免疫学检测与防治-医学免疫学课件.pptx

1、免疫学检测技术免疫学预防，免疫学治疗第一部分 免疫学检测技术抗体效应细胞抗原抗体反应细胞功能检测一、抗原抗体反应Ag/AbAg/Ab反应的特反应的特点点Ag/AbAg/Ab反应的特点反应的特点 1.高度特异性2.反应可逆3.适宜的Ag/Ab比例与浓度4.分为两个阶段Ag/AbAg/Ab反应的影响因素反应的影响因素盐离子浓度/离子强度温度酸碱度检测抗原或抗体的体外试验1、凝聚反应直接凝聚反应本身为颗粒性抗原检测抗原或抗体的体外试验1.凝聚反应间接凝聚反应吸附到相应载体上凝聚抑制试验检测抗原或抗体的体外试验2、沉淀反应单向琼脂扩散（定量）检测抗原或抗体的体外试验2、沉淀反应双向琼脂扩散检测抗原或抗

2、体的体外试验3、免疫标记技术抗原或抗体标记示踪物免疫酶测定检测抗原或抗体的体外试验3、免疫标记技术示踪物免疫酶测定直接法，间接法，夹心法ELISABAS-ELISA利用生物素-亲和素放大系统检测抗原或抗体的体外试验3、免疫标记技术示踪物免疫酶测定BAS-ELISA检测抗原或抗体的体外试验3、免疫标记技术示踪物免疫酶测定免疫组化Fast red检测抗原或抗体的体外试验3、免疫标记技术示踪物免疫荧光检测抗原或抗体的体外试验3、免疫标记技术示踪物放射免疫 是用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。是用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。常用的放射性核素有常用的放射性核素有131131I I、1

3、25125I I等。等。检测抗原或抗体的体外试验3、免疫标记技术示踪物免疫发光化学发光酶促发光检测抗原或抗体的体外试验3、免疫标记技术示踪物免疫发光生物发光电化学发光检测抗原或抗体的体外试验3、免疫标记技术示踪物免疫胶体金检测抗原或抗体的体外试验3、免疫标记技术示踪物免疫胶体金金标HBsAg HBsAg 羊抗HBsAg多抗（抗体）检测抗原或抗体的体外试验3、免疫标记技术示踪物免疫印迹检测抗原或抗体的体外试验3、蛋白质芯片二、免疫细胞的功能检测PBMC分离Ficoll分离（葡聚糖-泛影葡胺）二、免疫细胞的功能检测磁珠分离通过抗体结合表面分子捕获细胞二、免疫细胞的功能检测流式细胞术通过抗体结合表面

4、分子标识细胞Green Fluorescence IntensityNumber of CellsUnstained cellsFITC-labeled cellsRed Fluorescence IntensityGreen Fluorescence IntensityTwo Parameter HistogramAgFluorochromeLabeled Anti-IgTissue SectionUnlabeledAbFlowTipLaserFLDetectorLightScatterDetectorcell二、免疫细胞的功能检测抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL免疫细胞功能测定1、T

5、细胞功能测定体外法 ：T细胞增殖试验 形态学检查 3H-TdR/125I-UdR掺入法 MTT比色法体内法：迟发型超敏反应（DTH）OT-PPD皮试（结核菌素实验）SD-SK皮试（链激酶-链道酶实验）形态学检查活化后细胞形态改变 PHA刺激4872小时3H-TdR掺入法培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性丝裂原刺激后DNA和RNA合成增加MTT比色法T细胞活化后线粒体中的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为紫褐色的甲臜颗粒DTH皮试试验免疫细胞功能测定2、B细胞功能测定分泌抗体的检测抗体形成细胞测定，常用溶血红斑试验 免疫细胞功能测定2、B细胞功能测定抗体形成细胞ELISPOT测

6、定靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时免疫细胞功能测定3、细胞毒性试验细胞杀伤试验51Cr释放法免疫细胞功能测定3、细胞毒性试验细胞杀伤试验乳酸脱氢酶释放法刃天青试卤灵硫辛酰胺脱氢酶免疫细胞功能测定3、细胞毒性试验细胞杀伤试验细胞染色法免疫细胞功能测定3、细胞毒性试验细胞杀伤试验凋亡细胞检测法 凋亡是一种重要的生理和病理过程，凋亡细胞形态学特征表现为体积变小，细胞变园，与周围细胞脱落、失去微绒毛，胞质浓缩，内质网扩张，核仁消失，核染色质浓缩程半月形或斑块状，出现核着边现象，出现凋亡小体免疫细胞功能测定3、细胞毒性试验细胞杀伤试验凋亡细胞检测法

7、 梯度凝胶电泳 细胞凋亡时主要的生化特征是细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩其染色质发生浓缩,染色质染色质DNA在在核小体单位之间的连接处断裂核小体单位之间的连接处断裂,形形成成50300kb长的长的DNA大片段大片段,或或180200bp整数倍的寡核苷酸片段整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱谱(DNA ladder)。免疫细胞功能测定3、细胞毒性试验细胞杀伤试验凋亡细胞检测法 FACS亚二倍体细胞检测免疫细胞功能测定3、细胞毒性试验细胞杀伤试验凋亡细胞检测法 TUNEL法 细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH

8、末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测 免疫细胞功能测定3、吞噬功能测定氯化硝基四氮唑蓝（NBT）试验：中性粒细胞的杀伤效应 NBT甲臜颗粒巨噬细胞吞噬试验：巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)或荧光颗粒进行吞噬检测免疫细胞功能测定4、细胞因子检测生物活性检测：增殖或增殖抑制；细胞病变抑制法 免疫学检测：ELISA检测，胞内细胞因子流式细胞术检测，ELISPOT检测第二部分 免疫学防治 根据免疫学原理，利用物理、化学和生物学的手段人

9、为地增强或抑制机体的免疫功能，达到预防和治疗疾病目的的措施。How to get immunity to the diseases?How to get immunity to the diseases?自然免疫自然免疫主动主动被动被动人工免疫人工免疫主动主动被动被动获得免疫的途径获得免疫的途径n人工主动免疫人工主动免疫（Artificial active immunity）给机体输入给机体输入抗原性物质抗原性物质，激活机体的免疫应答，使机体自身，激活机体的免疫应答，使机体自身产生抵抗疾病的能力。产生抵抗疾病的能力。n人工被动免疫人工被动免疫（Artificial passive immuni

10、ty）将对疾病有免疫力的供者的将对疾病有免疫力的供者的免疫应答产物免疫应答产物转移给受者，或自转移给受者，或自体免疫细胞体外处理后回输自身，以预防或治疗疾病。体免疫细胞体外处理后回输自身，以预防或治疗疾病。第一节 免疫预防疫疫 苗苗概念：疫苗是利用微生物及其代谢产物，概念：疫苗是利用微生物及其代谢产物，经过人工减毒或灭活或基因工程等经过人工减毒或灭活或基因工程等 方法制成，用于预防疾病的人工主方法制成，用于预防疾病的人工主 动免疫制剂。动免疫制剂。疫疫 苗苗疫苗的基本要求疫苗的基本要求 1.安全：安全：无致病性、致癌性，避免无关蛋白和内毒素污染，推崇口服或尽量减少注射次数；2.有效：有效：保护

11、性免疫以 体液或细胞免疫为主或两者兼备；能引起显著的免疫记忆，维持时间很长；3.实用：实用：接种简单、易于保存运输、价格低廉。疫苗的分类疫苗的分类减毒活疫苗减毒活疫苗灭活疫苗灭活疫苗类毒素疫苗类毒素疫苗 亚单位疫苗亚单位疫苗DNADNA疫苗疫苗可食用疫苗可食用疫苗减毒活疫苗减毒活疫苗 是用减毒或无毒力的是用减毒或无毒力的活病原微生物活病原微生物制成。制成。卡介苗、口服小儿麻痹疫苗（糖丸）卡介苗、口服小儿麻痹疫苗（糖丸）优点：优点：模拟自然感染，一般只需接种一次。模拟自然感染，一般只需接种一次。免疫原性强、免疫效果好免疫原性强、免疫效果好 缺点：缺点：可能出现毒力回复突变可能出现毒力回复突变减毒

12、活疫苗减毒活疫苗牛型结核杆菌牛型结核杆菌 Mycobacterium bovis 置于含胆汁的置于含胆汁的培养基，逐渐培养基，逐渐增加胆汁的浓增加胆汁的浓度度卡介苗卡介苗 Bacillus Calmette-Guerin （BCG）在胆汁中适应性生在胆汁中适应性生长，充分减毒成为长，充分减毒成为预防肺结核的疫苗。预防肺结核的疫苗。13年年230次传代次传代法国科学家法国科学家CalmetteGuerin灭活疫苗灭活疫苗 选用免疫原性强的病原体，经人工大量培养后，选用免疫原性强的病原体，经人工大量培养后，用理化方法灭活制成。又称用理化方法灭活制成。又称“死疫苗死疫苗”。如：流感疫苗、甲肝疫苗如：

13、流感疫苗、甲肝疫苗 优点：优点：安全安全 缺点：缺点：免疫原性较差，主要诱导特异性抗体的免疫原性较差，主要诱导特异性抗体的 产生；需加强免疫。产生；需加强免疫。流感疫苗制备流程流感疫苗制备流程死疫苗和活疫苗的比较 区别点 灭活疫苗 减毒活疫苗制剂特点死、强毒株活、弱毒或无毒接种剂量及次数较多，2-3次较少，1次副作用较大较小保存及有效期易保存，较稳定易失效，4保存免疫效果较差，维持数月至2年较好，维持3-5年或更长类毒素疫苗类毒素疫苗 类毒素是用细菌的外毒素经类毒素是用细菌的外毒素经0.30.4%甲醛处理制甲醛处理制成。如破伤风、百日咳、白喉类毒素疫苗成。如破伤风、百日咳、白喉类毒素疫苗亚单位

14、疫苗亚单位疫苗提取或合成天然微生物某些成分的亚单位（如外壳的特殊提取或合成天然微生物某些成分的亚单位（如外壳的特殊蛋白结构）制成的疫苗。如：乙肝疫苗、蛋白结构）制成的疫苗。如：乙肝疫苗、HPV（宫颈癌）（宫颈癌）疫苗；细菌荚膜多糖疫苗等。疫苗；细菌荚膜多糖疫苗等。优点：优点：副作用小、更为安全、稳定副作用小、更为安全、稳定缺点：缺点：免疫原性低，需与佐剂合用。免疫原性低，需与佐剂合用。乙肝病毒（乙肝病毒（HBsAg）HPV病毒（病毒（L1蛋白）蛋白）DNADNA疫苗的优缺点疫苗的优缺点优点优点：可同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答：可同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答 制备工艺简单，生产成本低

15、，适于大批制备工艺简单，生产成本低，适于大批量生产。量生产。比传统疫苗安全。比传统疫苗安全。性质稳定，易于保存、运输。性质稳定，易于保存、运输。可生产多价疫苗，同时预防多种病原体可生产多价疫苗，同时预防多种病原体感染。感染。缺点：缺点：是否整合至宿主基因组是否整合至宿主基因组,诱导癌变？诱导癌变？长期持续表达是否诱导免疫耐受？长期持续表达是否诱导免疫耐受？是否产生抗是否产生抗DNADNA抗体？抗体？佐佐 剂剂BTh2Th2AgDC浓缩抗原IL-4IL-4,5,6,诱导细胞因子产生人类疫苗中使用：氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙及百日咳杆菌等。动物试验中使用：弗氏佐剂、卡介苗、胞壁酰二肽及脂质体等。细胞

16、因子如 IL-2、IL-12、IFNg等。新型佐剂如免疫刺激复合物、含CpG寡核苷酸等。可显著增强疫苗接种后的免疫效应，或改变免疫应答类型。疫苗的应用疫苗的应用我国推行的我国推行的儿童基础免儿童基础免疫程序疫程序疫苗的主要保护机制疫苗的主要保护机制产生产生中和中和抗体抗体Th B7MHC-II TCR CD4 ICAM LFA-1APCThThBCD40L CD40分泌细胞因子ThBBB浆细胞BCR抗原Bm CD28Vaccination新疫苗的审核：新疫苗的审核：3期临床试验期临床试验 I I期：以新疫苗的的期：以新疫苗的的安全性安全性为主为主 ；期：以新疫苗的期：以新疫苗的有效性有效性为主

17、；为主；期：证明新疫苗预防传染病的期：证明新疫苗预防传染病的免疫保护性免疫保护性为主。为主。疫苗的临床试验疫苗的临床试验第二节第二节 免疫治疗免疫治疗名称名称治疗范围及特点治疗范围及特点免疫增强疗法感染、肿瘤、免疫缺陷病免疫抑制疗法移植排斥、自身免疫病、超敏反应、炎症主动免疫治疗人为提供抗原，使机体主动产生特异免疫力被动免疫治疗人为提供免疫应答的效应物质，直接发挥免疫效应特异性免疫治疗调整机体免疫功能所用制剂的作用具有抗原特异性非特异性免疫治疗 调整机体免疫功能所用制剂的作用没有抗原特异性免疫治疗的方法免疫治疗的方法细胞治疗细胞治疗分子治疗分子治疗生物应答调节剂生物应答调节剂与免疫抑制剂与免疫

18、抑制剂分子疫苗分子疫苗合成肽疫苗合成肽疫苗、重组载体疫苗重组载体疫苗和DNA疫苗疫苗可作为肿瘤和感染性疾病的治疗性疫苗抗体抗体多克隆抗体多克隆抗体抗感染的免疫血清、抗淋巴细胞丙种球蛋白；单克隆抗体与基因工单克隆抗体与基因工程抗体程抗体抗细胞表面分子、CK单抗及抗体靶向治疗细胞因子细胞因子外源性外源性CK治疗治疗如IFNa对毛细胞白血病疗效显著；IFNb可延缓多发性硬化症CK拮抗疗法拮抗疗法如用TNFa受体治疗类风湿关节炎；rsIL-1R可抑制器官移植排斥抗体为基础的免疫治疗抗体为基础的免疫治疗抗毒素抗毒素(antitoxin(antitoxin）用细菌外毒素多次免疫马后获得免疫马血清，血清中含

19、有大用细菌外毒素多次免疫马后获得免疫马血清，血清中含有大量能中和该外毒素的量能中和该外毒素的IgGIgG类抗体，经浓缩纯化获得抗毒素。如：白类抗体，经浓缩纯化获得抗毒素。如：白喉抗毒素、破伤风抗毒素喉抗毒素、破伤风抗毒素 用途：治疗、紧急预防用途：治疗、紧急预防人特异性免疫球蛋白人特异性免疫球蛋白 来源：恢复期病人、含高效价来源：恢复期病人、含高效价特异性抗体特异性抗体的供血者的供血者 接受类毒素和疫苗免疫者的血浆接受类毒素和疫苗免疫者的血浆丙种球蛋白（丙种球蛋白（g g-globulin-globulin）胎盘丙种球胎盘丙种球蛋白、人血浆丙种球蛋白蛋白、人血浆丙种球蛋白 来源来源：健康人静脉

20、血：健康人静脉血 健康产妇胎盘健康产妇胎盘血（脐血）血（脐血）用途用途：用于多种病毒性疾病的防治，治疗先：用于多种病毒性疾病的防治，治疗先天性丙种天性丙种球球蛋白缺乏症，可提高对某些严重细菌性和病蛋白缺乏症，可提高对某些严重细菌性和病 毒性毒性疾病的疗效疾病的疗效H2003PsoriasisRaptivaGenentech/XomaC1997Non-Hodgkins LymphomaRituxanBiogenIdec/Genentech/RocheM2003Non-Hodgkins Lymphoma BexxarCorixa/GlaxoSmithKlineC2004Colorectal Can

21、cerErbitux BMS/ImClone SystemsH2003Asthma XolairNovartis/Genentech/TanoxPD2002Rheumatoid ArthritisHumiraAbbott/CATH2001Chronic Lymphocytic LeukemiaCampathSchering/ILEX OncologyH2000Acute Myleoid LeukemiaMylotargWyethC1998Acute Transplant RejectionSimulectNovartisC1998Crohns,Rheumatoid ArthritisRemic

22、adeJ&JHH19982004Breast CancerColorectal CancerHerceptinAvastin Genentech/RocheH1998Viral Respiratory DiseaseSynagisMedImmune/AbbottH1997Acute Transplant RejectionZenapaxPDLIM2002Non-Hodgkins LymphomaZevalinBiogenIdecC1994Acute Cardiac ConditionsReoProJ&J/Eli Lilly M1986Organ Transplant RejectionOrth

23、oclone-OKTOrtho BiotechAntibody Type(2)Date of FDA ApprovalIndicationsName of Product(1)Company Name美国美国FDA批准生产用于临床治疗的单克隆抗体批准生产用于临床治疗的单克隆抗体临床用单克隆抗体临床用单克隆抗体Anti-molecule on the saface of cells antibodyAnti-cytokines monoclonal antibodyMonoclonal antibodies coupled with toxic agent.(抗体导向药物抗体导向药物/免疫毒素免

24、疫毒素)一、抗细胞表面分子抗体一、抗细胞表面分子抗体Anti-CD20 antibodies：Rituximab,Zevalin,BexxarAnti-CD3 antibodies:Othoclone(OKT3)Anti-Her-2 antibodies:Her-2/neu抗体导向药物抗体导向药物TumorMcAb-toxinMcAb-medicineMcAb-isotope 将化疗药物将化疗药物、毒素、放射性同位素等细胞毒性物质、毒素、放射性同位素等细胞毒性物质偶联到肿瘤单抗上，从而制备抗肿瘤单抗偶联物，也偶联到肿瘤单抗上，从而制备抗肿瘤单抗偶联物，也称免疫偶联物称免疫偶联物 放射免疫偶联物

25、放射免疫偶联物 90Y（钇），（钇），131I 化学偶联物化学偶联物 免疫毒素免疫毒素 植物毒素植物毒素 细菌毒素细菌毒素基因工程抗体基因工程抗体 通过DNA重组和蛋白质工程技术，在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，重新组装而成的新型抗体分子人鼠嵌和人鼠嵌和Ab人源化人源化Ab保留了天然抗体的特异性和主要生物学功能。保留了天然抗体的特异性和主要生物学功能。减少鼠源成分，其免疫原性减弱，减少副作用。减少鼠源成分，其免疫原性减弱，减少副作用。赋予抗体分子新的生物学功能。赋予抗体分子新的生物学功能。小分子抗体穿透实体瘤的能力大大增强。小分子抗体穿透实体瘤的能力大大增强。基因工程抗体优点基因工

26、程抗体优点过继免疫治疗过继免疫治疗细胞疫苗细胞疫苗造血干细胞移植造血干细胞移植包括肿瘤细胞疫苗(灭活、异构)、基因修饰的瘤苗、DC疫苗。取自体淋巴细胞经体外激活、增殖后回输患者，直接杀伤肿瘤或激发机体抗肿瘤免疫，如TIL和CIK。是癌症、造血系统疾病、自身免疫病等的重要治疗手段，可取自骨髓(杂质多，纯化困难)、外周血(数量少，必须先骨髓动员)和脐血。生物应答调节剂生物应答调节剂指具有促进或调节免疫功能的制剂，通常对免疫功能正常者无影响。已广泛用于肿瘤、感染、自身免疫病、免疫缺陷病等的治疗。免疫抑制剂免疫抑制剂能抑制机体的免疫功能，常用于防止移植排斥反应的发生和自身免疫病的治疗。包括化学合成药物(糖皮质激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤)、微生物制剂(CsA、FK-506、MMF、RAPA)。课后作业：1.简述抗原抗体反应特点及其影响因素。2.简述人工免疫与自然免疫的定义及分离。检测抗原或抗体的体外试验2、沉淀反应免疫电泳检测抗原或抗体的体外试验2、沉淀反应火箭电泳