第二十二章细胞因子测定技术课件.ppt

1、第十五章第十五章 免疫细胞功能检测技术免疫细胞功能检测技术免疫细胞分类免疫细胞分类能识别特异性抗原，一旦被激活则能识别特异性抗原，一旦被激活则显示特异性应答的功能，主要指淋巴显示特异性应答的功能，主要指淋巴细胞群，包括细胞群，包括T T细胞、细胞、B B细胞、细胞、NKNK细胞、细胞、K K细胞等。细胞等。能捕获抗原，处理抗原，以一定方能捕获抗原，处理抗原，以一定方式提呈给淋巴细胞或表现其他免疫功式提呈给淋巴细胞或表现其他免疫功能，包括中性粒细胞、巨噬细胞、树能，包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。突状细胞等。一、一、T T细胞功能检测细胞功能检测二、二、B B细胞功能检测细胞功能检测三、

2、三、NKNK细胞功能检测细胞功能检测四、四、K K细胞功能检测细胞功能检测第一节第一节 淋巴细胞功能检测技术淋巴细胞功能检测技术淋巴细胞T T细胞（负责细胞免疫功能）细胞（负责细胞免疫功能）B B细胞（执行体液免疫功能）细胞（执行体液免疫功能）NKNK和和K K细胞（非特异性免疫作用）细胞（非特异性免疫作用）一、T细胞功能的检测T T细胞增殖试验细胞增殖试验T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验（一）（一）T T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染

3、色质疏松1.1.原理：原理：未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型细胞大小细胞大小(直径直径mm)12122020121216166 68 8核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4个个有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无

4、无2.2.淋巴细胞转化的刺激物淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：非特异性刺激物：PHA -TPHA -T细胞细胞 ConAConA-T-T细胞细胞 PWM-TPWM-T、B B细胞细胞 LPS -BLPS -B细胞细胞特异性刺激物：特异性刺激物：异种抗原异种抗原 同种组织抗原同种组织抗原 形态法：刺激物形态法：刺激物 淋巴细胞（淋巴细胞（4-64-6天）天）母细胞化母细胞化 同位素法：同位素法：PHA PHA 淋巴细胞（淋巴细胞（54h54h）DNADNA合成期合成期 +3 3HTdRHTdR掺入掺入 收集细胞收集细胞 检测检测射线射线 3.3.检测方法检测方法测定细胞内的测定细胞内的3H3

5、HTdRTdR（1 1）形态学检查法）形态学检查法%100胞数转化和未转化的淋巴细转化的淋巴细胞数转化率方法学评价：方法学评价：优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。（2 2）3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。均值对照孔A均值试验孔A570nm570nmSI(二二)T)T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定 体外培养的体外培养的T T细胞经各种丝裂原或抗原刺细胞经各种丝裂原或抗

6、原刺激后激后,分泌各种细胞因子分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映量、生物学活性或基因表达水平，以反映T T细胞细胞功能。功能。（三）（三）T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验靶细胞抗原靶细胞抗原T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力1.1.原理：原理：致敏致敏CTLCTL靶细胞靶细胞2.2.方法方法 形态学方法形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞 同位素法同位素法 ：淋巴细胞（CTL）+含51Cr 的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏 51Cr 释放

7、 测定射线意义：意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力 图图15-2 T15-2 T细胞细胞毒试验示意图细胞细胞毒试验示意图(四四)体内试验体内试验特异性抗原皮肤试验PHA皮肤试验 二、B细胞功能检测B细胞增殖能力的试验B细胞抗体形成功能的检测(一一)B)B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验抗抗IgMIgM细菌脂多糖细菌脂多糖SACSAC的的SPASPAB B细胞增殖细胞增殖形态学形态学3 3H HTdRTdR掺入法掺入法(二二)溶血空斑试验溶血空斑试验1.1.原理：原理：经典溶血空斑形成试验经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验被动溶血空斑试验 2.2.方法学：方法学：3 3临床应用与评价临

8、床应用与评价溶血空斑试验主要用于测定药物和溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。生抗体的能力。(三三)酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法1 1原理：原理：2 2应用与方法学评价：应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。分泌量。优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细

9、胞。可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。(四四)体内试验体内试验体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后前及免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分别采血，分离血清，周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内检者体内B B细胞的功能。细胞的功能。染色计数染色计数离心取上清离心取上清测测LDHLDH或或AKPAKP离心取沉淀离心取沉淀

10、测活细胞荧光测活细胞荧光测发光强度测发光强度测测CPMCPM值值形态法形态法酶释法酶释法荧光法荧光法同位素法同位素法化学发光法化学发光法三、NK细胞活性测定靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞:K562细胞株一、中性粒细胞功能检测技术一、中性粒细胞功能检测技术二、巨噬细胞功能检测技术二、巨噬细胞功能检测技术第二节第二节 吞噬细胞功能检测技术吞噬细胞功能检测技术 趋化趋化 吞噬吞噬 胞内杀灭作用胞内杀灭作用 吞噬细胞功能：吞噬细胞功能：一、中性粒细胞功能的检测 细胞运动功能的检测细胞运动功能的检测 吞噬功能的检测吞噬功能的检测 杀菌功能的检测杀菌功能的检测(一一)趋化功能检测趋化功能检测1.

11、1.原理：原理：2.2.方法学：方法学：n琼脂糖平板法琼脂糖平板法 滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden Boyden 小室法）小室法）(二二)吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定 1 1显微镜检查法：显微镜检查法：100(%)计数的白细胞数吞噬细菌的白细胞数吞噬率100(%)计数的白细胞数数胞内含着染菌体的细胞杀菌率2.2.溶菌法溶菌法3 3NBTNBT还原试验还原试验 100min0min9060301(%)）菌落数菌落数或、作用（杀菌率二、巨噬细胞功能检测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞用鸡红细胞(CRBC)(CRB

12、C)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。巨噬细胞。正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%90%炭粒，脾巨噬细胞炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除约吞噬清除10%10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒炭粒悬液悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细

13、胞的功能。(一一)炭粒廓清试验炭粒廓清试验(二二)吞噬功能检测吞噬功能检测(三三)巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞溶酶体酶的测定1 1酸性磷酸酶的测定酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法硝酸铅法 偶氮法偶氮法2 2非特异性酯酶的测定非特异性酯酶的测定 常用常用-萘醋酸法萘醋酸法 激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经经3737预温的正常兔血浆和预温的正常兔血浆和CaCl2CaCl2混合液，加入混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置3737，即时记录血

14、浆凝固时间。即时记录血浆凝固时间。(五五)巨噬细胞促凝血活性测定巨噬细胞促凝血活性测定(四四)细胞毒作用测定细胞毒作用测定 用用IFN-IFN-激活小鼠巨噬细胞，观察其对激活小鼠巨噬细胞，观察其对125I-UdR125I-UdR标记的标记的DBA/2DBA/2小鼠肥大细胞瘤小鼠肥大细胞瘤P815P815的杀的杀伤活性。伤活性。反映机体免疫功能状态。反映机体免疫功能状态。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。测。组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。效措施。第三节 免疫细胞功能检测的临床应用