免疫胶体金技术课件.ppt

1、免疫胶体金技术免疫胶体金技术Immunogold Technique一一.概述概述(一一)发展历史发展历史u 1971年年 Faulk和和Taylon 用兔抗沙门氏菌抗血清与胶用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合体金颗粒结合,制备成金标抗体制备成金标抗体,检测细菌表面抗原的检测细菌表面抗原的分布分布u 1975年年 Horisberger等等 把胶体金技术推广应用于扫把胶体金技术推广应用于扫描电镜、透射电镜及冰冻蚀刻电镜的研究描电镜、透射电镜及冰冻蚀刻电镜的研究u 1978年年 Geoghegan 发表了胶体金标记物在光镜发表了胶体金标记物在光镜水平的应用水平的应用u 1981年年 Dansc

2、her 建立了银显影液增强，光镜建立了银显影液增强，光镜 下金颗粒可见性的方法下金颗粒可见性的方法u 1983年年 Moeremans等等 在蛋白质转移电泳中应用在蛋白质转移电泳中应用了免疫金银染色法了免疫金银染色法 u 1986年年 Fritz等等 在免疫金银法基础上成功进行了在免疫金银法基础上成功进行了彩色免疫金银染色彩色免疫金银染色 免疫胶体金技术免疫胶体金技术以胶体金为标记物应用在免疫组织化学研以胶体金为标记物应用在免疫组织化学研究中，对细胞表面或细胞内的多糖、糖蛋究中，对细胞表面或细胞内的多糖、糖蛋白、蛋白质、多肽、激素和核酸等生物大白、蛋白质、多肽、激素和核酸等生物大分子进行定位研

3、究分子进行定位研究（二）胶体金的基本概念（二）胶体金的基本概念胶体金，一般指金的水溶液，又称金溶胶。胶体金，一般指金的水溶液，又称金溶胶。-金以微小的粒子分散在水中所形成的金金以微小的粒子分散在水中所形成的金 溶胶。其中分散的金颗粒直径在溶胶。其中分散的金颗粒直径在1100nm 之间。之间。二二.胶体金的制备胶体金的制备(一一)可用多种方法制备胶体金可用多种方法制备胶体金1.分散法分散法:包括机械分散法、超声波法、电分包括机械分散法、超声波法、电分散法和胶溶法等散法和胶溶法等2.凝聚法凝聚法:包括物理凝聚法、化学凝聚法（氧包括物理凝聚法、化学凝聚法（氧化法、水解法和还原法）化法、水解法和还原法

4、）其中应用最多的是其中应用最多的是化学还原法化学还原法 化学还原法化学还原法【基本原理】【基本原理】在氯化金水溶液中加入一定量的还在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子。在适当条件下，原剂，使金离子还原为金原子。在适当条件下，还原的金原子凝聚成一定大小的金颗粒，形成还原的金原子凝聚成一定大小的金颗粒，形成金溶胶。金溶胶。【常用还原剂】【常用还原剂】柠檬酸钠、鞣酸、白磷等柠檬酸钠、鞣酸、白磷等柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，15150nm白磷还原制备的金颗粒直径较小，白磷还原制备的金颗粒直径较小，312nm【具体制备方法【具体制备方法】（二）

5、影响溶胶稳定性的因素（二）影响溶胶稳定性的因素u 电解质电解质u 胶体金浓度胶体金浓度u 温度温度u 大分子物质大分子物质 （三）胶体金的鉴定（三）胶体金的鉴定【鉴定方法】【鉴定方法】在电镜下观察金颗粒的大小在电镜下观察金颗粒的大小及金颗粒的均匀程度及金颗粒的均匀程度【鉴定方法】【鉴定方法】将胶体金滴在覆有将胶体金滴在覆有Formvar膜或碳膜或碳-Formvar膜的镍网上，空气干燥，膜的镍网上，空气干燥，透射电镜下观察，拍照，测量金颗粒的透射电镜下观察，拍照，测量金颗粒的直径，并计算直径，并计算100个以上胶体金颗粒直径个以上胶体金颗粒直径的平均值及标准差的平均值及标准差（四）制备胶体金的注

6、意事项（四）制备胶体金的注意事项1.玻璃器皿的清洁玻璃器皿的清洁2.试剂配制试剂配制3.影响胶体金颗粒大小的因素影响胶体金颗粒大小的因素 玻璃器皿清洗玻璃器皿清洗清洁液浸泡清洁液浸泡24h 流水冲流水冲蒸馏蒸馏水反复洗涤水反复洗涤晾干晾干应尽量使用分析纯试剂应尽量使用分析纯试剂各种水溶液必须用三蒸水或去离子水配制各种水溶液必须用三蒸水或去离子水配制加入还原剂的速度加入还原剂的速度搅拌是否均匀搅拌是否均匀制备胶体金所用的烧瓶大小制备胶体金所用的烧瓶大小三三.胶体金探针的制备胶体金探针的制备(一一)胶体金与蛋白质结合的原理胶体金与蛋白质结合的原理胶体金标记蛋白质的过程胶体金标记蛋白质的过程,实际上

7、是蛋白质在等电实际上是蛋白质在等电点或稍偏碱时点或稍偏碱时,被吸附于胶体金颗粒表面被吸附于胶体金颗粒表面.（二）胶体金的预处理二）胶体金的预处理 标记之前将胶体金的标记之前将胶体金的PH值调至待标蛋白质值调至待标蛋白质的等电点或略偏碱的等电点或略偏碱调节调节PH的方法：的方法：当需要提高胶体金的当需要提高胶体金的PH值时，用值时，用0.2mol/L K2CO3或或0.1mol/L KOH 当需要降低胶体金的当需要降低胶体金的PH值时值时,用用0.1M HCL或醋酸或醋酸 (三三)待标记蛋白质的处理待标记蛋白质的处理1.透析除盐透析除盐:将蛋白质溶液装入透析袋中将蛋白质溶液装入透析袋中,放放 在

8、蒸馏水中透析在蒸馏水中透析,4过夜过夜2.离心离心:10000 r/min,4,1h,去除蛋白质聚去除蛋白质聚 合物等沉淀合物等沉淀(四四)胶体金蛋白质最佳结合率测定胶体金蛋白质最佳结合率测定 不同直径的金颗粒不同直径的金颗粒,及不同分子量大小的及不同分子量大小的蛋白质蛋白质,其结合的比例是不同的其结合的比例是不同的常用的检测二者结合量的方法有常用的检测二者结合量的方法有目测法目测法和和光光电比色法电比色法1.目测法目测法 先将待标记蛋白质逐级稀释先将待标记蛋白质逐级稀释 取一批小试管，编号，每管内加已调好取一批小试管，编号，每管内加已调好PH的胶的胶体金体金100ul 按从低按从低高的浓度，

9、将已稀释好的蛋白溶液，高的浓度，将已稀释好的蛋白溶液，分别加入已编号的试管中，对照管只加不含蛋白分别加入已编号的试管中，对照管只加不含蛋白的稀释液，混匀，静置的稀释液，混匀，静置5 10 min 各管分别加各管分别加10%NaCl 10l，混匀，静置混匀，静置2hr，观察结果观察结果123 4576胶体金胶体金(ml)1 1 1 1 1 1 1蛋白质蛋白质(ug)5 10 15 20 25 30 3510%NaCl 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 结果判断结果判断:对照管或加入蛋白量不足，胶体金出对照管或加入蛋白量不足，胶体金出现由红变蓝的凝聚现象；加入蛋白质量达到或超

10、过现由红变蓝的凝聚现象；加入蛋白质量达到或超过稳定量，则胶体金保持红色不变稳定量，则胶体金保持红色不变2.光电比色法光电比色法利用分光光度计测各管利用分光光度计测各管580nm的的OD值值,然后以然后以OD值为纵坐标值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标作一曲线蛋白质浓度为横坐标作一曲线,取曲取曲线最先与横轴相接近的那一点的蛋白质浓度线最先与横轴相接近的那一点的蛋白质浓度,即为即为最适稳定量最适稳定量.(五）标记五）标记1.计算所需待标记蛋白质的总量计算所需待标记蛋白质的总量 根据用以标记的胶体金溶液总体积及所测定的最根据用以标记的胶体金溶液总体积及所测定的最适蛋白质稳定量，计算出所需待标记蛋白质的总

11、量适蛋白质稳定量，计算出所需待标记蛋白质的总量2.调节调节PH：根据所标记蛋白质的等电点来调节胶根据所标记蛋白质的等电点来调节胶体金的体金的 PH常用几种蛋白质标记时胶体金的常用几种蛋白质标记时胶体金的 PH蛋白质蛋白质 PH 抗体抗体 9.0 SPA 6.0过氧化物酶过氧化物酶 8.0低密度脂蛋白低密度脂蛋白 5.53.磁力搅拌下，逐滴加入蛋白质溶液，作磁力搅拌下，逐滴加入蛋白质溶液，作用用 515min4.继续磁力搅拌，加入继续磁力搅拌，加入5牛血清白蛋白，牛血清白蛋白，使其终浓度为使其终浓度为1，搅拌，搅拌10min；也可加也可加3聚乙二醇，使其终浓度为聚乙二醇，使其终浓度为0.05（六

12、）标记探针的纯化（六）标记探针的纯化u 纯化的目的纯化的目的 去除溶液中未标记的去除溶液中未标记的 蛋白质，未充分稳定的胶蛋白质，未充分稳定的胶体金，以及在标记过程中可能产生的各种聚合物体金，以及在标记过程中可能产生的各种聚合物u 纯化的方法纯化的方法 超速离心法超速离心法和和凝胶过滤法凝胶过滤法 1.超速离心法超速离心法速度快，适合大样品的制备速度快，适合大样品的制备 离心离心 1500 r min，20min 弃沉淀弃沉淀 超速离心超速离心 4 1h 弃上清弃上清 沉淀用沉淀用PBS或或TBS缓冲液（含缓冲液（含0.1牛血清白蛋牛血清白蛋白重新悬浮至原体积的白重新悬浮至原体积的 1 101

13、 20 离心离心 1500 r min，20min 弃沉淀弃沉淀 分装分装 4 保存保存2.凝胶过滤法凝胶过滤法u 将探针溶液装入透析袋内，将探针溶液装入透析袋内，4，置于硅胶或聚乙，置于硅胶或聚乙二醇中浓缩至原体积的二醇中浓缩至原体积的1 41 5u 离心离心 1500 r min，20min 弃沉淀弃沉淀u 经经Sephacryl（丙烯葡聚糖）丙烯葡聚糖）S400层析柱分离纯化。层析柱分离纯化。用用0.02mol/L TBS(0.1%BSA)洗脱洗脱 TBS的的PH根据蛋白质种类而定根据蛋白质种类而定u 按红色深浅分管收集洗脱液按红色深浅分管收集洗脱液 (七七)标记探针的鉴定标记探针的鉴定

14、1.负染色检查负染色检查:将胶体金溶液滴在覆有将胶体金溶液滴在覆有Formavar膜膜(支持膜支持膜)的镍网上的镍网上,空气中干燥空气中干燥,醋醋酸铀负染酸铀负染,透射电镜下观察透射电镜下观察2.生物活性鉴定生物活性鉴定:可用直接或间接法放射免疫可用直接或间接法放射免疫测定测定,凝聚试验及免疫组化染色进行鉴定凝聚试验及免疫组化染色进行鉴定四四.免疫胶体金染色方法免疫胶体金染色方法 (一一)免疫金染色法免疫金染色法 Immunogold staining,IGS【基本原理】【基本原理】1.直接法直接法-将胶体金标记的一抗直接对标本进行染色将胶体金标记的一抗直接对标本进行染色,然后在光镜或电镜下观

15、察然后在光镜或电镜下观察 方法简单方法简单,但一种探针仅限于检测一种抗原但一种探针仅限于检测一种抗原,较局限较局限 2.间接法间接法-先将未标记的特异性一抗与标本中的抗原先将未标记的特异性一抗与标本中的抗原结合结合,然后加金标二抗或然后加金标二抗或SPA与一抗结合与一抗结合,在光镜或电在光镜或电镜下对抗原的分布进行定位研究镜下对抗原的分布进行定位研究【特点】【特点】1.阳性部位显红色阳性部位显红色 2.染色程序简便染色程序简便,不需显色或显影过程不需显色或显影过程 3.但一般要求金颗粒的直径但一般要求金颗粒的直径20nm,并要求用并要求用 高浓度的免疫金溶液高浓度的免疫金溶液 (二二)免疫金银

16、染色法免疫金银染色法Immunogold silver staining,IGSS1983年年 Holgate及其同事在及其同事在IGS的基础上与银显影方法的基础上与银显影方法相结合相结合,建立了免疫金银法建立了免疫金银法【基本原理】【基本原理】经免疫反应沉积在抗原位点处的胶体金经免疫反应沉积在抗原位点处的胶体金颗粒作为一种催化剂，在对苯二酚存在的情况下，将颗粒作为一种催化剂，在对苯二酚存在的情况下，将显影液中的银离子催化还原成银原子，可将抗原位点显影液中的银离子催化还原成银原子，可将抗原位点清楚显示出来清楚显示出来1.光镜免疫金银法光镜免疫金银法3 在免疫金染色的基础上增加物理显影的步骤在免

17、疫金染色的基础上增加物理显影的步骤3 显影液的配制及显影过程应在暗处进行显影液的配制及显影过程应在暗处进行3 阳性部位呈黑色颗粒状阳性部位呈黑色颗粒状2.电镜免疫金银法电镜免疫金银法 包埋前染色包埋前染色,包埋后染色包埋后染色【IGSS法优点法优点】1.可被用于光镜和电镜观察可被用于光镜和电镜观察 2.敏感性高敏感性高 3.定位准确定位准确 4.背景清晰背景清晰,对比度好对比度好 5.方法简便方法简便,安全安全 6.成本较低成本较低,标本可长期保存标本可长期保存 (三三)彩色免疫金银染色法彩色免疫金银染色法 Coloured IGSS,CIGSS【基本原理】【基本原理】组织切片经组织切片经IG

18、SS染色后染色后,抗原抗体反应部位生成抗原抗体反应部位生成的银颗粒通过铁氰化钾和溴化钾的作用的银颗粒通过铁氰化钾和溴化钾的作用,使银原子被使银原子被氧化生成金属银氧化生成金属银;而彩色显影剂本身则被氧化而彩色显影剂本身则被氧化,其氧其氧化产物使彩色剂由无色变为有色染料化产物使彩色剂由无色变为有色染料,并沉积在银颗并沉积在银颗粒的部位粒的部位,而银颗粒被溶解而银颗粒被溶解【优点】【优点】特异性高特异性高,彩色影象鲜明彩色影象鲜明,应用范围广应用范围广五五.免疫胶体金技术的特点免疫胶体金技术的特点1.胶体金制备简便胶体金制备简便2.标记简单标记简单3.特异性强特异性强4.敏感性高敏感性高5.定位准确定位准确6.适应性广适应性广7.易于双重和多重标记易于双重和多重标记