培养基配制及灭菌课件.ppt

1、植物组织培养植物组织培养第一节培养基的配置一、定一、定 义义 人工配制的 微生物或动植物细胞 生长繁殖或积累代谢产物 营养基质二、培养基的组成成份二、培养基的组成成份 无机成分：无机成分：大量元素：大量元素：氮：铵态氮、硝态氮混合 磷：磷酸盐 钾：钾盐 钙、钠、镁、硫 微量元素：微量元素：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯 有机成分有机成分 糖、维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。植物生长调节物质：植物生长调节物质：生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D 细胞分裂素类：6-BA,KT，TDZ，ZT 其他类：GA3,ABA，PP333 琼脂、明胶、硅胶等琼脂、明胶、硅胶等 水水I.大量元素（大量

2、元素（mg/L）NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl22H2O 440 MgSO4.7H2O 370常用的常用的MS培养基配方：培养基配方：II.微量元素（微量元素（mg/L）MnSO4 4H2O 22.3 ZnSO4 7H2O 8.6 H3BO3 6.2 KCI 0.83 Na2MoO4 2H2O 0.25 CuSO4 5H2O 0.025 III.磷盐磷盐 KH2PO4 170 IV.铁盐铁盐 Na2 EDTA 37.5 Fe SO4 7H2O 27.8V.有机（有机（mg/L）甘氨酸甘氨酸 2.0 盐酸硫胺素盐酸硫胺素 B1 0.1 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 B6 0.5 烟

3、酸烟酸 0.5 肌醇肌醇 100 附加成分附加成分(g/L)蔗糖蔗糖 30 琼脂琼脂 8.0 PH=5.86.21、母液的配制（储备液的配制）、母液的配制（储备液的配制）2、培养基的配制、培养基的配制三、培养基的配制三、培养基的配制MS培养基组成成份培养基组成成份1升储备液用量（升储备液用量（mg）每升培养基取用量（每升培养基取用量（mL）20储备液储备液1（大量元素）（大量元素）NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4330003800088007400340050200储备液储备液2（微量元素）（微量元素）KI H3BO3 MnSO4.4H2O Zn

4、SO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O1661240446017205055 5200*储备液储备液3（铁盐）（铁盐）FeSO4.7H2O Na2.EDTA.2H2O55607460 5200*储备液储备液4（有机成分）（有机成分）肌醇肌醇 烟酸烟酸 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 盐酸硫胺素盐酸硫胺素 甘氨酸甘氨酸2000010010020400 51、储备液配制、储备液配制 一般母液浓度是实验需要浓度的10-200倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。把几种药品配在同一母液中时，要注意各种化合物的组合以及加入的前后顺序，应

5、该把钙离子、锰离子、钡离子与硫酸根和磷酸根例子错开，以免发生沉淀。把每种试剂单独溶解后再加入后一种化合物。铁盐必须单独配制。将FeSO4.7H2O水溶液缓慢加入到Na2.EDTA.2H2O微沸水溶液中，并不断搅拌，最后定容。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时按比例稀释。注意事项注意事项 激素溶解方法激素溶解方法 IAA、IBA、GA 溶于少量的溶于少量的95的酒精的酒精 加水定容；加水定容；NAA 热水或少量热水或少量95的酒精的酒精 加水定容；加水定容；2，4-D 少量少量95%的酒精和的酒精和1M的的NaOH溶解溶解 加水定容；加水定容；KT和和BA 溶于少量溶于少量1M的的HCI 加水定

6、容；加水定容；玉米素玉米素 溶于少量溶于少量95的酒精的酒精 加热水定容。加热水定容。2、培养基的制备、培养基的制备取母液取母液调调pH值值培养基熬制培养基熬制灭菌灭菌称取蔗糖、琼脂称取蔗糖、琼脂扎口扎口加适量水加适量水分分 装装定定 容容接种接种确定配方确定配方其他物质其他物质定容定容1 1）将培养液倒入铝锅中，同时加入称好的蔗糖和琼）将培养液倒入铝锅中，同时加入称好的蔗糖和琼脂，边煮边搅拌，防止糊底。脂，边煮边搅拌，防止糊底。注意：火不要太大，注意：火不要太大，防沸出。防沸出。2 2）用旺火煮开，再用文火加）用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。热，直至琼脂全部融化。3 3）取出培养

7、基，并初步定容。）取出培养基，并初步定容。培养基熬制及初步定容培养基熬制及初步定容 调调pH值及分装值及分装1）用）用1M NaOH或或HCl调调pH值为值为5.8。2）趁热分装，装瓶量一般为）趁热分装，装瓶量一般为瓶容量的瓶容量的1/31/2；装试管一；装试管一般为试管高度的般为试管高度的1/51/4。3）避免琼脂粘在管口或瓶口）避免琼脂粘在管口或瓶口上，最好用漏斗。上，最好用漏斗。本实验中，本实验中，请借助玻璃棒引流。请借助玻璃棒引流。要求封口松紧适宜，系活扣，要求封口松紧适宜，系活扣，便于接种操作。便于接种操作。扎口扎口本实验中先套封口膜，用橡本实验中先套封口膜，用橡皮筋扎好，然后再套上

8、牛皮皮筋扎好，然后再套上牛皮纸，用橡皮筋扎好。纸，用橡皮筋扎好。培养基用湿热灭菌培养基用湿热灭菌1）首先取出灭菌桶，向锅内加入适量的水。2）放回灭菌桶，装入待灭菌物品。3）加盖，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。4）水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。5）当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121，20分钟灭菌。6）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子。7）将取出的灭菌培养基放入37温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。培养基高压蒸汽灭

9、菌所必需的最少时间培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间容器的体积容器的体积/mL在在121灭菌所灭菌所需最少时间需最少时间/min20-501575-15020250-50025100030本节课任务本节课任务1、器皿消毒、器皿消毒（1 1人人/组）组）每组包每组包2 2对培养皿，其中对培养皿，其中1 1个培养皿装个培养皿装3 3张滤纸；张滤纸；包扎包扎2 2个个100mL100mL烧杯，烧杯，2 2个个250mL250mL三角瓶，每瓶装三角瓶，每瓶装100mL100mL蒸馏水蒸馏水 包扎刀柄，弯嘴镊子；包扎刀柄，弯嘴镊子；写上各组标记；写上各组标记；交给陈老师，统一灭菌。交给陈老师，统一灭菌。

10、MSMS基本培养基的配制基本培养基的配制 大量元素 30.0mL 微量元素 3.0mL 铁盐 3.0mL 有机 3.0mL 电磁炉加热煮沸融化琼脂后，加水定容至582mL（用量筒）。加不同激素浓度加不同激素浓度(0.5(0.5、1 1、2mg/L)MS2mg/L)MS培养基的配制培养基的配制 取200mL烧杯3个，分别吸取0.1mg/mL 2,4-D溶液 烧杯1:2,4-D溶液1mL+MS基本培养基194mL 烧杯2:2,4-D溶液2mL+MS基本培养基194mL 搅拌混匀 烧杯3:2,4-D溶液4mL+MS基本培养基194mL 用NaOH调pH至5.8,再加水定容至200mL(用量筒)。分装：分装：50mL三角瓶，约20-30mL/瓶，盖上封口膜，用牛皮纸包扎。灭菌：灭菌：标上激素浓度和姓名，统一放置灭菌。保存：保存：灭菌后，每组带托盘取培养基，放于316培养架上。2、培养基配制及灭菌、培养基配制及灭菌（1 1人人/组，组，1212瓶瓶/组组）蒸馏水500mL蔗糖18.0g琼脂4.8g加入搪瓷缸中+五、课后作业及预习五、课后作业及预习 课后作业课后作业诱导愈伤的培养基与生根培养基有何区别？为什么？预习预习1、熟悉无菌操作技术。2、外植体的消毒处理方式。