1、常规常规PCRPCR技术：技术：对对PCR扩增反应的扩增反应的终产物终产物进行定量进行定量及定性分析及定性分析定量定量PCRPCR技术：技术：通过对通过对PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环每一个循环产物荧光信号的实时检测产物荧光信号的实时检测从而实现从而实现对对起始模板起始模板定量及定性的分析定量及定性的分析三个关键词：实时，定量，荧光三个关键词：实时，定量，荧光Opticon实时荧光定量实时荧光定量PCR仪之仪之 Ct值的定义是值的定义是PCR扩增过程中，荧光扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的阈值所对应的循环次数循环次数。实时荧光定
2、量实时荧光定量PCR方法利用循环阈值方法利用循环阈值（CtCt）的概念，在指数扩增的开始阶的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该尚未放大，因此该CtCt值具有极好的重值具有极好的重复性。复性。q初始初始 DNADNA量越多量越多,荧光荧光达到某一值（域值）时达到某一值（域值）时所需要的循环数越少所需要的循环数越少qLogLog浓度与循环数呈线浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模计算出样品中所含的模板量板量确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度R1R2
3、RQqSYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位qSYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT变性 DNA未结合SYBR Green 1 dyeq起始模板浓度定量q融解曲线分析-可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体q基因型分析q使用方便 -不必设计复杂的引物 q没有序列特异性 -可以用于不同的模板 q便宜 q灵敏q与非特异性产物结合与非特异性产物结合发夹型杂交探针发夹型杂交探针原理：荧光谐
4、振能量传递（原理：荧光谐振能量传递（FRET）茎由互补配对的序列组成茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对环与目标序列完全配对茎茎荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂环环TACCGGGGGTTACGAACGGTAATTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTACCGGGGGTTACGAACG GTAATTTTTGCCCCCAAAAQ荧光素目标序列茎淬灭剂q定量起始模板浓度定量起始模板浓度q基因型分析基因型分析q鉴定产物鉴定产物q单核苷酸单核苷酸多态性（多态性（SNP）检测）检测q对目标序列有很高的特异性对目标序列有很高的特异性 用于用于SNPSNP检测的最灵敏的试剂之一检测的最灵敏的试剂之一q荧
5、光背景低荧光背景低q设计困难设计困难q无终点分析功能无终点分析功能q只能用于一个特定的目标只能用于一个特定的目标q价格较高价格较高探针探针荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂水解型杂交探针水解型杂交探针q目标特异性探针q5 为荧光素，3 为淬灭剂5 荧光素3淬灭剂与目标序列互补3355模板和探针杂交5533ForwardPrimerReversePrimerQR3355TACCGGGGGTTACGAACG GTAATG A T C C T A C CG A T C C C A C Cq定量起始模板浓度定量起始模板浓度q基因型分析基因型分析q产物鉴定产物鉴定qSNPSNP分析分析q对目标序列有很高的特异性 -特别适合于SNP检测q与 Molecular Beacons 相比设计相 对简单结合于双链结合于双链DNA的小沟的小沟中中发夹型杂交探发夹型杂交探针针水解型杂交探水解型杂交探针（针（5-3外外切）切）延伸延伸复性复性任何任何步骤步骤定量和检测目标基因定量和检测目标基因融解曲线分析融解曲线分析SNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因SNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因信号检测信号检测工作原理工作原理有否淬灭剂有否淬灭剂化学试剂化学试剂否否有有有有主要应用范围主要应用范围 Thank you
