1、基因工程原理基因n指能产生一条肽链的DNA片段。包括编码区和其上下游区域（引导区和尾部），以及在编码片段间（外显子）的割裂序列（内含子）53原核生物基因结构RNA 转录子 蛋白编码区终止子序列启动子/调控区域 3非翻译区转录起始位点5 非翻译区真核生物基因结构n-珠蛋白基因为例-珠蛋白基因外显子外显子内含子内含子真核生物与原核生物基因表达基因工程定义n基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒、或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定地繁殖。工具酶n限制性内切酶n修饰酶限制性内切酶的分类与命名n细菌的限制与修饰系统n分类 型限制性内切酶 型限
2、制性内切酶 型限制性内切酶n命名 第一个字母是属名的第一个字母（大写），后两个字母是种名前两个字母（小写），有时也包含菌株名称，第一次分离到的内切酶为，其次为等。例如：HindIII Haemophilus influenzae Rd.限制性内切酶与黏末端3CTTAAG53CTTAA5 3G55GGATCC33CCTAGG55G3 5GATCC33CCTAG5 3G55GATATC33CTATAG55GAT3 5ATC3 3CTA5 3TAG55CTGCAG33GACGTC55CTGCA3 5G33G5 3ACGTC5Eco RIBam HIEcoRVPst I5GAATTC35G3 5AAT
3、TC3Hin dIII5AAGCTT33TTCGAA55A3 5AGCTT33TTCGA5 3A55 overhang5 overhang5 overhang3 overhangblunt end修饰酶nDNA聚合酶nRNA聚合酶n磷酸酶n激酶n核酸酶n连接酶载体n用途 1、克隆载体 2、表达载体n来源 1、质粒 2、噬菌体 3、黏粒载体 4、病毒 5、细菌人工染色体 6、酵母人工染色体载体应具备的条件n能自我复制n具有选择标记n具有多克隆位点质粒质粒载体质粒载体目的基因的获取n人工合成n基因组文库ncDNA文库nPCREcoR I Partial digestion基因组文库基因组文库Inf
4、ect cells基因组DNAcDNA文库mRNAcDNA双链cDNA克隆到载体中转化细菌逆转录酶DNA聚合酶 基因组文库 cDNA文库PCRn一对引物n扩增模板ndNTPn耐高温DNA聚合酶nPCR循环 高温变性 低温退火 中温延伸PCR重组DNA分子的构建重组DNA分子导入受体细胞n转化n转染n电穿孔n基因枪n显微注射n根癌农杆菌介导（T-载体）n脂质体载体法重组体的筛选与鉴定n抗药性记号插入失活筛选n-半乳糖苷酶显色反应筛选n菌落或噬菌斑杂交筛选n表达载体产物的免疫化学检测法n利用营养缺陷型进行筛选重组体的筛选与鉴定n抗药性记号插入失活筛选n-半乳糖苷酶显色反应筛选n菌落或噬菌斑杂交筛选
5、n表达载体产物的免疫化学检测法n利用营养缺陷型进行筛选MCSX-gal重组体的筛选与鉴定n抗药性记号插入失活筛选n-半乳糖苷酶显色反应筛选n菌落或噬菌斑杂交筛选n表达载体产物的免疫化学检测法n利用营养缺陷型进行筛选Bacterial colonies containingcloned segments of foreign DNARadioactive DNATransfercells tofilter1SolutioncontainingprobeTreat cellson filter toseparateDNA strands2Add probeto filter3ProbeDNAGene ofinterestHydrogen-bondingAutoradiography4Developed filmColonies of livingcells containinggene of interestCompare autoradiographwith master plate5Master plateFilterpaper重组体的筛选与鉴定n抗药性记号插入失活筛选n-半乳糖苷酶显色反应筛选n菌落或噬菌斑杂交筛选n表达载体产物的免疫化学检测法n利用营养缺陷型进行筛选目的蛋白表达形式n细胞内表达n细胞外表达n诱导表达n组成型表达n定位表达n非定位表达
