化学发光免疫分析技术-课件.ppt

1、 化学发光免疫分析一、一、化学发光免疫技术的概念化学发光免疫技术的概念二、二、化学发光免疫分析基本原理化学发光免疫分析基本原理三、三、化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型四、临床应用四、临床应用五、发展与展望五、发展与展望一、化学发光免疫技术的概念 化学发光免疫技术化学发光免疫技术：化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光的强度来确定物质含量的分析方法。化学发光免疫分析是将化学发光的强度来确定物质含量的分析方法。化学发光免疫分析是将化学发光系统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与系统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或

2、抗原，与待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入化学发光系统的其它相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或化学发光系统的其它相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或定性检测。定性检测。化学发光免疫测定是目前世界公认先进的标记免疫测定技术，化学发光免疫分析技术具有高度的准确性和特异性，成为检验方法中最为重要的技术之一。化学发光免疫分析技术作为疾病诊断的主要手段已被广泛用于机体免疫功能、传染性疾病、内分泌功能、肿瘤标志物、性激素、甲状腺功能等方面的体外诊断实验中。化学发光免疫分析的优势灵敏度高灵敏度高 灵敏度高是化

3、学发光免疫分析关键的优越性，其灵敏度可达 10-22 mol/L（RIA 为 10-12 mol/L）。化学发光免疫分析能够检出放射免疫分析和酶联免疫分析等方法无法检出的物质，对疾病的早期诊断具有十分重要的意义。宽的线性动力学范围宽的线性动力学范围 发光强度在 4 6 个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。这与显色的酶免疫分析吸光度（OD 值）为 2.0 的范围相比，优势明显。虽然 RIA 也有较宽的线性动力学范围，但放射性限制了其应用。光信号持续时间长光信号持续时间长辉光型的 CLIA 产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天。简化了实验操作及测量。分析方法简便快速分析方法简便快速绝大多数分析

4、测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步模式。结果稳定、误差小结果稳定、误差小样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能因素（光源稳定性、光散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析结果灵敏稳定可靠。安全性好及使用期长安全性好及使用期长免除了使用放射性物质。到目前为止，还未发现其危害性；试剂稳定，保存期可达一年。二、化学发光免疫分析基本原理 化学发光免疫分析包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。免疫反应系统是将标记物质标记在抗原或抗体上,经过特异性免疫反应后,形成抗原2抗体复合物。然后进行对标记物进行检测,来测定待检物。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催

5、化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子,利用发光信号测量仪器光量子产率。2.1 免疫分析原理 免疫分析是利用抗原与抗体特异性结合形成抗原2抗体复合物而建立起来的一种高选择性的分析方法,根据其检测方法可分为非标记免疫分析和标记免疫分析。非标记免疫分析是利用抗原与抗体结合形成抗原2抗体复合物后,其理化性质发生改变,出现肉眼可见的沉淀、凝集等现象,利用这些现象来检测待检物。标记免疫分析是在不影响抗原、抗体生物活性的基础上将标记物质标记在抗原或抗体上,然后进行免疫反应形成抗原2抗体复合物,再对标记质进行检测,从而间接检测待检物的方法。目前常用的标记

6、物有放射性的125 I,非放射性的碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶,镧系稀土元素等。2.2 化学发光原理 化学发光(Chemiluminescence,CL)是化学物质在特定化学反应中产生的光辐射。通过高能中间体的分解在化学反应中激发单态分子形成,分子被激发后是不稳定的,它要释放出多余的能量而回到基态,其中部分的能量以发光形式释放出来。因此,任何一个化学发光反应包括两个过程:激发和发光过程。一些激发态分子能量也会通过系间串跃和系内串跃而消失。因此,化学发光反应的效率是:CL=CEEM (1)式中,CL为化学发光效率,CE为生成激发态的效率,EM为激发态的发光效率。CE和EM分别定义为：CE=生成激发

7、态的分子数/参加反应的分子数 (2)EM=发光的分子数/生成激发态的分子数 (3)从(1)、(2)、(3)式得化学发光的效率CL等价于生成荧光和磷光的量子效率。即:CL=发光的分子数/参加反应的分子数 (4)2.3 化学发光免疫分析的原理 化学发光免疫分析法是化学发光和免疫分析结合的产物。它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选择性。化学发光免疫分析是用化学发光反应的试剂标记抗原或抗体,标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤,最后以测定发光强度形式测定待测物的含量。三、化学发光免疫分析的类型 化学发光免疫分析法根据其标记物的不同可分为三大类,即化直接化学发光免疫分析、

8、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。用吖啶酯直接标记抗体用吖啶酯直接标记抗体(抗原抗原)，与待测标本中相，与待测标本中相应的抗原应的抗原(抗体抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗发生免疫反应后，形成固相包被抗体体-待测抗原待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（入氧化剂（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成碱性环境，吖啶酯在使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光不需要催化剂的情况下分解、发光 。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测

9、抗原的量成正比，可从的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。标准曲线上计算出待测抗原的含量。3.1 3.1 直接化学发光免疫分析直接化学发光免疫分析发光发光YYY磁微粒磁微粒被测抗原被测抗原+抗体抗体+带带吖吖啶酯啶酯标记物抗标记物抗体体YYYYYYYYYYY冲洗后冲洗后（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化学发光的机理直接化学发光的机理磁磁微粒微粒模式图模式图Y YY YY Y Y YY Y Y YY YY YY YY YY YY YY Y Y Y Y Y Y Y Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY

10、YY YY YY YY YY YY YY YY Y特点特点 抗原和抗体结抗原和抗体结合与未合与未结合结合部分部分的的易易分离分离磁微粒磁微粒技术技术 化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶或碱性磷酸酶(ALP)(ALP)来标记抗原或抗来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原体，在与待测标本中相应的抗原(抗体抗体)发生免疫反应后，形成发生免疫反应后，形成固相包被抗体固相包被抗体-待测抗原待

11、测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物底物(发光剂发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。3.23.2、化学发光酶免疫分析、化学发光酶免疫分析该分析系统采用辣根过氧化物酶（该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标）标记抗体记抗体(或抗原或抗原)，在与反应体系中的待测标，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免

12、疫反应后，形成固相包本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体被抗体-待测抗原待测抗原-酶（酶（HRP）标记抗体复合）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发和化学发光增强剂使产生化学发光。光增强剂使产生化学发光。辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 该分析系统以碱性磷酸酶该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体标记抗体(或抗原或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体免疫反

13、应后，形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶酶标记抗体复合物，这时加入标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，发光剂，碱性磷酸酶使碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。脱去磷酸根基团而发光。碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 分配样品分配样品,磁颗粒磁颗粒和试剂和试剂孵育孵育使反应物使反应物结合结合在磁场中在磁场中清洗去除清洗去除未结合物质未结合物质加入加入底物底物产生产生信号信号孵育孵育,促使信号促使信号的产生的产生信号信号检测检测电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析（electro

14、chemiluminescence immunoassay，ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记是以电化学发光剂三联吡啶钌标记 抗体抗体(抗原抗原)，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)为电子供体，为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光在电场中因电子转移而发生特异性化学发光 反应，它包括电化学和化学发光两个过程。反应，它包括电化学和化学发光两个过程。3.3 3.3 电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体包被抗体(抗原抗原)，用三联吡啶钌标记抗体，用三联吡啶钌标记抗体(抗原抗原)

15、，在，在反应体系内待测标本与相应的抗原反应体系内待测标本与相应的抗原 (抗体抗体)发生免疫发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体反应后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原待测抗原-三联吡啶三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人同时引人TPATPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和电化学发

16、光反应，使三联吡啶钌和TPATPA在电极表面进在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。的浓度成正比。电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图 四四、临床应用临床应用 1.1.甲状腺激素甲状腺激素 2.2.生殖激素生殖激素 3.3.肾上腺肾上腺/垂体激素垂体激素 4.4.贫血因子贫血因子 5.5.肿瘤标记物肿瘤标记物 6.6.感染性疾病感染性疾病 7.7.糖尿病糖尿病 8.8.心血管系统心血管系统 9

17、.9.病毒标记物病毒标记物 10.10.骨代谢骨代谢 11.11.过敏性疾病过敏性疾病 12.12.治疗药物监测治疗药物监测 五、发展与展望 化学发光免疫分析法具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、设备简单等优点，近年来在环境、临床、食品、药物检测中得到了广泛运用。实际检测常常需要对大量、复杂、低丰度的样品进行测定，因而化学发光免疫分析法逐渐向快速、高通量、高灵敏检测的方向发展。近几年化学发光免疫分析法的研究方向主要涉及到降低温育时间，多组分检测，以及信号放大技术等。这些例子都证明了化学发光免疫分析法具有广泛的应用前景和可操作性。此外，化学发光成像技术、化学发光免疫分析与分离技术的联用，可以使免疫分析的选择性、灵敏度和检测速度、检测通量得到进一步提高。为了更好地适应临床、环境等领域的实际应用，需要大力发展微型化、集成化和自动化的化学发光免疫分析仪器。随着分子生物学及纳米与传感技术的进步，新的化学发光免疫分析原理与高灵敏的免疫分析方法将得到不断发展，开发催化活性更高、稳定性更好、发光动力学曲线更符合免疫分析的酶和底物并推广到临床检测，发展新型标记技术用于信号放大，建立化学发光免疫分析新方法，都将是未来的发展方向及研究重点。