4）将）将DNA粗品置于粗品置于27ml0.15mol/LNaCl-0.0015mol/柠檬酸三钠溶液中，再加入柠檬酸三钠溶液中，再加入3ml1.5mol/L NaCl-0.0015mol/柠檬酸三钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿柠檬酸三

25、钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿-异戊醇混合液，振摇异戊醇混合液，振摇10min，离心，离心(4000r/min，10min)，倾出上层液倾出上层液(沉淀弃去沉淀弃去)，加入，加入1.5倍体积倍体积95%乙醇，乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀(粗粗DNA）。操作步骤）。操作步骤 重复处理一次。重复处理一次。（5）将上步得沉淀溶于）将上步得沉淀溶于27ml0.015mol/LNaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中，然后以线状徐徐加入柠檬酸三钠溶液中，然后以线状徐徐加入2倍倍95%乙醇，边加边搅，乙醇，边加边搅，取出丝状取出丝状DNA，依次用

26、，依次用70%、80%、95%及无水乙醇各洗一次，真空干燥。及无水乙醇各洗一次，真空干燥。2、鉴定：用二苯胺法测定、鉴定：用二苯胺法测定DNA 实验五实验五 血液中葡萄糖的测定血液中葡萄糖的测定 【实验目的【实验目的】（1）理解血糖在生物体内的重要意义。）理解血糖在生物体内的重要意义。（2）掌握）掌握Folin-Wu法测定血糖含量的原理和方法。法测定血糖含量的原理和方法。【实验原理【实验原理】葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量。测定血液中葡萄糖的含量，即血液中葡萄糖的含量。测定血液中葡萄糖的含量，即测复杂组分中一种物质的量

27、，根据生化实验基本技术测复杂组分中一种物质的量，根据生化实验基本技术的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定。的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定。血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。【实

28、验试剂与器材【实验试剂与器材】1、标准葡萄糖溶液、标准葡萄糖溶液（1）1%（m/V）葡萄糖母液）葡萄糖母液 称取葡萄糖称取葡萄糖1.0g，溶于蒸，溶于蒸馏水中，然后用馏水中，然后用100ml容量瓶定容至刻度。容量瓶定容至刻度。（2）标准葡萄糖溶液）标准葡萄糖溶液 用移液管吸取用移液管吸取1%葡萄糖母液葡萄糖母液1.0ml，放入，放入100ml容量瓶内，然后定容至刻度。容量瓶内，然后定容至刻度。2、碱性硫酸铜溶液（、碱性硫酸铜溶液（A、B液）液）（1）A液：称取无水碳酸钠液：称取无水碳酸钠35.0g，酒石酸钠，酒石酸钠13.0g及碳及碳酸氢钠酸氢钠11.0g，用蒸馏水溶解，然后用，用蒸馏水溶解，

29、然后用1000ml容量瓶定容量瓶定容至刻度。容至刻度。（2）B液：称取硫酸铜液：称取硫酸铜5.0g，用蒸馏水溶解，然后用，用蒸馏水溶解，然后用100ml容量瓶定容至刻度，加几滴浓硫酸作为保存剂。容量瓶定容至刻度，加几滴浓硫酸作为保存剂。碱性硫酸铜（现配现用）。碱性硫酸铜（现配现用）。取取A液液25ml，B液液5ml，混合后，再用，混合后，再用A液定容至液定容至50ml，摇匀。该混合液在，摇匀。该混合液在4冰箱里可保存数日，如果冰箱里可保存数日，如果暴露于阳光下，数小时即失效。暴露于阳光下，数小时即失效。3、酸性钼酸盐溶液、酸性钼酸盐溶液 称取钼酸钠称取钼酸钠104.6g，置烧杯中用蒸馏水溶解，

30、倒入，置烧杯中用蒸馏水溶解，倒入500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，然后移入另一容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，然后移入另一较大的试剂瓶中，加溴水较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静置数小时。，摇匀，静置数小时。置于置于1000ml容量瓶中，缓慢加入容量瓶中，缓慢加入85%（V/V）H3PO4225ml，边加边摇匀。再加入，边加边摇匀。再加入25%（V/V）硫酸）硫酸150ml，置暗处至次日，用空气将剩余的溴赶去，加入，置暗处至次日，用空气将剩余的溴赶去，加入冰乙酸冰乙酸75ml，摇匀，加蒸馏水稀释至，摇匀，加蒸馏水稀释至1000ml，贮存于，贮存于棕色瓶中。棕色瓶中。4、10（m/V

31、）钨酸钠溶液）钨酸钠溶液5、0.33mol/L硫酸溶液硫酸溶液6、动物血（家兔心脏取血）、动物血（家兔心脏取血）7、分光光度计、分光光度计8、血糖管、血糖管9、奥氏吸管、奥氏吸管10、水浴锅、水浴锅11、表面皿、表面皿【实验步骤【实验步骤】1.无蛋白血滤液的制备无蛋白血滤液的制备 先在烧杯中加先在烧杯中加0.8g左右的抗凝剂（草酸钾或草酸左右的抗凝剂（草酸钾或草酸钠），从家兔心脏取血钠），从家兔心脏取血10ml放入烧杯，振荡摇匀。放入烧杯，振荡摇匀。用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血1ml，缓缓放入，缓缓放入20ml锥形瓶中，加水锥形瓶中，加水7ml，摇匀，血液变成红

32、色透明时加，摇匀，血液变成红色透明时加10钨酸钠钨酸钠1ml，摇匀，再加，摇匀，再加 0.33mol/L 硫酸，随加随摇，硫酸，随加随摇，加完放置加完放置515min，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于0.1ml全血。全血。2.血糖的测定血糖的测定 取具取具25ml刻度的血糖管刻度的血糖管3只，编号，用奥氏吸管吸只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液取无蛋白血滤液2ml，放入第一只血糖管中，于第二只，放入第一只血糖管中，于第二只血糖管中加血糖管中加2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加标准葡萄糖溶液。第三只血糖管

33、中加2ml蒸馏水。然后各加蒸馏水。然后各加2ml新配置的碱性硫酸铜溶液，新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内煮同时置沸水浴内煮6min，取出，在流水中迅速冷却，取出，在流水中迅速冷却，各加入各加入4ml酸性钼酸盐溶液，酸性钼酸盐溶液，1min后以蒸馏水稀释至后以蒸馏水稀释至25ml，混匀，倒入比色杯，用，混匀，倒入比色杯，用722型风光光度计于型风光光度计于420440nm波长比色（先以空白管调节零点，然后波长比色（先以空白管调节零点，然后测标准管和样品管）。测标准管和样品管）。3.计算计算 按下式计算按下式计算100ml全血中所含的血糖质量全血中所含的血糖质量（mg）。）。mA1C0A00

34、.1100式中：式中：m：100ml血中所含的糖质量血中所含的糖质量 C0：标准葡萄糖溶液浓度：标准葡萄糖溶液浓度 A1：样品溶液吸光度：样品溶液吸光度 A0：标准溶液吸光度：标准溶液吸光度【注意事项【注意事项】1.欲得准确结果，所取血液的量必须准确。如果由吸欲得准确结果，所取血液的量必须准确。如果由吸 管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内壁，容量不准，所以一般放出壁，容量不准，所以一般放出1ml血液所用的时间不应血液所用的时间不应少于少于1min。2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生成沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作

35、用生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性、沉淀。如血钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性、沉淀。如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨酸沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨酸与血混合液中加入与血混合液中加入10硫酸硫酸12滴，待变为暗棕色后滴，待变为暗棕色后再滤。再滤。3.血液中除葡萄糖外，尚有其他还原性物质，所以实验血液中除葡萄糖外，尚有其他还原性物质，所以实验结果可能偏高结果可能偏高20%30%。【思考题【思考题】1移液管使用时应注意哪些问题移液管使用时应注意哪些问题?2全血中除了葡萄糖还有哪些还原性物质全血中除了葡萄糖还有哪些还原性物质?实验六实验六 血清中总胆固醇的测定

36、血清中总胆固醇的测定【实验目的【实验目的】学习血清胆固醇的检测方法学习血清胆固醇的检测方法。【实验原理【实验原理】胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用，胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用，产生紫红色物质，此物质对产生紫红色物质，此物质对550nm波长的光有最大吸波长的光有最大吸收，可用比色法定量测定。收，可用比色法定量测定。100ml样品中胆固醇含量在样品中胆固醇含量在400mg之内与吸光度呈良好线性关系。之内与吸光度呈良好线性关系。【实验试剂与器材【实验试剂与器材】1、邻苯二甲醛试剂、邻苯二甲醛试剂2、90%醋酸醋酸3、混合酸、混合酸4、标准胆固醇贮液（、标准胆固醇贮液（1mg/m

37、l）5、标准胆固醇应用液（、标准胆固醇应用液（0.1mg/ml）6、人血清、人血清7、试管、试管8、吸管、吸管9、容量瓶、容量瓶10、烧杯、烧杯11、电子分析天平、电子分析天平12、722型（或型（或7220型）分光光度计型）分光光度计【实验步骤【实验步骤】1、标准曲线的绘制、标准曲线的绘制 取清洁干燥试管取清洁干燥试管5支，编号，按表加入试剂。支，编号，按表加入试剂。加毕，混匀，静置加毕，混匀，静置10min，以，以550nm波长比色测定，以波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。管号管号试剂试剂01234标准胆固醇

38、应用液标准胆固醇应用液/ml00.10.20.30.4醋酸醋酸/ml0.40.30.20.10邻苯二甲醛试剂邻苯二甲醛试剂/ml0.20.20.20.20.2蒸馏水蒸馏水/ml0.010.010.010.010.01混合酸混合酸/ml4.04.04.04.04.0100ml样品中总胆固醇含量样品中总胆固醇含量/mg0100200300400A550nm2、样品的测定、样品的测定 取取2支清洁干燥试管，编号后，按表加入试剂。支清洁干燥试管，编号后，按表加入试剂。显色时要避免高温，采用混合酸液反应时温度不会显色时要避免高温，采用混合酸液反应时温度不会升得太高，一般在升得太高，一般在432时，颜色能

39、稳定时，颜色能稳定2h。加毕，混匀，静置加毕，混匀，静置10min，于，于550nm波长比色，以对波长比色，以对照管校正零点，对照标准曲线即知照管校正零点，对照标准曲线即知100ml样品中总胆固样品中总胆固醇含量（醇含量（mg）。）。管号管号试剂试剂对照对照样品样品醋酸醋酸/ml0.40.4血清血清/ml0.010.01邻苯二甲醛试剂邻苯二甲醛试剂/ml00.2无水乙醇无水乙醇/ml0.20混合酸混合酸/ml4.04.0【实验目的【实验目的】酶是化学本质为蛋白质的生物催化剂。其活性受酶是化学本质为蛋白质的生物催化剂。其活性受到很多因素的影响，如温度、到很多因素的影响，如温度、pH值以及抑制剂激

40、活剂值以及抑制剂激活剂等。通过本次的实验观察，同学们应该更加深刻的理等。通过本次的实验观察，同学们应该更加深刻的理解理论课上所讲的酶促反应动力学的内容。解理论课上所讲的酶促反应动力学的内容。【实验原理【实验原理】在本实验中，以稀释的唾液作为淀粉酶液。唾液内在本实验中，以稀释的唾液作为淀粉酶液。唾液内的淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精分子，的淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精分子，最终产物为麦芽糖和少量的葡萄糖。它们遇碘呈不同的最终产物为麦芽糖和少量的葡萄糖。它们遇碘呈不同的颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色；糊精按颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色；糊精按分子从大

41、到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不显颜色。红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不显颜色。淀粉在唾液淀粉酶的作用下水解：淀粉紫色糊精红色糊精麦芽糖及少量葡萄糖 遇I2分别呈现：蓝色紫色红色不显色 由于在不同温度，不同由于在不同温度，不同pH，或者在有激活剂或抑制，或者在有激活剂或抑制剂存在的条件下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被剂存在的条件下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断，从而可了解上述诸因素对酶活性的影响。

42、的颜色来判断，从而可了解上述诸因素对酶活性的影响。【实验试剂与器材【实验试剂与器材】1、试剂、试剂 0.5%淀粉溶液淀粉溶液 0.3%NaCl溶液溶液 0.3%CuSO4溶液溶液 碘液碘液 2、仪器：恒温水浴锅、仪器：恒温水浴锅【实验步骤【实验步骤】1.唾液淀粉酶的制备唾液淀粉酶的制备(1)提取：实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小口提取：实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小口（约（约5mL）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。(2)稀释：将酶提取液用水定容至稀释：将酶提取液用水定容至100mL。作为唾液淀。作为唾液淀粉酶的样品液。粉酶的样品液。（由于不同人或同一人不同时

43、间收集到的唾液淀粉酶的（由于不同人或同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是活性并不相同，稀释倍数可以是50300倍，甚至超过此倍，甚至超过此范围。）范围。）2.温度对酶活性的影响温度对酶活性的影响 取取3支试管，编号后各加入淀粉溶液支试管，编号后各加入淀粉溶液2毫升。将第毫升。将第l、2号试管放入号试管放入37恒温水浴中保温，第恒温水浴中保温，第3号试管放入冰水号试管放入冰水中冷却，中冷却，5分钟后，向第分钟后，向第l号试管中加人煮沸号试管中加人煮沸5一一15分钟分钟的稀释唾液的稀释唾液l毫升；向第毫升；向第2、3号试管加稀释唾液各号试管加稀释唾液各l毫升。毫升。摇匀，

44、摇匀，20分钟后取出分钟后取出3支试管，各加碘溶液支试管，各加碘溶液2滴，混匀，滴，混匀，比较各管溶液的颜色。判断淀粉被唾液酶水解的程度，比较各管溶液的颜色。判断淀粉被唾液酶水解的程度，并说明温度对唾液酶活性的影响。并说明温度对唾液酶活性的影响。3.抑制剂和激活剂对酶活性的影响抑制剂和激活剂对酶活性的影响 取取3支试管，编号。向第支试管，编号。向第l支试管中加入支试管中加入l%氯化钠氯化钠溶液溶液l毫升，向第毫升，向第2支试管中加入支试管中加入0.1%的硫酸铜溶液的硫酸铜溶液l毫毫升，向第升，向第3支试管中加入蒸馏水支试管中加入蒸馏水l毫升作对照。再向每支毫升作对照。再向每支试管各加入试管各加

45、入0.l%淀粉溶液淀粉溶液3毫升和稀释的唾液毫升和稀释的唾液l毫升。摇毫升。摇匀各管内容物，一齐放入匀各管内容物，一齐放入37恒温水浴中保温，恒温水浴中保温，1015分钟后取出。冷后，各滴入分钟后取出。冷后，各滴入2一一3滴碘溶液，混匀。观察滴碘溶液，混匀。观察比较比较3支试管颜色的深浅。支试管颜色的深浅。【注意事项【注意事项】沸水浴中的试管在加入碘液之前一定要在自来水下沸水浴中的试管在加入碘液之前一定要在自来水下冷却。这是因为淀粉与碘液生产的蓝色物质加热会变成冷却。这是因为淀粉与碘液生产的蓝色物质加热会变成无色，如果不冷却而直接加入碘液会使生成的蓝色物质无色，如果不冷却而直接加入碘液会使生成

46、的蓝色物质变为无色，导致得出错误的实验结果。变为无色，导致得出错误的实验结果。【思考题【思考题】1.什么是酶的最适温度？有何实践意义？什么是酶的最适温度？有何实践意义？2.什么是酶的最适什么是酶的最适pH？它是否是一个常数？它与哪些？它是否是一个常数？它与哪些因素有关？这种性质对于选择测定酶活力的条件有什么因素有关？这种性质对于选择测定酶活力的条件有什么意义？意义？3.酶反应的抑制作用有哪些类型？各根据什么划分的？酶反应的抑制作用有哪些类型？各根据什么划分的？它们各有什么特点？它们各有什么特点？【实验目的【实验目的】1.学习维生素学习维生素C定量测定法的原理和方法。定量测定法的原理和方法。2.

47、进一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技能。进一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技能。【实验原理【实验原理】维生素维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸。抗坏血酸能还时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸。抗坏血酸能还原染料原染料2，6二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，血酸。在酸性溶液中，2，6二氯酚靛酚呈红色，被还二氯酚靛酚呈红色，被还原后变为无色。原后变为无色。因此，可用因此，可用2，6二氯酚滴定样品中还原型抗坏二氯酚滴定样品中还原型抗坏血酸。当抗坏血酸全部被氧化

48、后，稍多加一些染料，血酸。当抗坏血酸全部被氧化后，稍多加一些染料，使墒定液呈谈红色，即为终点。如无其他杂质干扰，使墒定液呈谈红色，即为终点。如无其他杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所合的还原样品提取液所还原的标准染料量与样品中所合的还原型抗坏血酸量成正比。型抗坏血酸量成正比。【实验试剂与器材【实验试剂与器材】12草酸溶液：草酸草酸溶液：草酸2g，溶于，溶于100m1蒸馏水。蒸馏水。21草酸溶液：溶草酸溶液：溶1g草酸于草酸于100 ml蒸馏水。蒸馏水。3标准抗坏血酸溶液。标准抗坏血酸溶液。41HCl溶液。溶液。50.1 2,6二氯酚靛酚溶液。二氯酚靛酚溶液。6.松针、新鲜蔬菜松针

49、、新鲜蔬菜(辣椒、青菜、西红柿等辣椒、青菜、西红柿等)、新鲜水果、新鲜水果(桔子、柑子、橙、柚等桔子、柑子、橙、柚等)。7.容量瓶容量瓶8.锥形瓶锥形瓶9.微量滴定管微量滴定管10.研钵研钵11.漏斗漏斗【实验步骤【实验步骤】1不同样品用不同方法提取不同样品用不同方法提取(1)松针：水洗净，用滤纸吸去表面水分。称取松针：水洗净，用滤纸吸去表面水分。称取05g，放入研钵中，加放入研钵中，加1%HCl溶液溶液5m1一起研磨。放置片刻，一起研磨。放置片刻，将提取液转入将提取液转入50 m1容量瓶中。如此反复容量瓶中。如此反复23次。最后次。最后用用1ECt溶液稀释到刻度并混匀，静置溶液稀释到刻度并混

50、匀，静置10分钟，过滤，分钟，过滤，滤液备用。滤液备用。(2)新鲜蔬菜和水果类：水洗净，用纱布或吸水纸吸干新鲜蔬菜和水果类：水洗净，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取表面水分。然后称取200g，加，加2草酸草酸100m1置组织搅置组织搅碎机中打成浆状。称取浆状物碎机中打成浆状。称取浆状物50g，倒入，倒入50 m1容量瓶容量瓶中以中以2草酸溶液稀释至刻废。静置草酸溶液稀释至刻废。静置10分钟，过滤分钟，过滤(最初最初数数m L滤液弃去滤液弃去)。滤液备用。滤液备用。2滴定滴定(1)标准液滴定：准确吸取标准抗坏血酸溶液标准液滴定：准确吸取标准抗坏血酸溶液10ml(含含01mg抗坏血酸抗坏血酸)