朊病毒及其检测课件.pptx

1、朊病毒及其检测CONTENTS一、前言一、前言二、二、PrPC与与PrPSC三、三、PrPC的功能的功能四、朊病毒的致病机理四、朊病毒的致病机理五、朊病毒的检测五、朊病毒的检测六、六、问题问题与展望与展望一、前言一、前言1引言 传染性海绵状脑病(transmissible spongi-form encephalopathy,TSE)是一类致死性的神经系统退行性疾病。在哺乳动物中常见疯牛病、羊瘙痒症、猫海绵状脑病以及传染性水貂脑软化病等；在人身上则发现了库鲁病、致死性家族失眠症、克-雅氏病以及格斯特曼综合症等。患病的人和动物，大脑皮层的神经元细胞会发生进行性空泡化,星形胶质细胞不断增生,造成灰

2、质变薄而白质相对明显,最后变成海绵状态。（左）病羊神经组织的海绵状损伤。（右）病人大脑组织切片，海绵状病变及周围的沉淀斑2朊病毒的发现英国的牧人就注意到羊的一种致死性疾病。M.fadyian 提出该病是由寄生虫引起的。Cuille 等发现瘙痒因子有传染性，用滤膜过滤后仍具有传染性，而提出该因子是一种病毒。Gajdusek 证实了CJD 的传染性，并根Scrapie、Kuru、CJD3种疾病的共同特征提出了传染性海绵状脑病(TSE)这一概念。美国生物化学家Prusiner证明并提出羊瘙痒病的病原体是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白，称为蛋白质侵染因子(proteinaceous infectio

3、us particle，简称prion)。3朊病毒引起的人类疾病4朊病毒引起的人类疾病 5疾病来源人类prion病约有15%的患者具有遗传性，即为家族性疾病，为常染色体显性遗传，因编码PrP的基因突变所致。遗传性由食用疯牛病病牛及其他染病动物所致。食源性传播目前已报道全世界因医源性传染而引起的prion病已达160多例，而且，输血及血制品是否也能传播此病，已引起人们的关注。医源性感染6致病特点2一旦发病，呈一旦发病，呈慢性、进行性慢性、进行性发展，以死亡发展，以死亡告终；告终；5患者以痴呆、患者以痴呆、共济失调、震共济失调、震颤等为主要临颤等为主要临床表现。床表现。4无抗原性，无抗原性，不能诱

4、导产不能诱导产生特异性免生特异性免疫应答；疫应答；1潜伏期长，潜伏期长，可达数月至可达数月至数年甚至数数年甚至数十年；十年；3病理学特征是大脑皮质神经元空泡变性、死亡、缺失，而星形胶质细胞高度增生，故大脑皮质疏松呈海绵状：有淀粉样斑块形成，HE染色淡红脑组织中无炎症反应：无淋巴细胞和炎症细胞浸润；二、二、PrPC与与PrPSC 朊病毒蛋白(Prion Protein)，简称为PrP。PrPC是指一般情况下，正常宿主细胞基因编码产生的朊蛋白，无致病性，是一种糖基磷脂酞肌醇(CPI)修饰膜在糖蛋自。广泛表达于脊椎动物，它与神经系统功能的维持、淋巴细胞信号转导、核酸代谢等有关。PrPC当其发生构象改

5、变后可变成致病性朊病毒(PrPsc)，PrPsc可引起包括疯牛病在内的一系列致死性神经性疾病。相对分子质量为2730KD，故又称作PrP2730。PrPSC1PrPC与PrPSCPrPc PrPSc螺旋折叠 二者是异构体,由同一染色体基因PRNP编码，其氨基酸序列完全一致,根本差别在于它们构象上的差异，PrPC分子中含42%的螺旋，折叠仅为3%，而PrPSC的折叠高达43%，螺旋为30%。故一般认为，PrPSC是由于PrPC发生蛋白质错误折叠，一些螺旋变构为折叠，三维构象发生变化而产生的，同时带来一系列理化性质的变化。2PrPC与PrPSC的结构3PrPC与PrPSC的理化性质4PrPC向Pr

6、PSC的转化（PrPSc的累积）的累积）（PrP转化为转化为PrPSc)(PrP与与PrPSc之间之间反应反应)（PrPc内生内生）模型一：该模型是假定一个单一的PrPSC分子与一个单一的PrPC分子结合并催化其转化成PrPSC。这两个PrPSC分子,可以继续转换成PrPC。(伸长伸长)（构象变（构象变化化)(破碎成多个部分破碎成多个部分)（感染）（感染）模型二：假设PrPSC只是纤维，捆绑PrPC fibril，然后将其转化成PrPSC，形成更长的纤维，这一现象可在染病毒致病中观察到。三、三、PrPC的功能的功能核酸代谢抗氧化参与神经系统Cu2+代谢维持神经系统功能信号转导细胞调亡PrPC的

7、功能1维持神经系统功能 在所有细胞类型中,以神经元表达PrPC水平最高，且PrPC高度富集于突触处(终板处也有富集)，这提示PrPC对神经系统有特殊的重要性。PrPC除实验表明，PrPC缺失虽不引起肉眼可见的行为和发育障碍，但在整体动物水平来看可导致与昼夜节律有关的行为异常。在神经系统水平，PrPC缺失可导致电生理参数方面的改变。有证据表明，在出现进行性运动失调症状PrPC缺失小鼠中，发现脑部严重萎缩，蒲肯野细胞异常，因PrPC缺失可能引起蒲肯野细胞过度兴奋而导致小鼠死亡。PrPC缺陷鼠还表现出对外源性铜和过氧化氢等应激诱导剂应答方面的改变。在细胞水平，PrPC缺陷鼠的神经元在培养时存活能力下

8、降，且对铜和阿拉伯糖胞苷(AraC)等所导致的氧化损伤和毒性的敏感性增加；星形胶质细胞在摄取谷氨酸方面有异常；小胶质细胞对兴奋物质的反应性下降；在突触形成中有结构改变。由此可见，PrPC可能在一定程度上参与神经系统功能的维持。2参与神经组织的Cu2+代谢 PrPC作为脑组织中膜在铜结合蛋自参与神经组织中Cu2+的稳态平衡调节，当转变为PrPSC就失去结合Cu2+的能力，造成神经组织中Cu2+含量异常，导致神经细胞损伤。Cu2+对不同神经细胞PrPC的影响也不相同。3抗氧化 PrPC通过与铜原子形成复合物而发挥抗氧化活性。PrPC借其八肽重复区最多可结合4个铜原子。结合后形成的复合物具有抗氧化活

9、性，从而保护细胞免受氧化损伤。4参与淋巴细胞信号转导 PrPC可高水平地在人T、B淋巴细胞、单核细胞及树突状细胞中表达，不同细胞中表达PrPC的糖基组成、糖链形状及蛋自酶解的敏感性都有差异。T细胞的活化伴随着其表而PrPC的表达上调，且PrPC在记忆T细胞比初始T细胞的表达水平高。5细胞凋亡 在PrP敲除小鼠神经元中，多种凋亡相关蛋自显著增加，线粒体Ca2+含量改变、细胞色素c释放，都表明PrP参与细胞凋亡调控过程。体外试验也显示PrPC能够保护人的神经元免受Bax诱导的细胞凋亡，而缺失八肽序列或C端带有突变的PrP均不具有该活性。6核酸代谢 Gabus等根据小鼠中瘟痒病的感染过程会因鼠自血病

10、病毒（MuLV）的复制而加速，以及人类PrP功能上类似于NCp7，可辅助反转录酶合成前病毒DNA等现象，提出PrP可能参与了体内核酸代谢过程。四、朊病毒的致四、朊病毒的致病机理病机理致病机理致病机理电泳活性染色法阮病毒学说“yeast prions”学说 1阮病毒学说 PrPC是一种膜蛋白，其C端含有23个氨基酸组糖基磷酸肌醇(GPI)锚受体结合位点，因此可通过糖基肌醇磷酸脂(glycoirmitol phosphohptds)联在膜上，定位于细胞膜的穴样内陷类结构域（CLDs），在神经元，当膜浆膜上的PrPC变成为PrPSC后，PrPSC脱落并聚集在神经元的溶酶体。当达到数量，就可使神经元细

11、胞破裂，形成神经组织的空泡化，并使星型胶质细胞增生，2“yeast prions”学说 3蛋白的氧化反应学说 杨池明提出了疯牛病蛋白长寿命自由基即为疯牛病中的亚病毒的理论设想，他认为真正的疯牛病蛋白亚病毒可能是由蛋白的氧化反应所形成的疯牛病蛋白自由基。应用此理论能够解释疯牛病的一些病理现象。五、朊病毒的检五、朊病毒的检测测接种传递组织印记法酶联免疫吸附法毛细管凝胶电泳朊病毒的检测朊病毒的检测取组织标本取组织标本 10倍连续稀释倍连续稀释研研 磨磨10个稀释浓度个稀释浓度分别接种小鼠分别接种小鼠直到死亡直到死亡或盲传几代或盲传几代 出现症状出现症状杀死，杀死，取脑组织检查取脑组织检查 死亡死亡不

12、出现症状不出现症状 观察观察饲养饲养24h未死亡未死亡正常饲养正常饲养 补接补接1动物的接种传递实验取标本取标本甲酚脱毒甲酚脱毒甲醛固定甲醛固定石蜡包埋石蜡包埋 55干燥干燥二甲苯脱蜡二甲苯脱蜡 异丙醇水化异丙醇水化 空气干燥空气干燥蛋白酶蛋白酶K消化消化 盐酸胍处理盐酸胍处理 1.前处理前处理2.检测检测NC：硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜 前处理品前处理品免疫学检测免疫学检测取出取出NC膜膜5-7m薄片薄片收集在收集在NC上上2mm厚切片厚切片切片切片55水浴水浴2组织印记法匀浆匀浆离心离心处理处理显色显色 3酶联免疫吸附法 电泳电泳 4毛细管凝胶电泳免疫测定法六、展望六、展望高级结构致病原因感

13、染性 如何对非结晶型的朊病如何对非结晶型的朊病毒蛋白进行分子结构的毒蛋白进行分子结构的准确分析，能否寻找一准确分析，能否寻找一种方法，可以获得朊病种方法，可以获得朊病毒蛋白的准确的高级结毒蛋白的准确的高级结构。构。朊病毒的致病原因是朊病毒的致病原因是PrPsc的过度增殖还的过度增殖还是由于是由于PrPc正常功能正常功能的缺失。的缺失。体外试验产生体外试验产生PrPSC到底有无感染性，到底有无感染性，PrPSC的增殖是否需的增殖是否需要其他辅助因子（如要其他辅助因子（如RNA）的参与。）的参与。科学家已经做了大量的关于朊病毒的研究工作，在许多方面取得了重要的进展，诸如PrPC与PrPSC的结构、PrPC到PrPSC的转化、PrPSC的增殖过程。但尚有许多难题有待我们去解决：顽强的毅力可以征服世界上任何一座高峰。种子最后是果实；努力最后是成功；放弃最后是失败。感谢上天我所拥有的，感谢上天我所没有的。不在其位，不谋其政。论语泰伯尽管时光要使爱情凋谢，但真正的爱，却永远保持着初恋的热情。我们大部份的生命都浪费在文字语言的捉摸上。无所不能的人实在一无所能，无所不专的专家实在是一无所专最孤独的时光，会塑造最坚强的自己。鸟欲高飞先振翅，人求上进先读书。付出了不一定有回报，但不付出永远没有回报。只要能收获甜蜜，荆棘丛中也会有蜜蜂忙碌的身影。人们是看你做什么，不是听你说什么。