分子生物学第六章基因重组ppt课件.ppt

1、Chapter 6 Genetic recombination遗传重组 重组recombination:是已存在的遗传物质产生新的组合的过程。分子间或染色体间重组：离散的染色体混合时产生新的组合。如真核染色体减数分裂时的染色体独立分配。不依赖酶。分子内或染色体内重组：通过DNA的剪切和连接产生新的染色体类型。依赖酶。分子内重组 同源重组homological recombination：同源性依赖，非序列专一性依赖。在大肠杆菌由RecA蛋白指导。位点特异性重组site specific recombination：序列专一性依赖，非同源性依赖。由位点特异性重组酶指导。转座transpositi

2、on：非同源性依赖。由转座酶、整合酶指导。酶识别转座因子两端特异序列，但受体位点相对非特异。不正常重组或非常规重组illegitimate recombination：很少或不需要同源性。一般使用不正常底物进行细胞正常加工。与癌症相关。人工重组artificial recombination:体外进行DNA的剪切和连接引起的重组，即基因重组。一、同源重组 功能：减数分裂时染色体分配、DNA修复、特定噬菌体的复制、酵母的交配型转换、真核基因组的遗传作图、基因导入 模型：v拷贝-选择：在DNA复制中，新生链延伸时转换为新的模板。如DNA修复。v断裂-重新连接：重组没有在复制中产生，DNA链在双链间

3、断裂、交换和重新连接。如减数分裂时染色体交换v杂合模型：包括上面两种特征。修复损伤DNA的同源重组真核生物同源重组的断裂与重接模型真核生物同源重组的断裂与重接模型 Darlingtong D.C.Darlingtong D.C.于于19361936年提出：年提出：减数分裂同源染色体联会时，非姊妹染色单体由于减数分裂同源染色体联会时，非姊妹染色单体由于缠绕而产生张力，两个染色单体在同一位置断裂、缠绕而产生张力，两个染色单体在同一位置断裂、重节，以消除张力，从而产生重组。重节，以消除张力，从而产生重组。证据证据：姊妹染色单体的交换：姊妹染色单体的交换 Diploid eukaryotes:cros

4、sing over(双倍体染色体交换)1.1.Homologous chromosomes line up in meiosis Homologous chromosomes line up in meiosis(when)(when)2.2.The The nonsister nonsister chromatids exchange equivalent sections chromatids exchange equivalent sections(what)(what)同源重组 发生在两条DNA双链之间 重组酶能以任何的同源序列为底物 重组的频率在整组基因中并不很频繁，但对整体和局部都

5、有影响 重组的总频率在精子和卵子中并不相同，在人类中女性是男性的两倍 在整组基因内部，同源重组的频率与染色体的构象有关，例如，十字结构将阻止附近的DNA重组变异。染色体的重组包含部分的物理性的改变：破损与再联合细线期偶线期粗线期双线期终变期同化作用在DNA双链中制造一个破损两条DNA双链分子的联接作用是基因重组的关健环节 同 源 染 色 体 两 对DNA双链在相应点产生nick，一条单链离开它的伙伴，与另一个双链分子的相应位置倒易位置，创 造 了 两 个DNA双链之间的连系，这种连接在一起的一对双链叫做交差分子。一个链与另一个链的连接点叫做重组关节。重组关节能沿着DNA双链分子移动，这种移动叫

6、做枝状迁移 在一条链被另一条链取代的过程中，分叉点可以沿任一个方向移动 交差分子旋转后形成一个平面结构-Holliday结构细菌基国重组中的单链同化作用 single-strand assimilation DNA分子的单链部分通过碱基互补配对转移到另一DNA双链分子中，称为单链吸收或单链同化。有三个必备条件：其中一个DNA分子必须有单链区其中一个DNA分子必须有自由3端单链区和3端必须设置在两分子互补区内RecA催化单链的同化作用 RecA催化单、双链DNA的反应分为三个阶段：RecA在单链DNA上慢慢聚合。单链DNA与其互补物在双链上快速配对反应，产生异源双链连接 单链从双链中慢慢转移，产

7、生一个长的异源双链DNA区带。SSB(单链结合蛋白)的存在刺激了这个反应RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end.RecA catalyzes single-strand RecA catalyzes single-strand assimilationassimilation RecA介导的DNA修复重组热点 重组起始于双链破损。双链破损在轴素形成期产生，在联会丝复合物形成阶断消失

8、(60min)在染色体上容易发生双链破损的位点，称为重组热点。Chi序列刺激它周围附近的重组 与重组有关的基因称为Rec基因 Rec突变体不能进行同源重组 大约1020个与重组有关的DNA位点通过E.coli 的Rec基因突变体鉴定 Chi序列能刺激它周围附近的重组：5GCTGGTGG 3 3CGACCACC 5 Chi序列在大肠杆菌中每510kb出现一次 Chi是一个被RecBCD基因编码的酶的作用目标。RecBCD是有强烈降解DNA能力的核酸酶，在SSB存在下，有解开DNA双链的酶活性和ATP酶活性，它在重组中所起的作用便是提供带有自由3端的单链DNA。Haploid prokaryote

9、sHaploid prokaryotes (单倍体生物原核同源重组）单倍体生物原核同源重组）Between the two homologous DNA duplex(where)partially duplicated DNA of the chromosome partially duplicated DNA of the chromosome between chromosomal DNA and“foreign”DNA between chromosomal DNA and“foreign”DNA1.1.Nicks made near Nicks made near ChiChi (G

10、CTGGTGG/each 4 kb)(GCTGGTGG/each 4 kb)sites by a nuclease sites by a nuclease with recBCD.with recBCD.2.2.RecA binds to ssDNA RecA binds to ssDNA to form RecA-ssDNA.to form RecA-ssDNA.How:Holliday model 3.3.RecA-ssDNA filaments search the opposite DNA duplex RecA-ssDNA filaments search the opposite

11、DNA duplex for corresponding sequence(invasion).for corresponding sequence(invasion).4.4.Seal the nicks and form a four-branched Holliday Seal the nicks and form a four-branched Holliday structurestructure5.5.Branch migration&resolving Holliday junctionBranch migration&resolving Holliday junctionHap

12、loid prokaryotesHaploid prokaryotes (原核同源重组）原核同源重组）Haploid prokaryotesHaploid prokaryotes(原核同源重组）原核同源重组）Resolving Holliday junction二、位点专一性重组 非序列同源性 重组位点特异 由识别特异重组位点的酶指导 导致DNA序列发生重排 举例：l l噬菌体插入细菌基因组噬菌体插入细菌基因组 l l噬菌体从细菌基因组中切离噬菌体从细菌基因组中切离1.1.l-encoded integrase(Int l-encoded integrase(Int 整合酶整合酶):makes

13、):makes staggeredcutsstaggeredcuts交错切点交错切点in the specific sites in the specific sites（15bp seq15bp seq）2.2.Int and IHF(integration host factor encoded by Int and IHF(integration host factor encoded by bacteria):recombination and insertionbacteria):recombination and insertion3.3.l-encoded excisionase

14、(XIS):excision of the phage DNA l-encoded excisionase(XIS):excision of the phage DNA Site-specific recombination:(Site-specific recombination:(位点专一性重组）位点专一性重组）bacteriophage l insertionbacteriophage l insertion 整合过程要求在attp和attB之间进行识别；而移除过程则需要在attL和attR之间进行识别 重组过程是可逆的，但反应条件不同：整合反应需要int产物和IHF因子；移除反应还需要

15、噬菌体xis基因产物。xis基因产物决定噬菌体是否进行复制 整合的过程:A.具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合；B.Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接，形成Holliday中间提，C.在另两条单链之间发生同样的断裂重接，从而完成双链间的重组。位点专一性重组的核苷酸序列位点专一性重组的核苷酸序列 1.attP:POP:O为15bp(核心)富含A-T的非对称序列；P为-160 O的160bp序列 P为O 80的80bp序列 共240bp 2.attB:BOB:B为-11 O序列 B为O 11序列 共23bp重组后形成BOP(att

16、L,91bp)和POB(attR,171bp)特异性重组可以在体外进行 特异性重组可以通过Int和IHF在体外进行，它包括在缺少任何DNA合成下的破损与再结合，两个臂的功能可以通过在两侧产生缺失来研究 attp发挥作用要240bp，而attB只需要由-11到+11的23bp的片断即可发挥作用，在这个片段中，核心两侧只有4bp通路克隆系统gateway cloning system 一种位点特异的DNA重组技术，包括LR和BP两个反应体系。可简单表示为：attBXattP attLXattR用途：PCR产物的定向克隆 DNA片断高效、广泛的亚克隆 氨基或羧基末端的融合蛋白表达LR反应和BP反应

17、LR 反应：通路克隆的主要反应,LR 克隆酶(整合酶(Int)和整合宿主因子(IHF)蛋白)识别attL 和attR 重组位点后,催化入口克隆(entry clone)的外源DNA 及其两端部分位点取代目标载体(destination vector)的ccdB 基因及其两端部分位点(灰色),形成表达克隆(expression clone)。BP 反应：与LR 反应反向,BP 克隆酶混和物(Int、IHF 和切除酶(Xis)催化表达载体attB 间的目的基因转到供体载体中,形成新的入口克隆,此克隆又可与其它目标载体重组产生新的表达载体。PCRPCR产物的产物的BPBP反应反应三、转座重组特点：1

18、.自身携带有转座酶基因，末端有反向重复序列;2.转座过程中出现共联体；3.转座以后,可以造成原来转座子位置的DNA缺失(非复制转座)，也可以依然保持在原位，而在靶序列上复制了一个转座子(复制转座);4.转座完成以后可以在靶序列上造成同向重复序列5.转座子插入后可影响所在位置的基因的表达转座子 转座子指能将自身插入基因组中其它位置的一段DNA序列。插入位置与转座子序列没有相关性。病毒、细菌和真核细胞的质粒或基因组中都含有转座子。多数转座子在插入新位点的过程中依赖其特异的插入序列去完成。原核生物转座因子包括：插入序列；转座子；转座噬菌体IS elementIS element基因组的进化既赖于获得

19、新的序列又赖于重排目前的序列。转座子可引起其它基因组顺序的重排，提供基因组里变异的主要来源。重排可以产生新的序列和改变目前序列的作用。细菌、噬菌体、病毒(尤其是逆转录病毒)可以通过传染传递遗传信息。转座子的特征性结构是它的末端具有反向重复序列，而两侧宿主DNA的邻接末端是短的同向重复序列。当考查DNA序列时，这种结构类型是判断转座子的鉴别特征，并且是这种序列起源于转座作用的初步证据。转座因子IS线型宿主DNA插入后引起目标序列产生同向重复THANK YOUSUCCESS2022-7-31可编辑Tn10 插入环状DNA内Tn10 再移动时可能从两个方向移动，产生新的转座子Nonreplicati

20、ve transposition describes the movement of a transposon that leaves a donor site(usually generating a double-strand break)and moves to a new site.Replicative transposition describes the movement of a transposon by a mechanism in which first it is replicated,and then one copy is transferred to a new

21、site.复制转座非复制转座转座产生的效应 Recombination between direct repeats excises the material between them同向重复序列之间重组造成重复间序列缺失 Recombination between inverted repeats inverts the region between them.反向重复序列之间重组造成重复间序列倒位 Transposition is initiated by nicking the transposon ends and target site and joining the nicked

22、ends into a strand transfer complex.转座机制：在转座酶作用下，在转座子和目标序列的反式位点产生缺刻，转座子通过末端联会插入到目标序列中，形成共合体 Transposition may fuse a donor and recipient replicon into a cointegrate共合体.Resolution releases two replicons复制子,each containing a copy of the transposon.复制转座：在共合体分解时转座子产生两个拷贝 缺刻重组复制断裂重接则造成非复制转座Nonreplicative

23、 transposition proceeds by breakage and reunion Each controlling element family has both autonomous and nonautonomous members.Autonomous elements are capable of transposition.Nonautonomous elements are deficient in transposition.Pairs of autonomous and nonautonomous elements can be classified in 4 f

24、amilies.Controlling elements Controlling elements 控制因子控制因子in maize form families of in maize form families of transposonstransposons 可用于转座子插入突变自主转座子非自主转座子The role of The role of transposable transposable elements in elements in hybrid hybrid dysgenesis dysgenesis 杂杂种不育种不育带有P因子P品系的精子DNA释放到卵细胞中时，精子基因组

25、上的P因子被激活，发生转座，引起突变The retroviral life cycle proceeds by reverse transcribing the RNA genome into duplex DNA,which is inserted into the host genome,in order to be transcribed into RNA.The retrovirusThe retrovirus反转反转录病毒录病毒life cycle life cycle involves involves transposition like transposition like e

26、ventseventsLTRLTR is an abbreviation for long-terminal repeat.is an abbreviation for long-terminal repeat.自然界中的其它自然界中的其它基因转移与重组现象基因转移与重组现象 一、接合作用一、接合作用(conjugation)(conjugation)二、转化二、转化(transformation)(transformation)和转导和转导(transduction)(transduction)三、转染三、转染(transfection)(transfection)四、免疫分子的多样性四、免

27、疫分子的多样性接合作用：当细接合作用：当细胞与细胞、或细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互菌通过菌毛相互接触时，质粒接触时，质粒DNADNA就可以从一个细就可以从一个细胞（细菌）转移胞（细菌）转移至另一细胞（细至另一细胞（细菌）的方式。菌）的方式。转化：转化：通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNADNA，使细胞，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。或培养的受体细胞获得新的遗传表型。转导转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNAD

28、NA转移及基因重组即为转导作用转移及基因重组即为转导作用三、转染(transfection)l 转染是转化的一种特殊形式。转染是转化的一种特殊形式。由transformation（转化）和 infection（感染）两词构成。l 原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。l 通过通过感染方式将外来将外来DNADNA引入宿主细胞，并导致宿主引入宿主细胞，并导致宿主细胞细胞遗传性状改变的过程称为转染。的过程称为转染。l 将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫转染。思考题 解释解释:recombination;single-strand assimilation;同源重组在

29、生命活动和基因工程中的作用是什么?同源重组的断裂重接模型的基本内容是什么?(提示:考虑断裂和重接的机制)位点专一性重组有哪些主要特点?基因工程中是如何利用其原理进行基因克隆的?转座子的特征性结构是什么?转座可产生哪些的生物学或遗传学效应?自然界中存在哪些基因转移与重组现象自然界中存在哪些基因转移与重组现象?（至少写出（至少写出5 5种种以上）以上）试比较同源重组、位点专一性重组、转座重组和人工重试比较同源重组、位点专一性重组、转座重组和人工重组间的异同点。组间的异同点。四、免疫分子的多样性四、免疫分子的多样性 体液免疫反应免疫球蛋白（免疫球蛋白（ImmunoglobulinImmunoglob

30、ulin）：）：高度特异性、庞大多样性L链（214aa）VL、CL和两种，对一个Ig唯一H链（426aa）VH、CH1、CH2、CH3恒定区的序列有、和五种类型VL和VH内有高变区真正抗原结合部位负责抗体分子对抗原的识别互补决定区CDRIgGIgG、IgA、IgM、IgD和IgE（人体）免疫球蛋白基因的组织免疫球蛋白基因的组织 Ig基因有三个独立的基因家族分别编码两个轻链（和）、一个重链（小鼠 6、16和12号染色体）轻链基因家族的组成：L、V、J、C四类基因片段 Lleader segment V variable segment Jjioning segment Cconstant seg

31、ment 重链家族：L、V、D、J、C五类片段 Ddiversity segment 高变区 J J和和C C之间有增强子之间有增强子 种系中基因数目变动较大 FamilyV GenesC GenesManMouseManMouseLambda64Kappa100098人的重链基因簇包括了所有组织重链的基因信息（重人的重链基因簇包括了所有组织重链的基因信息（重链恒定区九种链恒定区九种C C片段、两个假基因）片段、两个假基因）家族V基因后跟随着几个以J片段作为前导的C基因k k家族（人和老鼠）的组成：家族（人和老鼠）的组成：V V 基因（人基因（人300300、鼠、鼠1000 1000）、）、5

32、 5个个 J J（一个假基因）、（一个假基因）、1 1个个 C C基因基因免疫球蛋白基因形成过程中的重组机制免疫球蛋白基因形成过程中的重组机制 除淋巴细胞外，所有细胞免疫球蛋白基因簇的结构都是 相同的种系结构 骨髓干细胞在分化为成熟骨髓干细胞在分化为成熟B B淋巴细胞时出现免疫球蛋白淋巴细胞时出现免疫球蛋白 基因的体细胞重排基因的体细胞重排 即淋巴细胞中重组产生活性基因使免疫系统为基因组 的改变提供了广泛的基础 抗体分子的多样性抗体分子的多样性1 1、轻链基因、轻链基因V V和和J J片段的重组片段的重组 a）链的重组 每个C片段前有 J跟随 只发生一次重组 在V和J-C之间 (V和J的重组)

33、b）链的重组 基因簇只有一个C V与C之间 5个J（一个假基因）用到的每个 J都可以成为 V的外元终端整合J右边的J片段作为含子被剪切整合J左边的每个J片段都会缺失掉 重链的可变 区由V和J基 因及第三个 D基因片段 编码 重链的可变 区重组有两 个阶段 D-J重组、VH和DJ重组2 2、重链基因、重链基因V V、D D和和J J片段的重组片段的重组 一个指定的B淋巴细胞产生、其中之一轻链同重链结合 轻链中表现为同型性项斥（isotypic exclusion）往往只有链基因重组失败，才发动链基因重组 抗体中大部分轻链是 链，链往往占少部分 人类有约60%的轻链是链，约40%为链。老鼠有95%

34、的B细胞表达类型的轻链 单特异性单特异性单个B细胞只产生一种抗体基因 淋巴细胞为二倍体H、和都有两个等位基因 重组表现为等位基因排斥（allelic exclusion）3 3、重组的分子机制、重组的分子机制 利根川进（Tonegawa S）1987 Nobel prize 1）重组位点 轻重链重组涉及相同的机理（特异位点）V下游、J上游、D两侧存在保守的重组信号序列（RSS）RSS:共同的回文七核苷酸CACAGTG（与基因连接）固定长度的间隔序列12bp或23bp 共同的富含A的九核苷酸ACAAAAACC 轻链中：链V下游与J上游的RSS方向相反(间隔序列12、23)D下游和J上游的RSS也

35、有同样关系（12、23）重链中：V下游与D上游的RSS方向相反(间隔序列23、12)链(间隔序列12、23)七聚体九聚体 2）重组机制 涉及链的断裂和重接 重组酶基因 rag(recombination activating gene)编码蛋白质RAG1和RAG2 RAG1和RAG2识别RSS之间所形成的二级结构 重组只发生在间隔为重组只发生在间隔为12bp12bp与与23bp23bp的不同的不同RSSRSS之间之间 12122323规则规则V LL VV L9Nt 9Nt12Nt 23Nt7Nt 7NtV J La)RAG1/RAG2识别的二级 结构 不同的V片段与J-C的重组 （H链 V与

36、D、D与J-C）导致Ig多样性b)RAG1/RAG2复 合物切开七核苷酸 与基因接头处的一 条链（3OH、5P）c)基因片段末端形成 发夹结构 游离3OH攻击 另一条链的酯键 （双链断裂）d)连接反应导致序列 的变化插入、缺失 （影响编码蛋白）连接位点不同 导致Ig的多样性3)V基因只有和C连接 后才有活性 涉及启动子和增强子 的作用 V-C连接后V的启动子 接近增强子后才有活 性 增强子只在B细胞内 才有活性（组织）4)重排中的等位相斥 轻、重链中都涉及 Ig0未经重排的种 系构型 Ig无效基因 Ig+有效基因 活性链的生成抑制 了进一步的重排抗体多样性产生的5种机制 性细胞内含有多个V基因 V-J和V-D-J的重组 重组部位的差异性 体细胞突变 重链与轻链的随机结合THANK YOUSUCCESS2022-7-31可编辑