第九章色谱分离技术课件.ppt

1、第九章第九章 色谱分离技术色谱分离技术色谱法已广泛应用于各个领域，成为多组分混色谱法已广泛应用于各个领域，成为多组分混合物的最重要的分离分析方法合物的最重要的分离分析方法 1906年，俄国植物学家Tsweet将CaCO3固体粉末装入竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因此，Tsweet把这种方法称为色谱法。v如今，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。所以色谱法已经失去原来的含义。但是，现在仍沿用色谱法这个名称。v色谱法具有分离及分析两种功能。它是分析混合物最有力的手段。v色谱分离是目前应用最广泛的分离方法

2、。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种分离分析课题。什么是色谱法？什么是色谱法？色谱法是一种分离、分析方法，有时又称为层析技术。它利用被分离的诸物质在互不相溶互不相溶的两相中分配系数等的微小差异进行分离。当两相作相对移动相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配反复多次分配，使原来微小的差异累加产生了很大的效果，形成差速迁移差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。两种组分的理化性质原本存在着微小的差异，经过反复多次地吸附解吸再吸附再解吸的过程使微小差异累积

3、起来，结果使吸附能力弱的组分先流出色谱柱，吸附能力强的组分后流出色谱柱，从而使各个组分得到了分离。吸附吸附解吸解吸再吸附再吸附再解吸再解吸色谱过程色谱过程对复杂混合物各组分进行对复杂混合物各组分进行定量和定性分析定量和定性分析色谱法的特点色谱法的特点1分离效率高：分离效率高：可在很短的时间内分离多达二、三百个组 分的复杂物质，柱效能可达106的理论板。2检测能力强：检测能力强：可以检测出10-1110-15克级的痕量组分，能 满足环境检测、农药残留等大量日常检测 分析的需要。3样品用量少：样品用量少：样品用量一般为微升级，少的可达纳克级。4适用范围广：适用范围广：几乎所有与化学有关的领域都有其

4、用武之 地。色谱分类色谱分类气 固 色 谱气 相 色 谱气 液 色 谱液 固 色 谱液 相 色 谱液 液 色 谱超 临 界 流 体 色 谱毛 细 管 电 泳流动相与固定相流动相与固定相聚集态聚集态色谱分类色谱分类v根据固定相的形状：纸色谱、薄层色谱和柱 色谱。v根据分离操作方式：间歇色谱、连续色谱检测器检测器v色谱检测器是一个将组分浓度和量信息转化为电信号的传感器，信号的大小和组分的浓度或量成正比。v现用的液相色谱的检测器分为两种：普通检测器：它是测定流动相加人溶质后的某种物理性质的变化；溶质性质或选择性检测器：它只对溶质的某些性质是灵敏的。液相色谱的主要检测器有紫外检测器、示差折光检测器和蒸

5、发散射光检测器等。检测器检测下限/(g/ml)线性范围选择性梯度淋洗主要特点UV-Vis10-10103104有有可可对流速和温度变化敏感；池对流速和温度变化敏感；池体积可制作得很小；对溶质体积可制作得很小；对溶质的响应变化大。的响应变化大。荧光荧光10-1210-11103有有可可选择性和灵敏度高；易受背选择性和灵敏度高；易受背景荧光、消光、温度、景荧光、消光、温度、pH和和溶剂的影响溶剂的影响电化学电化学10-10103有有困难困难选择性高；易受流动相选择性高；易受流动相pH值值和杂质的影响；稳定性较差。和杂质的影响；稳定性较差。蒸发光散射蒸发光散射10-9无无可可可检测所有物质。可检测所

6、有物质。示差折光示差折光10-1104无无不可不可可检测所有物质；不适合微可检测所有物质；不适合微量分析；对温度变化敏感。量分析；对温度变化敏感。质谱质谱10-10无无可可主要用于定性和半定量。主要用于定性和半定量。气相色谱气相色谱v气相色谱法主要利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异，以气体为流动相，以液体或固体为固定相从而达到分离混合物的色谱方法。气相色谱法的特点气相色谱法的特点优点：优点：v分离效率高、应用范围宽、分析速度快、样品用量少;灵敏度高、分离和测定一次完成、自动化程度高.缺点：缺点：v不适用于高沸点（450）、有生物活性的物质的分离测定v不适用于制备.v待测样品在高温的气化室气化

7、后在惰性气体的带动下进入色谱柱，色谱柱内含有液体或固体固定相v每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立。v由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附、解吸。v结果是在载气中分配浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出色谱柱，进入检测器。甲醇和乙醇混合样色谱图甲醇和乙醇混合样色谱图高效液相色谱高效液相色谱v高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。v它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的

8、理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。高效色谱仪高效色谱仪v首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。v当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。蔬菜、水果中农药残留蔬菜、水果中农药残留的检测的检测笨和丙酮混合样的色谱图笨和丙酮混合样的色谱图液相色谱的主要特点是：v分离效率高；v选择性好，适用于多种多元组分复杂混合物的分离；v应用范围广。从无机物到有机物，从天然物质到合成产物，从

9、小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等。离子交换色谱法离子交换色谱法 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离。例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。主要色谱方法主要色谱方法v凝胶渗透色谱v亲和色谱v分子印迹色谱技术色谱理论色谱理论v研究色谱过程中分子运动的规律，探讨微观分子运动与色谱分离的内在联系。v热力学v动力学v分离条件的选择和优化吸附平衡吸附平衡v溶质吸附受众多因素影响，不同模型根据不同的假设对吸附过程

10、进行描述。平衡吸附：平衡吸附：线性函数：线性函数：非线性函数：非线性函数：色谱相关术语色谱相关术语 v试样经色谱柱获得分离，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变成电信号，由记录仪记录下信号时间曲线，称为色谱流出曲线或色谱图。YABCDEFGH1/2 h0.6 0 7 htMtRVRtRVRVM或或Y1/22信号时 间图 3-2 0 色 谱 流 出 曲 线惰 性 组 分 色谱相关术语色谱相关术语由色谱流出曲线可直接得到的相关术语：v 基线v 色谱峰v 色谱时间由色谱流出曲线可间接得到的相关术语：v 色谱体积v 相对保留值基线基线(Baseline)在色谱操作条件下，仅有流

11、动相通过检测器时，由记录仪得到的信号时间曲线。n基线漂移：基线随时间定向缓慢的变化。n基线噪声：由于各种原因引起的基线波动。不论有无组分流出，其噪声均 存在，它是一种背景信号。色谱峰色谱峰(Chromatographic peak)v流动相带着组分通过检测器时，由记录仪得到的信号时间曲线。n峰底(Peak base)：从峰的起点到峰的终点之间连线。n峰高(Peak hight)：峰的顶点至峰底的垂直距离,通常用h表示。n峰面积（Peak area）：峰与峰底之间的面积，用A表示。色谱峰区域宽度色谱峰区域宽度(Peak width)是色谱流出曲线的一个重要参数，它直接反映了分离条件的好坏。习惯上

12、有下面三种表示方法：v1）标准偏差：峰高0.607处色谱峰宽度的一半,用表示。v2）峰宽或基线宽度：通过峰两侧的拐点作切线与峰底相交的宽度，用Y表示。与标准偏差的关系为：Y=4。v3）半峰宽：峰高一半处色谱峰的宽度,用Y1/2表示。与标准偏差的关系为：Y1/2=2(2ln2)1/2。色谱时间色谱时间色谱时间主要有：v死时间（Dead time）：不被固定相吸附或溶解的惰性组分，从进样到出峰的峰顶点之间测得的时间,用tM表示。v保留时间（Retention time）：从进样到组分峰顶点之间测得的时间，用tR表示。v调整保留时间(Adjusted Retention Time)：调整保留时间指组

13、分的保留时间扣除死时间后的时间，用tR表示。tR=tR-tM色谱体积色谱体积色谱体积主要有：v死体积（Dead Volume）：死体积指色谱柱填充固定相后的空隙体积，又指在死时间内流动相流经色谱柱的体积。死体积通常用Vm表示。Vm=tMFC Fc表示流动相的体积流速（mL/min）v保留体积（Retention Volume）：保留体积指从进样开始，到检测器中样品浓度最大时，流动相流经色谱柱的体积。通常用VR表示。VR=tR FCv调整保留体积(Adjusted Retention Volume)：调整保留体积指保留体积扣除死体积后的体积。通常用VR 表示。VR=tR FC相对保留值（相对保留

14、值（Relative Retention Value）v相对保留值指某组分i与基准组分s的调整保留值之比。通常用ris表示。)()()()()()(sgigsRiRsRiRisVVVVttr塔板理论塔板理论v它把色谱柱看成一个分馏塔分馏塔是分离沸点不同的混合物的一种装置，一般有十几层塔片。在塔的底层加热，利用各组分的挥发性不同，在塔片上经过多次气液平衡，最终低沸点组分在塔顶的流出液中含量高，而高沸点组分在塔底层含量高。v塔板理论，是人为的认为在色谱柱中存在着塔片。在每个塔片高度的间隔内，样品混合物的各组分，在流动相与固定相达到分配平衡。而后各组分被流动相携带转移至另一层塔片，再达分配平衡。v经

15、多次转移平衡，各组分按分配系数大小的顺序，依次流出色谱柱（分配系数小的先出柱）。由于一根色谱柱的塔片数比精馏塔多得多（103104片），因此，只要分配系数间存在微小的差别，则可获得很好的分离。塔板理论是由Martin等人在平衡色谱理论的基础上发展起来的。他们假定：v1流动相按前进方向以脉冲式通过柱子，最小单位为一塔板体积;v2.组分在柱内两相间的分配系数是恒定的，与组分浓度及在柱内的位置无关;v3.组分在所有塔板上的两相平衡在瞬间建立;v4.流动相不能被压缩；v5.所有组分浓度以起始塔板中的浓度为基准 v由塔板理论可得到：在色谱过程中色谱峰是要展宽的，展宽的宽度平方值和理论板高H成正比。即相达

16、成“平衡”所需的距离H值越大，则色谱峰展宽也就越严重。反之，若理论板高H值越小。而就一定柱长而言，组分在两相间的“平衡”次数就越多，色谱柱的分离效率就越高，因此理论板高H值是衡量色谱柱效率的一个很好的指标。v塔板理论回答了影响色谱峰保留时间和峰宽度这二个重要问题，但它没有回答宽度也就是相应的理论板高究竟受哪些操作条件的影响。理论塔板数越大，峰形越窄，柱效越高。v塔板高度表示单位柱长下的柱效。v塔板高度越小，表明柱效越高，理论塔板数越多。二项分布正态分布N50 1952年Lapidus等对填充柱色谱过程做了较详细的研究，指出色谱过程中引起组分宽度扩张的因素主要是：v1.沿柱流动方向的纵向扩散效应

17、；v2.组分在两相间的平衡不能瞬时达成，即它在两相交换时传质速度是有限的。非平衡速率理论非平衡速率理论v这就是著名的范底姆特方程。也可把Van Deemter方程描述为：22222220.0182(1)(1)fPPgLdDkdkHdUUUkDkD/HAB UCUv与气相色谱不同，液相色谱有其特点，因而其速率理论的表述方式也有区别：ELSMMSMHHHHHH各项分别为：涡流扩散项、分子扩散项、传质阻力项（固定相、流动流动相和滞留流动相）传质速率控制理论传质速率控制理论v根据溶质从液相主体到吸附剂上吸附点的过程建立模型。v液膜传质扩散速率控制模型v吸附剂表面吸附速率控制模型v孔扩散速率控制模型凝胶

18、色谱凝胶色谱v是以各种具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据流动相中所含各种组分的分子大小不同而达到物质分离目的的一种色谱技术。v凝胶渗透色谱v凝胶过滤色谱基本原理基本原理v大分子物质在凝胶颗粒间隙中运动v小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质v结果使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。v优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不稳定的化合物、凝胶不用再生、可反复使用。v缺点：

19、分离速度较慢。分离过程分离过程v凝胶柱床总体积是各部分体积之和。v溶质分子在流动相和固定相之间的分配系数与被分离物质分子大小及凝胶颗粒内孔隙大小有关。Kd 值在01之间。v可通过实验求出Kd，进而判断溶质的行为模式。凝胶色谱介质凝胶色谱介质v理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性，能够耐受高温高压和强酸强碱，具有高化学惰性，内孔径分布范围窄，珠粒颗粒大小均一度高。v凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。v目前，常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。1.1.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶v葡聚糖凝胶是应用最广泛的一类凝胶，国外商品名为Sephadex。v它由葡聚糖Dextran交联而得。

20、交联剂在原料总质量中所占的百分数叫交联度。交联度越大，网状结构越紧密，吸水量越小，吸水量越小，吸水后体积膨胀越少；反之，交联度越小，网状结构越疏松，吸收量越多，吸水后体积膨胀越大。2.2.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶v琼脂糖凝胶来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶，不是共价交联，是以氢键交联的。v它与葡聚糖不同，孔隙度是以改变琼脂糖浓度而达到的。v琼脂糖凝胶的化学稳定性不如葡聚糖凝胶。用琼脂糖凝胶进行分离操作的适宜工作条件是在pH为4.59，温度040。琼脂糖凝胶对硼酸盐有吸附作用，不能用硼酸缓冲液。3.聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶v是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由亚甲基双丙烯酰胺交联成的

21、。v其稳定性比葡聚糖凝胶好。洗脱时不会有凝胶物质被洗脱下来。在pH211范围稳定。缺点是不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团。4.疏水性凝胶疏水性凝胶v常用的疏水凝胶为聚甲基丙烯酸酯凝胶或以二乙烯苯为交联剂的聚苯乙烯(如Styrogel Bio-Beads-S)凝胶。“Styrogel”商品有11种型号，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40 000 000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好。凝胶过滤介质的选择凝胶过滤介质的选择v1.分离范围v2.分辨率v3.稳定性操作方法操作方法1.凝胶的预处理v市售凝胶必须经过充

22、分溶涨后才能使用，如果溶涨不充分，则装柱后凝胶继续溶涨，造成填充层不均匀，影响分离效果。在烧杯中将干燥凝胶加水或缓冲液，搅拌、静置、倾去上层混悬液、除去过细的粒子。如此反复多次，直至上层澄清为止。2.层析柱的选择v层析柱的体积和高径比与层析分离效果的关系相当密切。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞。3.凝胶柱的装填v空柱中应留1/5的水或溶剂。所用凝胶必须是经过充分溶涨的。开始进胶后应当打开柱端阀门并保持一定流速，太快的流速往往造成凝胶板结，对分离不利。进

23、胶过程必须连续、均匀，不要中断，并在不断搅拌下使胶均匀沉降。为此，层析柱要始终保持垂直。凝胶悬液浓度也需控制，过稀和过浓都会产生不利影响。4.样品处理和加样v分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30。分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。v加样时尽量减少样品的稀释及凝胶床面的搅动。5.洗脱与收集v为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下降，整个洗脱过程中始终保持一定的操作压，并不超限是很必要的。流速不宜太快且要稳定。洗脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗粒的胀缩引起柱

24、床体积变化或流速改变。凝胶色谱的应用凝胶色谱的应用v脱盐 去除小分子物质v相对分子质量测定 一定范围内，蛋白质的分配系数与相对分子质量的对数呈线性关系。v分离纯化v浓缩离子交换色谱离子交换色谱v是通过带电的溶质分子与离子交换介质中可交换的离子进行交换而达到分离纯化目的的方法。v该方法分辨率高、容量大、容易操作。基本原理基本原理v带电物质因电荷力作用而在固定相与流动相之间分配得以相互分离。v蛋白质是两性电解质。当 pH pI时，蛋白质带净负电荷。v由于各种蛋白质等生物大分子的等电点不同，可以通过改变溶液的pH和离子强度来影响它们与离子交换树脂的吸附作用，从而将它们相互分离开来。离子交换的基本过程

25、v(1)初始稳定状态v(2)离子交换过程v(3)洗脱过程v(4)介质的再生过程abcde离子交换的基本过程离子交换的基本过程离子交换介质离子交换介质v根据介质材料多糖、树脂、Mono Beads系。v按活性基团分类v1)阳离子交换树脂 活性基团为酸性，对阳离子具有交换能力。2)阴离子交换树脂 活性基团为碱性，对阴离子具有交换能力。离子交换吸附和解吸条件离子交换吸附和解吸条件v树脂选择vpH值v离子强度离子交换树脂的再生离子交换树脂的再生v树脂去杂v酸碱处理v转型v毒化指树脂失去交换性能且难以恢复的现象。正相色谱与反向色谱正相色谱与反向色谱v如果采用极性固定相和相对非极性流动相，就称为正相；如果

26、采用相对非极性固定相和极性流动相，则称为反相。v极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相液-液色谱系统一般可用于分离极性化合物。相反，反相液-液色谱系统一般可用于分离非极性或弱极性化合物。v正相色谱的流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出；反相色谱的流出顺序正好相反。正相色谱的特点正相色谱的特点反向色谱的特点反向色谱的特点介质介质v正相色谱常采用氰基柱、氨基柱、硅胶柱和二醇基柱。v反向色谱介质的代表为具非极性分子层的硅胶体系。流动相的选择流动相的选择v极性v回收利用v不干扰检测v洗脱方式应用应用正相色谱：v提纯紫杉醇v手性拆分反向色谱：v乳制品有机酸分析v植物油中维生素分析v分离黄酮类物

27、质疏水色谱疏水色谱v利用蛋白质上的疏水基团或区域在一个疏水作用体系中，与介质上的疏水基团作用，达到吸附平衡，然后在一定条件下，解吸达到分离目的。v其原因是蛋白质和配基疏水基团周围水分子的重排和置换。v利用样品中各组份与色谱填料上配基相互作用力的差异,在洗脱时由于各组份移动速度的不同而达到分离的目的.配基通常是一些疏水性基团,如丁基、苯基等.v蛋白质表面多由亲水性基团组成,也有一些由疏水性较强的氨基酸组成的疏水性区域.不同种类蛋白质的表面疏水性区域多少不同,疏水性强弱也不同;对于同一种蛋白质在不同介质中,其疏水性区域伸缩程度也不同,从而使疏水性基团暴露的程度呈现出一定的差异。v疏水相互作用色谱法

28、正是利用盐-水体系中样品组份的疏水性基团和色谱填料的疏水性配基相互作用力的不同而使样品组份得以分离的.介质制备介质制备v以琼脂糖和硅胶等为主体，引入丁基和苯基等疏水配基。v配基碳数越多，疏水作用力越大，吸附容量也越大，但解析越难。丁基丁基苯基苯基辛基辛基影响因素影响因素v配基种类和密度v盐种类和浓度的影响 有些盐(如Na2SO4,(NH4)2SO4等)可以提高蛋白质的稳定性,使其溶解度下降,对蛋白质有盐析效应,使蛋白质与固定相的疏水作用增强;有些盐(如MgCl2)虽然能增加溶剂表面张力,但同时也增加蛋白质的溶解度,并不能增强蛋白质与色谱填料的相互作用.盐的种类不同,不仅影响着蛋白质在色谱柱上的

29、保留行为,同时也影响着蛋白质分离纯化的效果.v平衡液及样品中的高盐浓度能促进蛋白质与配基的相互作用，在一定盐浓度范围之内,蛋白质的吸附量与盐浓度成线性关系。v被吸附的蛋白质可以通过降低盐浓度而被洗脱下来。盐浓度越高，吸附容量越盐浓度越高，吸附容量越大；大；盐析效果越显著，影响越盐析效果越显著，影响越大大vpH 对疏水色谱的影响 pH 的改变必然改变蛋白质的电荷性质及电荷量，从而影响蛋白质与色谱填料间的静电相互作用，也影响蛋白质在色谱柱上的保留行为。由于每一种蛋白质在某一特定pH 条件下，其空间构象、所带电荷情况不一致，因此，pH 对蛋白质在色谱柱上保留行为的影响具有一定的复杂性。某些情况下影响

30、较小，有时改变pH可促进洗脱。v柱温对疏水色谱的影响 疏水相互作用是一吸热过程，增加温度可以提高蛋白质与配基间疏水相互作用力；因此，增加柱温有利于蛋白质的吸附，保留值增加；但同时温度上升易使蛋白质变性失活。v添加剂对疏水色谱的影响 在疏水色谱的洗脱液中有时要加入一些添加剂、去污剂等。它们可以通过竞争结合到疏水配基上，而使结合在柱上的蛋白质更易被洗脱下来。疏水色谱的解吸可以采取哪些方法疏水色谱的解吸可以采取哪些方法降低离子强度降低离子强度增加增加|pH pI|乙二醇乙二醇 or I-表面活性剂表面活性剂洗脱方法洗脱方法疏水色谱的应用疏水色谱的应用v疏水色谱与其它分离技术联合分离蛋白质v单独分离纯

31、化某些蛋白质v分析蛋白质构象变化v工业中的大规模分离疏水色谱应用的特点疏水色谱应用的特点1 互补工具：HIC主要用于蛋白质类分离纯化，虽然HIC不如IEC的应用广泛，但可以作为IEC的互补工具。如方法得当，HIC与IEC的分离效率相当。2 与盐析衔接：由于在高浓度盐溶液中疏水性较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液。3 可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小，因此可根据目标产物的性质选择适当的吸附剂。4 疏水性吸附介质的种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。共价色谱共价色谱v共价色谱是将含有二硫键的配基固定在色谱介质上，利用蛋白质表面的硫醇基团与二硫键通过可逆的化学结合，以吸附蛋白质。v无硫醇基团的蛋白质分子通过色谱柱先流出v吸附的蛋白质解吸后得到分离v该技术主要用于含有硫醇或双硫键的蛋白质或多肽的分离纯化。介质合成介质合成v谷胱甘肽法v环氧化物法吸附和解吸吸附和解吸v在初步了解待分离物硫醇含量和介质吸附容量的基础上进行v选用较长层析柱，缓慢通过柱子v之后选用小分子硫醇物质进行洗脱v分离蛋白质和硫醇物v凝胶再生应用应用v分离半胱氨酸v分离含有半胱氨酸的多肽v分离含-SH的蛋白质或肽段