分子生物学Molecular+Biology-课件.ppt

1、章节课程内容课程内容原章节1绪论绪论12基因组与基因组学基因组与基因组学93重组与转座重组与转座74原核生物的转录及调控原核生物的转录及调控35真核生物的转录及调控真核生物的转录及调控46转录后加工及基因表达调控转录后加工及基因表达调控57蛋白质翻译蛋白质翻译6自学自学分子生物学研究方法分子生物学研究方法2专题课程内容课程内容1真核生物的真核生物的RNARNA聚合酶及其启动子聚合酶及其启动子2真核生物的转录因子、增强子真核生物的转录因子、增强子3染色质结构及其对基因转录的影响染色质结构及其对基因转录的影响4mRNAmRNA的加工：剪接、加帽与加尾的加工：剪接、加帽与加尾5其它其它RNARNA的

2、加工、转录后基调控的加工、转录后基调控6蛋白质翻译蛋白质翻译-分子生物学研究方法分子生物学研究方法认识认识分子生物学的重要地位分子生物学的重要地位提纲挈领，把握重点提纲挈领，把握重点理解胜于记忆理解胜于记忆重视基础研究方法重视基础研究方法尊重历史人物尊重历史人物泛读泛读狭义的分子生物学就是基因的分子生物学狭义的分子生物学就是基因的分子生物学ReplicationSame Genome,Differentiated ExpressionSame Genome,Differentiated Expression分子生物学的核心是分子生物学的核心是基因的表达与调控基因的表达与调控n 真核生物转录与翻

3、译隔开；真核生物转录与翻译隔开；n 原核生物基因是多顺反子；原核生物基因是多顺反子；n 真核生物转录后加工。真核生物转录后加工。See the movien 转录过程的本身在真核生物与原核生转录过程的本身在真核生物与原核生物中是相同的，但所用的物中是相同的，但所用的转录转录“机器机器”存在差别存在差别（RNARNA聚合酶、启动子、转聚合酶、启动子、转录因子录因子）；）；n 真核生物真核生物转录机器的复杂性转录机器的复杂性为真核基为真核基因的调控提供更多的控制点。因的调控提供更多的控制点。一、一、真核生物的真核生物的RNARNA聚合酶聚合酶n Question1 Question1：真核生物的真

4、核生物的RNARNA聚合酶聚合酶(polymerase)(polymerase)与原核生物一样吗？与原核生物一样吗？nClues:Clues:真核生物真核生物核糖体基因核糖体基因具有如下特点：具有如下特点：1.1.GCGC含量高（含量高（60%60%），其它基因），其它基因DNA DNA GCGC含量含量40%40%；2.2.拷贝极多（几百拷贝极多（几百-两万）；两万）；3.3.定位在核仁定位在核仁nSurmise:Surmise:真核生物中可能不止一种真核生物中可能不止一种RNARNA聚合酶聚合酶Robert Roeder Robert Roeder&William RutterWillia

5、m Rutter1942-University of Washington1928-University of Washington2003 Lasker Award2000 Lasker Award(scientists in Chiron corporation)1969-1991 UCSFChiron corporation founderpost-doc 1969-1971UCSF Between 1952 and 1968,Rutter held positions at the University of Wisconsin,the Karolinska Institutet,Un

6、iversity of Illinois,Stanford University and University of Washington.In 1969,UCSF succeeded in recruiting Rutter to UCSF to develop a new department of Biochemistry and Biophysics.He completed structural and functional analysis and cloning of the rat and human insulin.In 1981 Rutter and two colleag

7、ues founded Chiron.He conducted Hepatitis B research,which resulted in development with Chiron and Merck of the vaccine for Hepatitis B,the first recombinant vaccine.Also at Chiron,he worked on the first sequencing of the HIV genome in 1984,and discovered,sequenced,and cloned the Hepatitis C virus i

8、n 1987.This opened the way for the development of diagnostic tests,therapeutic drugs,and vaccines against these viruses.After his retirement from UCSF in 1991,William Rutter began a second distinguished career as spokesman and developer of the biotechnology industry,and subsequent years have brought

9、 new work and more recognition.Nature 1969;224:234-237材料：海胆胚和大鼠肝细胞核提取物材料：海胆胚和大鼠肝细胞核提取物海胆，徐辉海胆，徐辉 2011-10-222011-10-22摄于外伶仃岛摄于外伶仃岛离离子子交交换换层层析析原原理理示示意意图图注：不同颜色代表电荷不同的蛋白质方法：离子交换层析方法：离子交换层析将阴离子交换树脂（带正电荷）颗粒填充在层析管内，可吸附带负电荷的蛋白质，由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸附的程度也不同。用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加阴离子浓度，含电荷多的蛋

10、白质也被洗脱下来。不断增加离子浓度，收集各种组分，对每种收集组分进行分析。详细可查阅：详细可查阅：5.1 离子交换层析离子交换层析Nature 1969;224:234-237海胆胚提取物层析分析结果海胆胚提取物层析分析结果问题：为什么用问题：为什么用UMP?UMP?大鼠肝提取物层析分析结果大鼠肝提取物层析分析结果Nature 1969;224:234-237大鼠肝提取物核质和核仁馏分层析分析结果大鼠肝提取物核质和核仁馏分层析分析结果PNAS 1970;65:675-682大鼠肝细胞大鼠肝细胞核质核质馏分馏分大鼠肝细胞大鼠肝细胞核仁核仁馏分馏分Harvard UniversityRichard

11、 Burgess&Andrew Travers Richard Burgess&Andrew Travers Now:University of WisconsinNow:University of Cambridge Harvard UniversityNature 1969(Jan);221:43-46 Nature 1969(Jan);221:43-46 中文第四版书上标注有误中文第四版书上标注有误Robert RoederRobert RoederRichard Burgess Richard Burgess Ph.D.,1969UCSFPh.D.,1969,Harvard Unive

12、rsityAndrew Travers Andrew Travers post-doc 1969 Harvard Universityn Question2Question2：真核生物的三种真核生物的三种RNARNA聚合酶各转录聚合酶各转录什么什么RNA?RNA?nStrategies:Strategies:n 纯化纯化三种三种RNARNA聚合酶，分析它们体聚合酶，分析它们体外可转录哪些特定的基因外可转录哪些特定的基因;n 抑制各种抑制各种RNARNA聚合酶的活性，检测聚合酶的活性，检测各种各种RNARNA基因的转录变化。基因的转录变化。巧妙！巧妙！-鹅膏蕈（鹅膏蕈（xn）碱（）碱（amani

13、tinamanitin ）致死性毒蘑菇鬼笔鹅膏菌（Amanita phalloides）产生的具有双环结构的八肽毒素此菌极毒，中毒后潜伏期长。发病初期以胃肠道病症。恶心、呕吐、腹痛、腹泻、此后一、两天似乎病愈，实际上毒素进一步损害肝、肾、心脏、肺、大脑中枢神经系统。病情很快恶化，出现呼吸困难，烦燥不安，谵语、面肌抽搐、小腿肌肉痉挛。病情进一步加重，出现肝、肾细胞损害，黄胆，急性肝炎，肝肿大及肝萎缩，最后昏迷。死亡率高达50%以上，甚至100%。地理分布生长在林地，特别是橡树林或山毛榉树林里，夏秋季在阔叶林中地上也有单生或群生。分布在我国江苏 江西 湖北 安徽 福建 湖南 广东 广西 四川 贵州

14、 云南等地。致命白毒伞（毒蕈类）致命白毒伞（毒蕈类）外形与一些传统的食用蘑菇较为相似，外形与一些传统的食用蘑菇较为相似，极易引起误食，喜欢在黧蒴树的树荫极易引起误食，喜欢在黧蒴树的树荫下群生。黧蒴树在下群生。黧蒴树在广州地区白云山、天麓湖、广州地区白云山、天麓湖、华南植物园等山地均有分布华南植物园等山地均有分布。在新鲜毒菇中毒。在新鲜毒菇中毒素含量很高，素含量很高，50克左右的白毒伞菌体所含毒素克左右的白毒伞菌体所含毒素便足以毒死一个成年人便足以毒死一个成年人。中毒者死亡率高达。中毒者死亡率高达90以上，以上，是历年广州地区毒菇致死事件的罪魁是历年广州地区毒菇致死事件的罪魁祸首祸首。Decre

15、ased RNA content in mouse liver Decreased RNA content in mouse liver nuclei after intoxication with-nuclei after intoxication with-amanitinamanitin.L.Fiume,F.StirpeIstituto di Patologia generale,Universit di Bologna Bologna,ItalyBiochimicaBiochimica et et BiophysicaBiophysica ActaActa(BBA)(BBA)Sep 1

16、966Effect of alpha-Effect of alpha-amanitinamanitin on ribonucleic on ribonucleic acid synthesis and on acid synthesis and on ribonucleic acid ribonucleic acid polymerase polymerase in mouse liver.in mouse liver.F.Stirpe,L.FiumeThe Biochemical journal The Biochemical journal Jun1967Biological Scienc

17、es:Specific Action of Biological Sciences:Specific Action of-AmanitinAmanitin on Mammalian RNA Polymerase on Mammalian RNA Polymerase ProteinProteinJacob,S.T.,Sajdel,E.M.,and Munro,H.N Department of Nutrition and Food Science,Massachusetts Institute of Technology.Nature Nature Jan 1970Specific Inhib

18、ition of Nuclear RNA Specific Inhibition of Nuclear RNA Polymerase II by-Polymerase II by-AmanitinAmanitinThomas J.Lindell,Fanyela Weinberg,Paul W.Morris,Robert G.Roeder and William J.RutterDepartment of Biochemistry and Biophysics,University of California,San Francisco.Science Science Oct 1970Role

19、of DNA-dependent RNA polymerase 3 in Role of DNA-dependent RNA polymerase 3 in the transcription of the the transcription of the tRNAtRNA and 5S RNA and 5S RNA genes.genes.William J.Rutter and Robert G.Roeder Department of Biochemistry and Biophysics,University of California,San Francisco.PNASPNASMa

20、y 1974不同浓度的不同浓度的-AmanitinAmanitin对三种对三种RNARNA聚合酶活性的影响聚合酶活性的影响PNAS 1974;71(5):179094.PNAS 1974;71(5):179094.-AmanitinAmanitin对小对小RNARNA合成的影响合成的影响5S=5Sr5S=5SrRNA,RNA,4S=4StRNA.4S=4StRNA.microRNA75%-85%15%3-5%n Question3Question3：真核生物的三种真核生物的三种RNARNA聚合酶的组成聚合酶的组成是什么是什么?n Strategies:Strategies:层析分离纯化各种层析

21、分离纯化各种RNARNA聚合酶，聚合酶，SDS-SDS-PAGEPAGE变性胶电泳，观测各蛋白亚基的变性胶电泳，观测各蛋白亚基的大小。大小。Hager,G L;Holland,M J;Rutter,W JHigh yields of each enzyme activity are obtained,allowing the preparation of approximately 10 mg of polymerase I,25 mg of polymerase II,and 12 mg of polymerase III from 1.2 kg of cells(wet weight).I

22、solation of ribonucleic acid Isolation of ribonucleic acid polymerases I,II,and III from polymerases I,II,and III from Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae.Biochemistry 1977;16(1):1-8酵母三种酵母三种RNA聚合酶的电泳图聚合酶的电泳图Biochemistry 1977;16(1):1-8I IIIIIIIIIIIn Question4Question4：层析法分离的蛋白产物中是否包含层析法分

23、离的蛋白产物中是否包含各种各种RNARNA聚合酶的所有亚基（或组分）聚合酶的所有亚基（或组分）?n Strategies:Strategies:免疫沉淀法免疫沉淀法分离分离RNARNA聚合酶复合物，聚合酶复合物，SDS-PAGESDS-PAGE变性胶电泳检测各亚基。变性胶电泳检测各亚基。n 表位标签法（表位标签法（epitope taggingepitope tagging）：）：通过通过DNADNA重组，将外源抗原决定簇基因重组，将外源抗原决定簇基因片段（片段（tagtag）与）与RNARNA聚合酶的一个亚基的基因聚合酶的一个亚基的基因片段融合，导入该亚基缺失的细胞株中，通片段融合，导入该亚

24、基缺失的细胞株中，通过抗体识别该融合蛋白过抗体识别该融合蛋白(tag(tag片段片段)，将蛋白复，将蛋白复合物免疫沉淀下来。合物免疫沉淀下来。WTWTTaggedTaggedTagTagSDS-PAGESDS-PAGE变性胶电泳变性胶电泳32P32P标记可检测是不是磷酸化的蛋白标记可检测是不是磷酸化的蛋白酵母酵母RNA聚合酶聚合酶的亚基结构的亚基结构Kolodziej et al.,Mol.Cell Biol.10(May 1990)p.1917酵母酵母RNA聚合酶聚合酶的亚基结构的亚基结构Sayre et al.,J.Biol.Chem.267(15 Nov 1992)p.23379RNAR

25、NA聚合酶聚合酶大亚基的异质性大亚基的异质性（1 1）蛋白质纯化过程中）蛋白质纯化过程中C C末端结构域丢失末端结构域丢失（2 2）蛋白质磷酸化引起电泳速度改变）蛋白质磷酸化引起电泳速度改变n Question5Question5：三种三种RNARNA聚合酶各亚基的功能是什么聚合酶各亚基的功能是什么?n Strategies:Strategies:n 纯化推定的各种纯化推定的各种RNARNA聚合酶的亚基，聚合酶的亚基，重组成有活性的酶，从而判断各亚重组成有活性的酶，从而判断各亚基是否必需基是否必需;X亚基太多亚基太多n Strategies:Strategies:n 序列比对，通过同源性推断各

26、亚基序列比对，通过同源性推断各亚基的功能；的功能；Regions of homology between yeast Rpb1 and the Regions of homology between yeast Rpb1 and the E.coli E.coli polymerase polymerase subunit and between Rpb2 and the subunit and between Rpb2 and the E.E.colicolipolymerase polymerase subunit.subunit.The regions of homology are s

27、hown as red boxes;the carboxyl terminal domain(CTD)in Rpb1 is in green.Rpb1Rpb2ProkaryoticBacteria ArcheaEukaryoticRNAP1RNAPRNAPA/ABDLK+6 othersRPA1RPA2RPC5RPC9RPB6RPB1RPB2RPB3RPB11RPB6RPC1RPC2RPC5RPC9RPB9+9 others+7 others+11 othersn Strategies:Strategies:n 序列比对，通过同源性推断各亚基序列比对，通过同源性推断各亚基的功能；的功能；n 克

28、隆各种克隆各种RNA聚合酶的亚基，聚合酶的亚基，逐逐个突变，判断哪些亚基是聚合酶酶个突变，判断哪些亚基是聚合酶酶活性的必需组分。活性的必需组分。共有亚基共有亚基核心亚基核心亚基非必需亚基非必需亚基真核生物真核生物RNARNA聚合酶聚合酶各亚基发挥的作用各亚基发挥的作用n Question6Question6：真核真核RNARNA聚合酶的三维结构是什么样子聚合酶的三维结构是什么样子?中山大学诺贝尔大师系列讲坛中山大学诺贝尔大师系列讲坛n Patrick Cramer,David A.Bushnell,Roger D.Kornberg.Structural Basis of Transcripti

29、on:RNA Polymerase II at 2.8 ngstrom Resolution.Science 2001;292:1863-1876.n Averell L.Gnatt,Patrick Cramer,Jianhua Fu,David A.Bushnell,Roger D.Kornberg.Structural Basis of Transcription:An RNA Polymerase II Elongation Complex at 3.3 Resolution.Science 2001;292:1876-1882.He created three-dimensional

30、images of RNA Polymerase II using X-ray crystallographyNobel Prize is not hereditary nOn November 21,1943,Kornberg married Sylvy Ruth Levy,also a biochemist of note.She worked closely with Kornberg and contributed significantly to the discovery of DNA polymerase.The day after Arthur Korberg was awar

31、ded the Nobel prize,she was quoted in a newspaper as saying I was robbed.The Family of ScientistsnArthur and Sylvy Kornberg had three sons:Roger David Kornberg(1947),Thomas B.Kornberg(1948),and Kenneth Andrew Kornberg(1950).Thomas discovered DNA polymerase II and III in 1970 and is now a professor a

32、t the University of California,San Francisco.Kenneth is an architect specializing in the design of biomedical and biotechnology laboratories and buildings.The Family of ScientistsLate in 1957,Kornbergs manuscripts describing the test-tube synthesis of DNA from precursor molecules by an enzyme DNA po

33、lymerase were rejected by The Journal of Biological Chemistry.Reviewers thought it premature to call the product DNA.In the spring of 1958,however,a new editor stepped in and accepted the papers.Less than two years later,Kornbergs discovery,were recognized by the Nobel Prize in Physiology or Medicin

34、e.Nature 450,809(6 December 2007)Nature 450,809(6 December 2007)Nature 450,1176(20 December 2007)真核生物真核生物RNARNA聚合酶的三维结构特征聚合酶的三维结构特征T.aquatics(水生嗜热菌水生嗜热菌)S.cerevisiae原核生物与真核生物原核生物与真核生物RNA聚合酶聚合酶晶体结构对比晶体结构对比n Question Question：细胞中各种细胞中各种RNARNA的含量：的含量：rRNArRNA约占约占80%80%，tRNAtRNA占占15%15%，mRNAmRNA占占3-5%3-

35、5%，分别由，分别由RNARNA聚合酶聚合酶、转录（转录（5.8S rRNA5.8S rRNA除外）；但除外）；但RNARNA聚合酶聚合酶、的比例大概是：的比例大概是：10:12:2510:12:25（yeastyeast），），为什么为什么mRNAmRNA的比例那么少的比例那么少？n Possible Answers Possible Answers：n 翻译过程是非常高效的，翻译过程是非常高效的，一条一条mRNAmRNA可翻可翻译出很多蛋白质译出很多蛋白质。n mRNA mRNA的产物是蛋白质，是细胞活动的执的产物是蛋白质，是细胞活动的执行者和决定者，每时每刻细胞内蛋白质的行者和决定者，每

36、时每刻细胞内蛋白质的种类和数量都是精确调控的。因此，种类和数量都是精确调控的。因此，mRNAmRNA转录的开启必需受到严格的控制转录的开启必需受到严格的控制。二、真核生物基因的启动子二、真核生物基因的启动子转录必需因素：转录必需因素：n DNA DNA模板模板n RNA RNA聚合酶聚合酶n 启动子启动子n 转录因子转录因子转录启动所依赖的转录启动所依赖的DNADNA序列序列n 真核真核RNARNA聚合酶识别的启动子聚合酶识别的启动子n I I 类启动子类启动子RNARNA聚合酶聚合酶I I识别识别n II II 类启动子类启动子RNARNA聚合酶聚合酶IIII识别识别n III III类启动

37、子类启动子RNARNA聚合酶聚合酶IIIIII识别识别n 5类元件，后类元件，后4类是核心类是核心启动子元件启动子元件n 上游元件（上游元件（upstream elementupstream element）n TFBTFB识别元件（识别元件（BREBRE）n TATA boxTATA boxn 起始子（起始子（initiatorinitiator）n 下游元件（下游元件（downstream elementdownstream element）n IIII类启动子（蛋白质等基因的启动子）类启动子（蛋白质等基因的启动子）+1-33n IIII类启动子类启动子n 与原核生物的启动子最为相似与原核

38、生物的启动子最为相似Up element-33-10 box(TATA)-35 box(TTGACa)-10 因子识别位点因子识别位点TBP识别识别TFB识别识别+1n TATA boxTATA boxn 位于转录起始位点上游约位于转录起始位点上游约25-30 bp25-30 bp（在酵（在酵母中可达母中可达30 300 bp30 300 bp），共同序列为），共同序列为TATAAATATAAA；n 功能：功能：确定转录起始位点确定转录起始位点（TATATATA区下游区下游25-30 bp25-30 bp左右）；有时甚至是决定整个启左右）；有时甚至是决定整个启动子是否有活性。动子是否有活性。E

39、ffects of deletions in the SV40 early promoter箭头代表缺失的区域箭头代表缺失的区域TATA box缺失后导致转录可缺失后导致转录可在多个位点起始。在多个位点起始。S1核酸酶作图法：参见核酸酶作图法：参见5.4章节章节缺失扫描缺失扫描是启动子定位的最常用研究方法Zhou et al,Oncogene 2011定点突变定点突变是鉴定转录因子结合位点的最常用方法Xu et al,Hepatology 2010n TATA boxTATA boxn 有些基因的有些基因的TATAboxTATAbox序列中会出现序列中会出现G G和和C C，如如beta-be

40、ta-球蛋白基因球蛋白基因(CATA).(CATA).n 有两类基因甚至缺乏有两类基因甚至缺乏TATA box:TATA box:n 看家基因（看家基因（housekeeping genehousekeeping gene）n 发育调节基因（发育调节基因（homeotic genehomeotic gene）n 特异性基因（特异性基因（specialized genespecialized gene，又称奢，又称奢侈基因）一般都有侈基因）一般都有TATA boxTATA box。WhyWhy？n TFB识别元件（识别元件（BRE）n 位于位于TATA boxTATA box上游，保守序列为上游

41、，保守序列为 (G/C)(G/C)(G/A)CGCC(G/C)(G/C)(G/A)CGCC。n 起始子（起始子（initiator）n 转录起始位点前后的保守序列转录起始位点前后的保守序列n 共同序列为：共同序列为：PyPyANT/APyPyn 下游元件（下游元件（downstream elementdownstream element）n 位于转录起始位点下游，无共同序列位于转录起始位点下游，无共同序列n 上游元件（上游元件（upstream element）n GC boxes：富含：富含G和和C，如，如GGGCGG（-47 -61 region）和）和CCGCCC（-80 -105 re

42、gion），可有），可有2个或更多的拷贝个或更多的拷贝n CCAAT box：共同序列为：共同序列为CCAAT，由转由转录因子录因子CCAAT结合蛋白（结合蛋白（CTF）识别。）识别。u Note：GC box与与CCAAT box介于启动子与介于启动子与增强子之间，它们没有方向依赖性增强子之间，它们没有方向依赖性(增强子增强子性质性质)，但具有位置依赖性，但具有位置依赖性(启动子性质启动子性质)。u在大多数启动子中，至少会缺失其中一在大多数启动子中，至少会缺失其中一个元件。缺少个元件。缺少TATA box的启动子通常含的启动子通常含有有DPE；u高效表达特异基因的启动子通常含有高效表达特异基

43、因的启动子通常含有TATA box。n I I 类启动子（类启动子（rRNArRNA前体基因的启动子）前体基因的启动子）n 核心元件（核心元件（core elementcore element）；）；n 上游启动子元件（上游启动子元件（UCEUCE）。）。I I 类启动子的特点：类启动子的特点：n 物种之间序列差异较大；物种之间序列差异较大；n 两个元件之间的距离很重要。两个元件之间的距离很重要。n III III 类启动子（类启动子（tRNAtRNA等基因的启动子）等基因的启动子）n 典型的典型的III III 类启动子在基因内部类启动子在基因内部n “非典型非典型”III III 类启动子

44、类似于类启动子类似于II II 类启动子类启动子n 增强子增强子(Enhancer)与沉默子与沉默子(Silencer)n 无方向和位置依赖的无方向和位置依赖的DNA元件，与元件，与DNA结合蛋白作用而调节转录。结合蛋白作用而调节转录。n 增强子促进转录，沉默子抑制转录增强子促进转录，沉默子抑制转录n 具有组织特异性具有组织特异性n 其活性依赖于其活性依赖于DNADNA结合蛋白结合蛋白n 增强子和沉默子并不是绝对的，有时增增强子和沉默子并不是绝对的，有时增强子可变现出沉默子活性。强子可变现出沉默子活性。预习内容预习内容“转录的过程转录的过程”n 原核生物与真核生物转录的异同原核生物与真核生物转录的异同 n DNADNA转录与转录与DNADNA复制的异同复制的异同See the movie思考题：有没有思考题：有没有2 2种或种或3 3种以上种以上RNARNA聚合酶的生物？聚合酶的生物？ProkaryoticBacteria ArcheaEukaryoticRNAP1RNAPRNAPA/ABDLK+6 othersRPA1RPA2RPC5RPC9RPB6RPB1RPB2RPB3RPB11RPB6RPC1RPC2RPC5RPC9RPB9+9 others+7 others+11 others