基因工程基础知识与基本技术概述(ppt-58张)课件.ppt

1、1第一章第一章 基因工程基础知识与基本技术基因工程基础知识与基本技术21.1 基因工程的基础知识基因工程的基础知识1.1.1 基因的结构特点 基因按照它们在细胞内分布的部位，又可分为胞核基因和基因按照它们在细胞内分布的部位，又可分为胞核基因和核外基因。胞核基因存在于细胞核内，位于染色体上；核外基核外基因。胞核基因存在于细胞核内，位于染色体上；核外基因分散在细胞质内，又称胞质基因因分散在细胞质内，又称胞质基因(真核细胞的细胞器基因真核细胞的细胞器基因)。3原核生物基因结构特点原核生物基因结构特点 大多数原核细胞中，只有一个大多数原核细胞中，只有一个DNA分子，即一条染色分子，即一条染色体。原核细

2、胞基因组体。原核细胞基因组DNA的绝大部分可编码蛋白质，其中只的绝大部分可编码蛋白质，其中只有极小部分不转录，即非编码区。有极小部分不转录，即非编码区。在原核细胞中，功能相关的结构基因相互串联排列，受在原核细胞中，功能相关的结构基因相互串联排列，受上游共同调控区的控制，同时转录，同时翻译，最终形成功上游共同调控区的控制，同时转录，同时翻译，最终形成功能相关的几种蛋白质。能相关的几种蛋白质。441-44bp 原核生物启动子结构Pribnow 原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列 Pribnow框或框或-10区：区：-4 -13bp之间由个核苷酸组成，之间由

3、个核苷酸组成，多数是多数是TATAA序列。序列。-35区：区：-35bp前后保守的前后保守的TTGACA序列序列。5原核生物DNA特点归纳:绝大多数的原核生物绝大多数的原核生物DNA分子都会发生转录分子都会发生转录和翻译。和翻译。原核生物基因中，编码具有相关功能的原核生物基因中，编码具有相关功能的RNA或蛋白质的，能串连在一起，集中于基因组的或蛋白质的，能串连在一起，集中于基因组的特定部位，共同形成某些功能或转录单元。特定部位，共同形成某些功能或转录单元。原核生物基因具有重叠基因。原核生物基因具有重叠基因。6原核生物mRNA特点:半衰期短。半衰期短。多顺反子形式。多顺反子形式。存在序列。存在序

4、列。7原核生物基因终止子特点:终止子，就是提供转录终止信号的这样终止子，就是提供转录终止信号的这样一段一段 DNA序列序列。终止子上游存在一个富含碱基的二重对称区。终止子上游存在一个富含碱基的二重对称区。终止点上游有段个碱基构成的保序列。终止点上游有段个碱基构成的保序列。8基因不连续性。基因不连续性。内含子。内含子。外显子。外显子。卫星。卫星。真核生物基因结构特点真核生物基因结构特点9真核生物基因的不连续性10真核生物基因的内含子DNA上的内含子会被上的内含子会被转录转录到前体到前体RNA中，中，但但RNA上的内含子会在上的内含子会在RNA离开离开细胞核细胞核进行进行转译转译前被前被剪除剪除。

5、在成熟。在成熟mRNA被保留下来的基被保留下来的基因部分被称为因部分被称为外显子外显子。真核生物真核生物的基因含有外的基因含有外显子和内含子，是前者区别显子和内含子，是前者区别原核生物原核生物的特征之的特征之一。一。11真核生物基因的连接区内含子和外显子接头的处，往往会存在的内含子和外显子接头的处，往往会存在的高度保守的特异性碱基序列高度保守的特异性碱基序列。12垃圾 13真核生物基因的外显子v外显子，它是真核生物基因的一部分，它在外显子，它是真核生物基因的一部分，它在剪接后，仍然会被保存下来，并且可以在剪接后，仍然会被保存下来，并且可以在蛋蛋白质生物合成白质生物合成过程中被表达为蛋白质。过程

6、中被表达为蛋白质。14真核生物基因的侧翼序列 15真核生物基因的卫星卫星卫星DNA，主要指的是真核细胞染色体中，主要指的是真核细胞染色体中，一些具有高度重复核苷酸序列的，同时碱基数又一些具有高度重复核苷酸序列的，同时碱基数又非常少一般只有非常少一般只有20-30bp左右的左右的DNA片段。片段。161.1.2 从到蛋白质DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制17基因表达 基因基因表达，其实指的就是生物表达，其实指的就是生物细胞细胞在在生命过程中，把储存在生命过程中，把储存在DNA序列中的序列中的遗传遗传信息信息经过转录和翻译，转变成具有经过转录和翻译，转变成具有生物生物活活性的蛋白质分

7、子过程。性的蛋白质分子过程。转录水平表达转录水平表达翻译水平表达翻译水平表达18转录水平表达转录水平表达转录水平的基因表达，就是在转录水平的基因表达，就是在RNA聚合聚合酶酶的催化下，以的催化下，以DNA为为模板模板，合成，合成mRNA的的过程。这个过程，也就是转录过程。过程。这个过程，也就是转录过程。参与转录的物质参与转录的物质v原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)v模板:DNAv酶:RNA聚合酶v其他蛋白质因子RNA合成方向合成方向：5 3真核生物基因转录，它会有如剪接，加帽，加尾等等过程。19在5端加帽 5端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5端的这

8、种结构称为帽子（cap）。帽子结构功能：能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合；m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端，以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。203端加尾Poly(A)尾，主要的功能是：有助mRNA从核到细胞质转运；避免在细胞中受到核酶降解，增强mRNA的稳定性。21蛋白质翻译蛋白质翻译 v氨基酸的活化v翻译的起始v肽链的延伸v肽链的终止v蛋白质前体的加工主要过程主要过程22蛋白质前体的加工蛋白质前体的加工1、N端fMet或Met的切除2、二硫键的形成 两个半胱氨酸-SH-SH 二硫键3、特定氨基酸的修饰 磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基

9、化和羧基化4、切除新生肽链中非功能片段23操纵子学说v操纵子操纵子，是基因转录的是基因转录的功能单位。功能单位。操操纵子纵子概念的提概念的提出，表明人们出，表明人们已认识到基因已认识到基因的功能并不是的功能并不是固定不变的，固定不变的，而是可以根据而是可以根据环境的变化进环境的变化进行调节。行调节。24乳糖操纵子学说内容乳糖操纵子学说内容v-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、-半乳糖通透酶、以及半乳糖通透酶、以及-半乳糖半乳糖苷乙转移酶基因产物由同一条多顺反子的删苷乙转移酶基因产物由同一条多顺反子的删A分子分子所编码所编码v这个这个mRNA分子的启动子区分子的启动子区P紧接着操作子紧接着操作子区区O而位

10、于阻遏子区而位于阻遏子区I与操作子区与操作子区0之间的之间的启动子区启动子区(P)，不能单独起动合成，不能单独起动合成-半乳糖通透酶和半乳糖通透酶和透过酶的过程透过酶的过程v操作子是乳糖操纵于操作子是乳糖操纵于DNA上的一小段序列，仅为上的一小段序列，仅为26bp是阻遏物的结合位点是阻遏物的结合位点v当阻遏物与操作子结合时，当阻遏物与操作子结合时，lacmRNA的转录起始的转录起始受到抑制受到抑制v诱导物通过与阻遗物结合，改变它的三维构像，诱导物通过与阻遗物结合，改变它的三维构像，使之不能与操作子结合从而激发使之不能与操作子结合从而激发lacmRNA的合成。的合成。25操纵子调节类型操纵子调节

11、类型代谢产物对基因活性的调节代谢产物对基因活性的调节降解物对基因活性的调节降解物对基因活性的调节环腺苷酸受体蛋白对转录的调节环腺苷酸受体蛋白对转录的调节 261.1.3基因研究进展 v遗传密码子与信息流遗传密码子与信息流v遗传密码是一组规则的，将遗传密码是一组规则的，将DNA或或RNA序列以三序列以三个核苷酸为一组的密码子转译为蛋白质的氨基酸序个核苷酸为一组的密码子转译为蛋白质的氨基酸序列。列。尼伦伯格尼伦伯格27管家基因和奢侈基因管家基因和奢侈基因 v管家基因管家基因，也称持家基因，是指特定物种所有细胞，也称持家基因，是指特定物种所有细胞中均要表达的一类基因，而且这种基因的表达产物中均要表达

12、的一类基因，而且这种基因的表达产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。是对维持细胞基本生命活动所必需的。v奢侈基因奢侈基因是指只在特别细胞类型中大量表达并编码是指只在特别细胞类型中大量表达并编码特殊功能产物的这样一种基因。特殊功能产物的这样一种基因。28移动基因移动基因 转座子转座子是存在于染色体是存在于染色体DNA上可自主复上可自主复制和位移的基本单位。最简单的转座子不含制和位移的基本单位。最简单的转座子不含有任何有任何宿主宿主基因而常被称为插入序列（基因而常被称为插入序列（IS）。）。转座子引起的插入突变转座子引起的插入突变29 指两个或两个以上的基因共有一段指两个或两个以上的基因共有一段D

13、NA序列，序列，或是指一段或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组序列成为两个或两个以上基因的组成部分。重叠基因有多种重叠方式。成部分。重叠基因有多种重叠方式。重叠基因重叠基因 假基因假基因 假基因它是具有与功能基因相似的序列，但是假基因它是具有与功能基因相似的序列，但是由于有许多突变以致失去了原有的功能，由于有许多突变以致失去了原有的功能，假基因特点假基因特点:基因的结构发生突变；基因的结构发生突变；没有内含子；没有内含子；具有与具有与mRNA的的poly(A)尾的相应结构；尾的相应结构；两侧有顺向重复序列；两侧有顺向重复序列；随机出现在非正随机出现在非正常的位置上。常的位置上。30

14、单倍体单倍体细胞细胞中的全套中的全套染色体染色体为一个基因组，或为一个基因组，或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。基因组是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部内的全部DNA分子分子。基因组基因组 有的物种，较为复杂一些，可能含有多套基因组，如：植物的核基因组；线粒体基因组；叶绿体基因组等。31(1)原核生物基因组的特点原核生物基因组的特点具有操纵子结构；具有操纵子结构；编码序列在基因组中约占编码序列在基因组中约占50，远，远大于真核基因组，但又小于病毒基因组；大于真核基因组，但又小于病毒基

15、因组；多顺反子结构且无多顺反子结构且无内含子，是连续的内含子，是连续的Pg此转录后不需要剪切；此转录后不需要剪切；基因组中重复序基因组中重复序列很少；列很少；基因组中存在可移动的基因组中存在可移动的DNA序列，包括插入序列和序列，包括插入序列和转座子。转座子。(2)真核生物基因组的特点真核生物基因组的特点每一种真核生物都有一定的染色体数目；真核生物的每一种真核生物都有一定的染色体数目；真核生物的莱因织远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，莱因织远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有很多复制起点，每个复制子大小不一；真核生物都有结具有很多复制起点，每个复制子大小不一；真核

16、生物都有结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反于，即一分子构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反于，即一分子mRN只能翻译成一种蛋白；大量重复顺序的存在是真核生只能翻译成一种蛋白；大量重复顺序的存在是真核生物基因组的重要特点；真核生物基因组内非编码的顺序占物基因组的重要特点；真核生物基因组内非编码的顺序占90以卜，基因组中的非编码的顺序所占比例是真核生物与细菌、以卜，基因组中的非编码的顺序所占比例是真核生物与细菌、病毒的重要区别，正在一定程度上也是生物进化的标尺；大病毒的重要区别，正在一定程度上也是生物进化的标尺；大多数真核生物的结构基因具有内含子结构，是断裂基因，而原多数真核生物的

17、结构基因具有内含子结构，是断裂基因，而原核生物基因不含内含子序列；有基因家族，来自同一个祖先核生物基因不含内含子序列；有基因家族，来自同一个祖先基因的复制和变异、功能相关的基因构成各种基因家族，可以基因的复制和变异、功能相关的基因构成各种基因家族，可以串联在一起，亦可相距很远，。串联在一起，亦可相距很远，。原核与真核生物基因组特点原核与真核生物基因组特点 32v电泳技术电泳技术v技术技术v分子杂交技术分子杂交技术v序列分析技术序列分析技术v基因突变技术基因突变技术1.基因工程的基本技术基因工程的基本技术33电泳电泳，指混悬于溶液中的样品电荷颗粒，指混悬于溶液中的样品电荷颗粒,在电场影响下向着与

18、自身带相反电荷的电极在电场影响下向着与自身带相反电荷的电极移动的现象。移动的现象。1.2.1 电泳技术琼脂糖电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺电泳聚丙烯酰胺电泳 34v琼脂糖电泳琼脂糖电泳，就是用琼脂糖凝胶作支持物的，就是用琼脂糖凝胶作支持物的电泳方法。电泳方法。琼脂糖电泳琼脂糖电泳35琼脂糖电泳的操作琼脂糖电泳的操作v正确选择凝胶浓度正确选择凝胶浓度v适合的电泳缓冲液适合的电泳缓冲液v电泳的合适电压和温度电泳的合适电压和温度vDNA样品的纯度和状态样品的纯度和状态vDNA的上样的上样vMarker的选择的选择v凝胶的染色和观察凝胶的染色和观察36使用聚丙烯酰胺凝胶作为基质使用聚丙烯酰胺凝胶作为基质,进

19、行电泳的进行电泳的方法。方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）37SDS-PAGE电泳电泳 vSDS-PAGE电泳电泳，中，中SDS是阴离子去污剂，是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。子的二、三级结构。38v1.2.2 PCR技术 PCR是体外酶促合成特异是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法片段的一种方法,由由高温高温变性、低温退火（复性）及适温

20、延伸等几变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期步反应组成一个周期,循环进行循环进行,使目的使目的DNA得以迅得以迅速扩增速扩增,具有具有特异性特异性强、灵敏度高、操作简便、省强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。时等特点。39PCR技术的发现1984年11月15日，PCR实验获得了成功1985年3月28日，申请有关PCR的第一个专利1985年9月20日，一篇关于PCR应用的文章关交科学杂志，11月15日接受发表。1985年12月，一篇正式介绍PCR的原理的论文送到自然杂志，拒稿。后改投吴瑞为主编的酶学方法杂志。1986年5月，穆利斯去冷泉港实验室举行的“人类分子生物学”专题研讨会

21、上介绍PCR技术1991年12月12日，霍夫曼拉夫什公司出资3亿美元购买PCR技术。西斯特公司倒闭1993年10月13日，穆利斯因发明PCR技术获诺贝尔化学奖。40技术实验过程技术实验过程 PCR实验原理图实验原理图41反应的特点反应的特点 v特异性强特异性强v灵敏度高灵敏度高 能将能将皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12)量级的起始待测模板，扩量级的起始待测模板，扩增到微克增到微克(g=10(g=10-6-6)水平水平 v简便、快速简便、快速 一般在一般在2 24 4 小时完成扩增反应小时完成扩增反应 引物与模板引物与模板DNADNA特异正确结合；特异正确结合；PCR反应遵循碱基配对

22、原则；反应遵循碱基配对原则；Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶合成反应的忠实性；合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性靶基因的特异性与保守性。42PCR的整个反应体系的整个反应体系 模板模板(基因组基因组DNA、mRNA、cDNA、质粒等、质粒等)引物引物 底物底物dNTP；耐热耐热DNA聚合酶聚合酶 PCR缓冲液缓冲液 氯化镁氯化镁 水水(ddH2O)43PCR技术的扩展技术的扩展v不对称不对称PCRv逆转录逆转录PCRv锚定锚定PCRv反向反向PCRv随机引物随机引物PCRv差异显示差异显示RTPCRv单链构象多态性单链构象多态性PCR 44锚定锚定PCR 锚定锚定PCR示意图示意

23、图45反向反向PCR 反向反向PCR示意图示意图46巢式巢式PCR 471.2.3 分子杂交技术 分子杂交分子杂交:不同来源或不同种类生物分子间相不同来源或不同种类生物分子间相互特异识别而发生的结合。互特异识别而发生的结合。如核酸如核酸(DNA、RNA)之间、之间、蛋白质分子之间、核酸与蛋白质分子之间、以及自组装单分蛋白质分子之间、核酸与蛋白质分子之间、以及自组装单分子膜之间的特异性结合。子膜之间的特异性结合。核酸分子杂交核酸分子杂交，就是由来源不同的两个脱氧核，就是由来源不同的两个脱氧核糖核酸单链或核糖核酸单链结合成双链分子的这样糖核酸单链或核糖核酸单链结合成双链分子的这样一个过程一个过程。

24、48核酸分子杂交核酸分子杂交 杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细也可以是细胞总胞总DNA或总或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交可以是提纯的，也可以在细胞内杂交,即细胞原位即细胞原位杂交。杂交。探针探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素普遍的探针标记物是同位素,但由于同位素的安全但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。性，近年来发展

25、了许多非同位素标记探针的方法。49核酸分子杂交主要内容核酸分子杂交主要内容 核酸分子变性核酸分子变性核酸分子复性核酸分子复性核酸分子杂交核酸分子杂交 50核酸分子杂交操作过程核酸分子杂交操作过程v转移。v固定v杂交v漂洗51分子杂交具体类型分子杂交具体类型 vsouthern杂交vnorthern杂交v western杂交 southern杂交示意图杂交示意图52northern杂交示意图杂交示意图531.2.4 DNA序列分析 DNA序列分析技术主要由三部分组成：序列分析技术主要由三部分组成：产生具有不同长度的产生具有不同长度的DNA片段。这些长度之间的片段。这些长度之间的最小差异是一个核苷

26、酸且被特定的标记化合物标记，最小差异是一个核苷酸且被特定的标记化合物标记，便于其后的检测；便于其后的检测；在变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，变性在变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，变性胶的分辨率为一个核苷酸；胶的分辨率为一个核苷酸；DNA序列的显示，即对完成的测序胶进行放射自序列的显示，即对完成的测序胶进行放射自显影、银染显示、或在自动测序仪上通过自动记录显影、银染显示、或在自动测序仪上通过自动记录不同标记信号读取不同标记信号读取DNA序列。序列。54DNA测序方法测序方法551.2.5 基因突变技术 基因突变基因突变，即，即基因组基因组DNA分子发生的突然的分子发生的突然的可可遗传的变

27、异遗传的变异。在实验室中，其实也可以通过特定的。在实验室中，其实也可以通过特定的实验方法，来改造某些基因或是某些基因所表达的实验方法，来改造某些基因或是某些基因所表达的蛋白。这就是蛋白。这就是基因突变技术基因突变技术。位点特异性突变位点特异性突变；随机突变随机突变。盒式突变盒式突变；寡核苷酸介导突变寡核苷酸介导突变；介导突变介导突变；化学合成突变基因化学合成突变基因。56寡核苷酸介导的定点突变寡核苷酸介导的定点突变 57盒式诱导突变盒式诱导突变 58点突变点突变 激励学生学习的名言格言激励学生学习的名言格言220、每一个成功者都有一个开始。勇于开始，才能找到成功的路。221、世界会向那些有目标

28、和远见的人让路（冯两努香港著名推销商）222、绊脚石乃是进身之阶。223、销售世界上第一号的产品不是汽车，而是自己。在你成功地把自己推销给别人之前，你必须百分之百的把自己推销给自己。224、即使爬到最高的山上，一次也只能脚踏实地地迈一步。225、积极思考造成积极人生，消极思考造成消极人生。226、人之所以有一张嘴，而有两只耳朵，原因是听的要比说的多一倍。227、别想一下造出大海，必须先由小河川开始。228、有事者，事竟成；破釜沉舟，百二秦关终归楚；苦心人，天不负；卧薪尝胆，三千越甲可吞吴。229、以诚感人者，人亦诚而应。230、积极的人在每一次忧患中都看到一个机会，而消极的人则在每个机会都看到

29、某种忧患。231、出门走好路，出口说好话，出手做好事。232、旁观者的姓名永远爬不到比赛的计分板上。233、怠惰是贫穷的制造厂。234、莫找借口失败，只找理由成功。（不为失败找理由，要为成功找方法）235、如果我们想要更多的玫瑰花，就必须种植更多的玫瑰树。236、伟人之所以伟大，是因为他与别人共处逆境时，别人失去了信心，他却下决心实现自己的目标。237、世上没有绝望的处境，只有对处境绝望的人。238、回避现实的人，未来将更不理想。239、当你感到悲哀痛苦时，最好是去学些什么东西。学习会使你永远立于不败之地。240、伟人所达到并保持着的高处，并不是一飞就到的，而是他们在同伴们都睡着的时候，一步步艰辛地向上爬241、世界上那些最容易的事情中，拖延时间最不费力。242、坚韧是成功的一大要素，只要在门上敲得够久、够大声，终会把人唤醒的。243、人之所以能，是相信能。244、没有口水与汗水，就没有成功的泪水。245、一个有信念者所开发出的力量，大于99个只有兴趣者。246、环境不会改变，解决之道在于改变自己。247、两粒种子，一片森林。248、每一发奋努力的背后，必有加倍的赏赐。249、如果你希望成功，以恒心为良友，以经验为参谋，以小心为兄弟，以希望为哨兵。250、大多数人想要改造这个世界，但却罕有人想改造自己。