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1、免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍主要内容主要内容免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍一一.免疫组化的发展简史免疫组化的发展简史二二.免疫组化的原理免疫组化的原理三三.免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程四四.免疫组化的结果分析免疫组化的结果分析免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍一一.发展简史发展简史19411941年年 Coons Coons 首先用荧光素标记抗体首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。6060年代年代 AkankeAkanke建立酶标抗体技术建立酶标抗体技术铁蛋白标记铁蛋白标记AbAb技术。技术。7

2、070年代年代 Stemberger Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧化物酶改良上述技术，建立辣根过氧化物酶抗体过氧化物酶（抗体过氧化物酶（PAPPAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。8080年代年代 Hsu Hsu 等建立了抗生物素等建立了抗生物素生素（生素（ABCABC）法之后，免疫金）法之后，免疫金银染色法、半抗银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。原标记法、免疫电镜技术相继问世。9090年代年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。2000200

3、0年年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功功 能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。科学工作者应该掌握的基本技术之一。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 二二 免疫组化的原理免疫组化的原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织

4、化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子包括荧光显微镜、电子显微镜显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等病原体以及受体等)。三三 免疫组化的基本流程免疫组化的

5、基本流程免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 3.3.抗原修复、暴露抗原抗原修复、暴露抗原决定簇决定簇 4.4.封闭非特异性蛋白封闭非特异性蛋白 5.5.一抗孵育一抗孵育 6.6.二抗孵育二抗孵育 7.SP 7.SP 反应反应 8.8.显色显色 9.9.复染、脱水、透复染、脱水、透明、封片明、封片 2.2.细胞通透、封闭内源细胞通透、封闭内源性过氧化物酶性过氧化物酶 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化 脱蜡与水化的目的是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。脱蜡与水化的目

6、的是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。60 20 minXylene：2 10 minutes；100%absolute ethanol：2 5 minutes；95%ethanol 2 minutes；80%ethanol 2 minutes；70%ethanol 2 minutes；distilled water:5 min；PBS 洗 3 3 min。具具体体操操作作免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍2.2.细胞通透与封闭内

7、源性过氧化酶细胞通透与封闭内源性过氧化酶 目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100Triton X-100、蛋白酶、蛋白酶k k等通透液。等通透液。(1)(1)细胞通透细胞通透免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍(2)(2)封闭内源性过氧化酶封闭内源性过氧化酶 其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的ABCABC法和法和SPSP法中，法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干

8、扰，必须用过氧化氢等进行灭活。行灭活。1)1)用封闭通透液浸润切片用封闭通透液浸润切片 30 min30 min（RT RT 避光）。避光）。其配法是用预热其配法是用预热 40 ml PBS 40 ml PBS 加加120ul TritonX-100 120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加加热几分钟，在临用前加 400 ul400 ul的的3030H2O2H2O2。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体操作具体操作:免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍3.3.抗原修复抗原修复 暴露抗原

9、决定簇暴露抗原决定簇 由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。重新暴露，提高抗原检测率。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复。抗原修复的主要方法抗原修复的主要方法:酶消化方法一般用于酶消化方法一般用于细胞内抗原

10、细胞内抗原应用高频电磁波打开蛋白质间的应用高频电磁波打开蛋白质间的交联键交联键免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍将切片放入将切片放入 0.01 M 0.01 M 柠檬酸钠缓冲柠檬酸钠缓冲 溶液（溶液（pH6.0pH6.0）后，在微波炉里高火）后，在微波炉里高火 4 4 min min 至沸腾后，取出，冷却至室温，再加热，约至沸腾后，取出，冷却至室温，再加热，约4 4次，每次间隔补足液体，防止次，每次间隔补足液体，防止干片。干片。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。具体操作（微波修复）：具体操作（微波修复）：1)免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流

11、程介绍4.4.封闭特异性蛋白封闭特异性蛋白组织切片上有些剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性。组织切片上有些剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中有一些动物自身的抗体，预先能和组织封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中有一些动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合。中有交叉反应的位点发生结合。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 将切片取出将切片取出,周围水分用滤纸吸干周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入在圆圈内组织滴入 5%5%羊血清（与二羊血清（

12、与二抗来源一致）后放入湿盒中抗来源一致）后放入湿盒中,室温室温 (约约30)30)下下101030min30min。具体操作：具体操作：大一点免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍5.5.一抗孵育一抗孵育一抗一抗:可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。用肉眼是看不出来的。一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：一抗孵育温度有几种：4 4度、室温、度、室温、3737度，其中度，其

13、中4 4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般度有关，一般3737度度1-2h1-2h，然后，然后4 4度过夜和从冰箱拿出后度过夜和从冰箱拿出后3737度复温度复温45min45min。具体条件还要摸索。具体条件还要摸索。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.防止脱片；防止脱片；2.使抗原抗体结合更稳定。使抗原抗体结合更稳定。甩去切片上的羊血清甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1 1：250250、500500、10001000）后，放入湿盒中室温）

14、后，放入湿盒中室温 1 1 小时，然后小时，然后 4 4 度过夜，冰箱中取出后需度过夜，冰箱中取出后需37 37 复温复温 45 min45 min。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体做法：具体做法：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍6.6.二抗孵育二抗孵育二抗二抗:可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。或显色基团），作用是检测一抗。二抗孵育条件：二抗一般室温或二抗孵育条件：二抗一般室温或3737度度30min-1h30min-1h，具体时间需要

15、摸索。，具体时间需要摸索。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。间。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 1)1)将一抗倒掉并用将一抗倒掉并用 PBS PBS 洗洗 5 min5 min5 5 次；次；2)2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入 3737恒温烤箱中恒温烤箱中 30 min。3)3)用用 PBS PBS 洗洗 5 5 次次5 min 5 min 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具

16、体操作：具体操作：7.SP7.SP反应反应 SP SP染色法即链霉素抗生物素蛋白染色法即链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。生物素过氧化酶连接法。该法是该法是ABCABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合POPO基。基。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1 1）加入加入 SP SP 复合液后放入复合液后放入 37 37 度烤箱中度烤箱中 30 min。2 2）用用 PBS PBS 洗洗 5 次次5 min。具体操作：具体操作：SPSP染色法的特点染色法的特点:灵敏特异性低，成本低。

17、灵敏特异性低，成本低。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍8.8.显色显色 在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察。借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 通常在过氧化物酶（通常在过氧化物酶（HRPHRP）法中，显色剂为）法中，显色剂为DABDAB。DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液二氨基联苯胺显色液)配法配法:DAB 50mg 0.05M T

18、B 100ml 30%H2O2 30-40ulABC 法SP法PAP法免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍9 9、复染、脱水、透明、封片、复染、脱水、透明、封片 复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。在放入氨水中返蓝即可。1)1)用用 PBS 3 PBS 3 次次3min 3min 后，用双蒸水洗后

19、，用双蒸水洗 5 min5 min；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染胞膜蛋白染 20 s 20 s），自来水冲洗，双蒸水洗），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min5 min，再用，再用 PBS PBS 返蓝返蓝 5 min5 min。2)2)脱水脱水：50%ethanol(1-2)min;70%ethanol(1-2)min;95%ethanol（1-2）min；95%ethanol（1-2）min；100%absolute ethanol:(1-2)min；100%absolute ethanol:(1-2)min。3)3)透明

20、：透明：Xylene 1(1-2)minXylene 2(1-2)min 4)4)封片：中性树胶。封片：中性树胶。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍四四 免疫组化结果分析免疫组化结果分析免疫组化结果的判断原则：免疫组化结果的判断原则：1.必须设对照。必须设对照。2.抗原表达必须在特定部位。抗原表达必须在特定部位。3.阴性结果不能视为抗原不表达。阴性结果不能视为抗原不表达。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍实验分析的相关介绍实验分析的相关介绍阴性对照：阴性对照：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化染色实验组与对照组结

21、果分析表免疫组化染色实验组与对照组结果分析表免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照替代对照替代对照实验实验 组组结论结论6受检组织不含定位受检组织不含定位Ag7受检组织含定位受检组织含定位Ag免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍染色失败的几种原因：染色失败的几种原因：染染色色失失败败的的可可能能情情况况免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍(1)(1)所有切片呈阴性所有切片呈阴性3 3）4 4）5 5）免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原

22、理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 内源性过氧化酶没有完全阻断内源性过氧化酶没有完全阻断 切片或涂片过厚切片或涂片过厚 漂洗不够漂洗不够 底物呈色反应过久底物呈色反应过久 使用全血清抗体稀释不够使用全血清抗体稀释不够免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。2.2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但又防止液前甩干洗涤液，但又防止干片干片 。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍注意事项：

23、注意事项：3.3.以下原因可能导致片子着色不均匀：以下原因可能导致片子着色不均匀：脱蜡不充分。可以脱蜡不充分。可以 60 60 烤烤 20 min20 min，立即放入新鲜的，立即放入新鲜的 二甲苯中；二甲苯中；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；二抗等试剂；抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育后抗体孵育后 PBS PBS 冲洗不充分。冲洗不充分。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。免疫组化原理及流程介绍免疫组

24、化原理及流程介绍4.4.一抗的清洗：一抗的清洗：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍（1 1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2 2）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸洗方式；）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸洗方式；（3 3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。5.PBS5.PBS的的PHPH和离子强度的使用。和离子强度的使用。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍建议建议PH在在7.4-7.6浓度是浓度是0.01M。中性及弱硷性条件（中性及弱硷性条件（PH7-8PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。5.5.拍照拍照免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。封固，保持避光和湿度。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍谢 谢2020/11/548谢谢观赏！