三薄层色谱课件.ppt

1、一、一、平面色谱分类与分离原理平面色谱分类与分离原理二、二、技术参数与基本流程技术参数与基本流程三、三、薄层色谱薄层色谱四、四、纸色谱纸色谱五、五、薄层电泳薄层电泳学学 习习 内内 容容1.1.平面液相色谱仪的分类平面液相色谱仪的分类一平面液相色谱分类与分离原理一平面液相色谱分类与分离原理l 纸色谱法纸色谱法l 薄层色谱法薄层色谱法l 薄层电泳法薄层电泳法 2.2.平面液相色谱仪的分离原理平面液相色谱仪的分离原理一平面液相色谱分类与分离原理一平面液相色谱分类与分离原理 纸色谱、薄层色谱都属于纸色谱、薄层色谱都属于以液体为流动相以液体为流动相平面色谱分平面色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分

2、离过程中一般析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使不使用动力源用动力源。纸层析和薄层层析纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠流动相的移动是依靠毛毛细作用细作用。将试样点在色谱滤将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。，带动试样向上运动。2.2.平面液相色谱仪的分离原理平面液相色谱仪的分离原理一平面液相色谱分类与分离原理一平面液相色谱分类与分离原理纸色谱的载体：纸色谱的载体：层析滤纸，组成滤纸

3、的纤维素分子中具有很多层析滤纸，组成滤纸的纤维素分子中具有很多亲水性亲水性的羟基的羟基，当纤维素上的羟基与水结合后便形成了，当纤维素上的羟基与水结合后便形成了液液-液分液分配色谱配色谱的的固定相。固定相。纸色谱的流动相：纸色谱的流动相：即：展开剂即：展开剂 纸色谱动画纸色谱动画移动的动力：移动的动力：毛细作用。毛细作用。2.2.平面液相色谱仪的分离原理平面液相色谱仪的分离原理一平面液相色谱分类与分离原理一平面液相色谱分类与分离原理薄层色谱的载体：薄层色谱的载体：吸附材料（硅胶、氧化铝、纤维素等）均匀固化在载吸附材料（硅胶、氧化铝、纤维素等）均匀固化在载板（如：玻璃）上，形成液板（如：玻璃）上，

4、形成液-固吸附色谱的固定相。固吸附色谱的固定相。薄层色谱的流动相：薄层色谱的流动相：即：展开剂即：展开剂 薄层色谱动画薄层色谱动画1 1、2 2移动的动力：移动的动力：吸附剂颗粒间隙的毛细作用吸附剂颗粒间隙的毛细作用。2.2.平面液相色谱仪的分离原理平面液相色谱仪的分离原理一一 平面液相色谱分类与分离原平面液相色谱分类与分离原理理薄层电泳的载体：薄层电泳的载体：点有样品（蛋白质、核苷酸、多肽、糖类等）的惰性点有样品（蛋白质、核苷酸、多肽、糖类等）的惰性支持介质（纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝支持介质（纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）。胶等）。薄层电泳的介质：薄层电泳的介

5、质：电解质溶液电解质溶液 薄层电泳动画薄层电泳动画1 1、2 2移动的动力：移动的动力：外加电场外加电场。1.1.比移值比移值 R Rf f二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程 用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作称作比移值比移值，用，用R Rf f表示。表示。R Rf f=Ls/LLs/L。原原点点S SR RWWLsLsL L。LrLr原原点点参参比比样品样品前前沿沿同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。2.2.高比移值高比移值 hRhRf f二二 技术参数与基本流程技术参数

6、与基本流程hRhRf f=100 R=100 Rf f3.3.相对比移值相对比移值 R Risis R Rf f 测量中一个重要的误差来源是难以确定溶剂前沿测量中一个重要的误差来源是难以确定溶剂前沿的位置，重现性较差，因此，引入相对比移值（的位置，重现性较差，因此，引入相对比移值（R R is is）。）。R R is is=R Rfs fs/R/Rfi fi =L Ls s/L/Lr r原原点点S SR RWWLsLsL L。LrLr原原点点参参比比样品样品前前沿沿二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程3.3.相对比移值相对比移值 R Risis 比移值应该是组分的定比移值应该是组分的定

7、性技术参数，但事实上影响性技术参数，但事实上影响平面色谱的因素很多，只有平面色谱的因素很多，只有在已知对照品随行（同时展在已知对照品随行（同时展开），并且不止一种展开剂开），并且不止一种展开剂进行展开后，被分离组分的进行展开后，被分离组分的比移值与对照品完全一致时，比移值与对照品完全一致时，才可作为定性指标之一。才可作为定性指标之一。R R is is 相对较为稳定，重相对较为稳定，重复性和可比性均优于复性和可比性均优于R R f f。4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程1 1）基本材料及设备）基本材料及设备 滤纸及薄层板：滤纸及薄层板：色谱用

8、纸；自制薄层板；预制板。色谱用纸；自制薄层板；预制板。涂布器：涂布器：自制薄层板需要用涂布器将固定相在玻璃自制薄层板需要用涂布器将固定相在玻璃板上涂成符合厚度要求的均匀薄层，有手工、半自动、板上涂成符合厚度要求的均匀薄层，有手工、半自动、全自动涂布器。全自动涂布器。点样器点样器：普通毛细管；微量注射器；微量定量毛细：普通毛细管；微量注射器；微量定量毛细管。管。展开室：展开室：纸色谱展开室和薄层色谱展开室纸色谱展开室和薄层色谱展开室 显色器：显色器：薄层扫描仪：薄层扫描仪：定性及定量分析用。定性及定量分析用。4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程1

9、 1）基本材料及设备）基本材料及设备 4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程2 2）纸色谱和薄层色谱操作步骤）纸色谱和薄层色谱操作步骤 薄层色谱动画薄层色谱动画二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程a.a.层析纸和层析板层析纸和层析板 特制的色层滤纸是按需要剪裁成的长条形（或筒型）特制的色层滤纸是按需要剪裁成的长条形（或筒型）定性滤纸。定性滤纸。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，化铝，200200250250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.

10、150.150.5 mm0.5 mm）。干燥后即可使用。）。干燥后即可使用。4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程b.b.展开剂展开剂 由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：水水 =4=4：1 1：1 1。4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程c.c.点样点样 用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在

11、原点上。试样点的直径一般应小于上。试样点的直径一般应小于5mm5mm。可并排点多个试样同。可并排点多个试样同时展开。时展开。4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程d.d.展开、显色、检测展开、显色、检测 有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。碘蒸气熏或氨水熏等。4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程5.5.特点与应用特点与应用二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流

12、程特点：特点：平板色谱简单、方便、操作费用低，可以在一块层析平板色谱简单、方便、操作费用低，可以在一块层析板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开。板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开。采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果。分离效果。试样一般不需要经过预处理即可分离。试样一般不需要经过预处理即可分离。5.5.特点与应用特点与应用二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程缺点：缺点：重复性差，分离效率较低，不适用挥发性试样分离。重

13、复性差，分离效率较低，不适用挥发性试样分离。定性定量不便。定性定量不便。应用：应用：平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常作为高效液相色谱的一种预试方法。作为高效液相色谱的一种预试方法。5.5.特点与应用特点与应用二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程应用：应用：杂质检查杂质检查方法：方法：杂质对照品法（杂质对照品法（A A）、供试品自

14、身对照法（高低浓）、供试品自身对照法（高低浓度法）（度法）（B B）、对照物质法（）、对照物质法（C C）样样 对对 样样 对对 样样 对对A B C三三 薄层色谱薄层色谱1.1.概念与原理概念与原理三三 薄层色谱薄层色谱 将固定相（吸附剂或载将固定相（吸附剂或载体）涂布成一均匀薄层，点体）涂布成一均匀薄层，点样，（密闭的容器中）展开，样，（密闭的容器中）展开，斑点显色，（与对照物质）斑点显色，（与对照物质）比较进行定性和定量分析。比较进行定性和定量分析。原理：原理：组分在薄层板上组分在薄层板上多次吸附、解吸附、再吸附、多次吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。通过吸附再解吸附的过程。通过吸附

15、系数不等实现组分的分离。系数不等实现组分的分离。2.2.载板载板三三 薄层色谱薄层色谱 载板是支持吸附剂的材料。载板是支持吸附剂的材料。要求：要求：光滑平整耐腐蚀，洗净后不附水珠，常用玻璃板光滑平整耐腐蚀，洗净后不附水珠，常用玻璃板 预制板有：铝和塑料预制板有：铝和塑料 扫描用：长度为扫描用：长度为1010、1515、20cm20cm，宽度，宽度5 5、1010、20cm20cm3.3.吸附剂吸附剂硅胶、改性硅胶硅胶、改性硅胶为使用最广泛的薄层材料为使用最广泛的薄层材料 氧化铝氧化铝有碱性、中性、酸性有碱性、中性、酸性 硅藻土硅藻土为化学中性吸附剂为化学中性吸附剂 纤维素纤维素、改性纤维素、改

16、性纤维素多糖类多糖类 聚酰胺聚酰胺为特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键物为特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键物 质有特别的选择性。质有特别的选择性。4.4.添加剂和粘合剂添加剂和粘合剂三三 薄层色谱薄层色谱 （1 1）添加剂）添加剂：荧光指示剂：荧光指示剂：在在254nm254nm紫外光下发蓝色荧光的有钠荧紫外光下发蓝色荧光的有钠荧光素、硫化镉、阴极绿等。在光素、硫化镉、阴极绿等。在366nm366nm有荧光的指示剂如彩有荧光的指示剂如彩蓝等。蓝等。（2 2）粘合剂：）粘合剂：无机黏结剂：无机黏结剂：煅煅石膏（硫酸钙），无机黏结剂的优点石膏（硫酸钙），无机黏结剂的优点是：耐高温，耐酸碱，但涂铺

17、薄板动作要快，否则匀浆易是：耐高温，耐酸碱，但涂铺薄板动作要快，否则匀浆易凝固。薄层强度差。凝固。薄层强度差。有机黏结剂：羧甲基纤维素钠、淀粉、聚乙烯醇、高有机黏结剂：羧甲基纤维素钠、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特点是薄层强度高、使用方便，但不能分子聚合物等。其特点是薄层强度高、使用方便，但不能用浓硫酸作显色剂。用浓硫酸作显色剂。5.5.硅胶板常用符号硅胶板常用符号三三 薄层色谱薄层色谱 G G以石膏作粘合剂；以石膏作粘合剂；H H 没有黏结剂；没有黏结剂；P P制制备用；备用；WW水可湿性的；水可湿性的；F F254254，F F366366荧光指示剂激发荧光指示剂激发波长；波长；F

18、F254s254s抗酸性荧光指示剂；抗酸性荧光指示剂；4040，6060平均孔径；平均孔径；RPRP反相；反相；RP-8RP-8，RP-18RP-18C C8 8，C C1818烷基改性；烷基改性；CHIRCHIR手性固定相。手性固定相。如：如：GFGF254254：为用石膏作粘合剂，：为用石膏作粘合剂，254nm254nm荧光硅胶荧光硅胶板。板。6.6.薄层板的制作与活化薄层板的制作与活化三三 薄层色谱薄层色谱 薄层板涂铺要求：薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起的凹坑均匀、平整、无气泡引起的凹坑和龟裂，厚度和龟裂，厚度0.2-0.3 mm0.2-0.3 mm。例：硅胶板（粒度。例：硅胶板

19、（粒度10 10 40 40 umum）硅胶硅胶G G将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(硅胶硅胶HH水一水一般为般为13)13)，迅速研磨均匀，立即涂铺（硅胶，迅速研磨均匀，立即涂铺（硅胶HH水水=1212；氧化铝；氧化铝水水=11.5-2=11.5-2）。）。硅胶或硅胶硅胶或硅胶G G 以以CMCCMC为黏合剂。配制为黏合剂。配制0.2%0.2%0.7%CMC0.7%CMC水溶液，放置过夜，使悬浮的纤维沉降，取水溶液，放置过夜，使悬浮的纤维沉降，取上层用来配制吸附剂匀浆。上层用来配制吸

20、附剂匀浆。6.6.薄层板的制作与活化薄层板的制作与活化三三 薄层色谱薄层色谱 反相薄层板反相薄层板以不同链长的正构烷烃为固定液以不同链长的正构烷烃为固定液,配制成适当浓度的溶液配制成适当浓度的溶液(如：如：5%5%硅酮油乙醚溶液硅酮油乙醚溶液),),浸渍浸渍硅胶板。硅胶板。薄层板活化薄层板活化涂布后的薄层先在室温下阴干，在涂布后的薄层先在室温下阴干，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用。器中备用。不同薄层活化条件略有不同，如：不同薄层活化条件略有不同，如：硅硅 胶胶 110 1 h110 1 h 氧化铝氧化铝 110 30

21、min110 30 min 薄层板的涂布薄层板的涂布7.7.展开剂（流动相）展开剂（流动相）三三 薄层色谱薄层色谱（1 1）对展开剂的要求：）对展开剂的要求：能够溶解待测组分能够溶解待测组分 能使待测组分与杂质分开能使待测组分与杂质分开 使待测组分使待测组分R Rf f值在值在0.20.20.80.8 不能与组分及吸附剂发生化学反应不能与组分及吸附剂发生化学反应 展开后斑点圆而集中。展开后斑点圆而集中。（2 2）展开剂）展开剂 极性强的溶剂洗脱能力强。常用溶剂的极性强弱顺极性强的溶剂洗脱能力强。常用溶剂的极性强弱顺序：水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸序：水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯二氯甲烷

22、甲苯苯三氯乙烷四氯化碳乙酯二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳 环己烷环己烷 石油醚。石油醚。7.7.展开剂（流动相）展开剂（流动相）三三 薄层色谱薄层色谱（2 2）展开剂）展开剂 在硅胶吸附薄层上，展开时，往往先用单一的低极在硅胶吸附薄层上，展开时，往往先用单一的低极性溶剂展开，然后再按溶剂洗脱顺序依次更换极性较大性溶剂展开，然后再按溶剂洗脱顺序依次更换极性较大的溶剂进行试验。若的溶剂进行试验。若R Rf f 值太小，则加入一定量极性强的值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等；如果溶剂，如乙醇、丙酮等；如果R Rf f 值太大，则加入适量极值太大，则加入适量极性弱的溶剂（如：环己烷、石油

23、醚等），以降低极性。性弱的溶剂（如：环己烷、石油醚等），以降低极性。可加入一定比例的酸或碱，使斑点集中。可加入一定比例的酸或碱，使斑点集中。当用单一溶剂不能分离时，可用两种以上的多元展当用单一溶剂不能分离时，可用两种以上的多元展开剂，并不断改变多元展开剂的组成和比例。开剂，并不断改变多元展开剂的组成和比例。7.7.展开剂（流动相）展开剂（流动相）三三 薄层色谱薄层色谱（3 3）选择展开剂的点滴试验法）选择展开剂的点滴试验法 将要被分离的物质的溶液间隔地点在薄层将要被分离的物质的溶液间隔地点在薄层板上，待溶剂挥发干后，用吸满不同展开剂的板上，待溶剂挥发干后，用吸满不同展开剂的毛细管点到不同样品点

24、的中心，借毛细作用，毛细管点到不同样品点的中心，借毛细作用，展开剂从圆心向外扩展，这样就出现了不同的展开剂从圆心向外扩展，这样就出现了不同的圆心色谱，经过比较可以找到最合适的展开剂圆心色谱，经过比较可以找到最合适的展开剂及吸附剂。及吸附剂。7.7.展开剂（流动相）展开剂（流动相）三三 薄层色谱薄层色谱（3 3）选择展开剂）选择展开剂 选择何种极性的展开剂，必须考虑分离物质的极性及选择何种极性的展开剂，必须考虑分离物质的极性及吸附剂的活性，也就是说，要考虑被分离物质的极性、吸吸附剂的活性，也就是说，要考虑被分离物质的极性、吸附剂的活性及附剂的活性及展开剂的极性这三者之间的关系。展开剂的极性这三者

25、之间的关系。非极性非极性极性活性极性被分离物质吸附剂展开剂BA例如：非极性物质例如：非极性物质B B，选用吸附剂的活性为选用吸附剂的活性为级，展开剂应为级，展开剂应为非极性的。非极性的。8.8.点样点样三三 薄层色谱薄层色谱样品溶液的制备：样品溶液的制备：纯品的溶解纯品的溶解（用于对照定性）：将纯品直接溶于（用于对照定性）：将纯品直接溶于单一或混合溶剂中，并稀释至一定浓度即可点样；单一或混合溶剂中，并稀释至一定浓度即可点样；样品的提取及净化样品的提取及净化：对生物样品（动植物组织、：对生物样品（动植物组织、体液等）中某些成分的分离测定时，首先要将样品中体液等）中某些成分的分离测定时，首先要将样

26、品中的被测成分定量地提取出来，视含量高低稀释或浓缩的被测成分定量地提取出来，视含量高低稀释或浓缩成一定浓度的样品溶液。成一定浓度的样品溶液。对照纯品溶液的浓度与样品的浓度最好相近。对照纯品溶液的浓度与样品的浓度最好相近。8.8.点样点样三三 薄层色谱薄层色谱 要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极 性，否则易使斑点扩展。性，否则易使斑点扩展。采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。的溶剂挥发后再进行。点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以

27、最小检测量的几倍几十倍为宜。差，以最小检测量的几倍几十倍为宜。手工点样工具：定容玻璃毛细管（手工点样工具：定容玻璃毛细管（15 ul15 ul），微），微量注射器。量注射器。药典规定：点样基线距底边药典规定：点样基线距底边2.0 cm,2.0 cm,样点直径样点直径2-4 2-4 mm,mm,点间距离约为点间距离约为1.5-2.0 cm1.5-2.0 cm。9.9.展开方式展开方式三三 薄层色谱薄层色谱 多数采用多数采用直线形上行展开直线形上行展开，薄层板水平角度以，薄层板水平角度以7575 为最佳。展开距离一般为为最佳。展开距离一般为10-15 cm10-15 cm。多次展开多次展开：一次展

28、开未达满意分离时，可将薄层：一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。混合物分离为止。分步展开分步展开：混合物性质差别较大时，一种流动相：混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。连续展开连续展开：使到达薄层上缘的溶剂不断蒸发，连：使到达薄层上缘的溶剂不断蒸发，连续展开以增加展开距离。因无溶剂前沿，需要有个参续展开以增加展开距离。因无溶剂前沿，需要有个参照物同时展开，以计算相对保留值。照物同时展开，以计算相对保留

29、值。9.9.展开方式展开方式三三 薄层色谱薄层色谱原点12 二维展开二维展开：在两个垂直的方向上进行展开。将样品：在两个垂直的方向上进行展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成再将薄层板以与原展开方向成90 90 的方向进行展开。的方向进行展开。9.9.展开方式展开方式三三 薄层色谱薄层色谱 离心展开离心展开：薄层板以适当转速旋转时，流动相以：薄层板以适当转速旋转时，流动相以适当速率转移到薄层上。该技术主要用于制备色谱。适当速率转移到薄层上。该技术主要用于制备色谱。锲尖技术锲尖技术：圆形离心展开具有分

30、辨率高的优点，：圆形离心展开具有分辨率高的优点，但需要有一定的仪器装置。采用锲尖技术可以在一般但需要有一定的仪器装置。采用锲尖技术可以在一般的展开室中进行类似展开。的展开室中进行类似展开。薄层被刮薄层被刮掉部分掉部分溶剂前沿10.10.显色定位显色定位三三 薄层色谱薄层色谱 物理方法：物理方法：可见光下不显色、但可吸收紫外光，可见光下不显色、但可吸收紫外光，紫外光下显示荧光斑点或荧光淬灭紫外光下显示荧光斑点或荧光淬灭 化学方法：化学方法：加化学试剂显色，要求显色稳定、持加化学试剂显色，要求显色稳定、持久、专属、灵敏、线性良好。常用显色剂为硫酸、碘、久、专属、灵敏、线性良好。常用显色剂为硫酸、碘

31、、磷钼酸、三氯化锑；专属性显色剂主要有改良碘化鉍磷钼酸、三氯化锑；专属性显色剂主要有改良碘化鉍钾、香草醛硫酸钾、香草醛硫酸 斑点定位方法：斑点定位方法：碘；挥发性酸碱：盐酸、硝酸、碘；挥发性酸碱：盐酸、硝酸、浓氨水、二乙胺浓氨水、二乙胺 如：如：碘蒸气法：碘蒸气法：灵敏、简便，为通用显色法。将灵敏、简便，为通用显色法。将碘结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，使缸内充满碘结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，使缸内充满紫色的碘蒸气。将展开后的板挥干溶剂置碘缸中至薄紫色的碘蒸气。将展开后的板挥干溶剂置碘缸中至薄层色谱上出现棕色斑点。放置时间不宜太长，否则背层色谱上出现棕色斑点。放置时间不宜太长，否则背景

32、吸附剂也吸附碘，使信噪比降低。用针头将斑点标景吸附剂也吸附碘，使信噪比降低。用针头将斑点标记下来，放在通风处使碘挥发。记下来，放在通风处使碘挥发。11.11.定性定量定性定量三三 薄层色谱薄层色谱定性：定性：色谱鉴定利用色谱鉴定利用R Rf f值值化学鉴定试剂显色反应化学鉴定试剂显色反应薄层色谱与薄层色谱与UVUV、GCGC、HPLCHPLC、IRIR、MSMS、NMRNMR联用联用定量：定量：洗脱后定量法洗脱后定量法UVUV、HPLCHPLC、GCGC、原位定量法薄层扫描法、目视比较法（如杂质限原位定量法薄层扫描法、目视比较法（如杂质限度检查方法）度检查方法）四四 纸色谱纸色谱 纸色谱利用滤

33、纸作为支持体，吸附在滤纸上纸色谱利用滤纸作为支持体，吸附在滤纸上的少量水分作为固定相，这是的少量水分作为固定相，这是19441944年开始出现的年开始出现的一种液一种液-液分配色谱。液分配色谱。纸色谱利用滤纸中含约纸色谱利用滤纸中含约20%20%的水分作为固定的水分作为固定相，样品点放在滤纸上，用有机溶剂展开。相，样品点放在滤纸上，用有机溶剂展开。纸色谱动画纸色谱动画四四 纸色谱纸色谱 比移值的重现对确定物质组成有重要意义，比移值的重现对确定物质组成有重要意义，若条件选择合适，可以将比值控制在若条件选择合适，可以将比值控制在R Rf f0.020.02范范围，因而操作中应注意围，因而操作中应注

34、意:1 1）层析分离时温度应恒定，至少差别较小。）层析分离时温度应恒定，至少差别较小。2 2）层析器应密闭，以防组分挥发。）层析器应密闭，以防组分挥发。3 3）层析器中滤至于层析器要用流动相饱和。）层析器中滤至于层析器要用流动相饱和。4 4）最好使用同一批滤纸）最好使用同一批滤纸,以使滤纸常数一致。以使滤纸常数一致。1.1.获得重现的比移值应注意的事项获得重现的比移值应注意的事项四四 纸色谱纸色谱 纸色谱中，利用物质在水相和有机相中的溶解度不纸色谱中，利用物质在水相和有机相中的溶解度不同而彼此分离。如物质在水相中溶解度大则展开时不易同而彼此分离。如物质在水相中溶解度大则展开时不易移动，移动，R

35、 Rf f值小，相反，如物质在有机相中溶解度大，则值小，相反，如物质在有机相中溶解度大，则展开时移动距离大，展开时移动距离大，R Rf f值大。因此，为了对多种物质进值大。因此，为了对多种物质进行分离，必须选择适当的溶剂作展开剂。行分离，必须选择适当的溶剂作展开剂。一般有机化合物在有机溶剂中溶解度皆有一定的差一般有机化合物在有机溶剂中溶解度皆有一定的差别，所以，可以用水饱和的有机溶剂对许多有机化合物别，所以，可以用水饱和的有机溶剂对许多有机化合物进行有效的分离；对无机离子讲，大多数不溶或难溶于进行有效的分离；对无机离子讲，大多数不溶或难溶于有机溶剂中。因此，在无机纸色谱分离中，常加某些络有机溶

36、剂中。因此，在无机纸色谱分离中，常加某些络合剂与无机离子形成能溶于有机相中的络合物合剂与无机离子形成能溶于有机相中的络合物。2.2.纸色谱中溶剂的选择纸色谱中溶剂的选择四四 纸色谱纸色谱 常用的展开剂：常用的展开剂：水、甲酰胺、甲醇、乙酸、乙水、甲酰胺、甲醇、乙酸、乙醇、异丙醇、丙酮、正丙醇、叔丁醇、苯酚、正戊醇、异丙醇、丙酮、正丙醇、叔丁醇、苯酚、正戊醇、正丁醇、乙酸乙脂、乙醚、乙酸正丁脂、氯仿、醇、正丁醇、乙酸乙脂、乙醚、乙酸正丁脂、氯仿、苯、甲苯、环己烷、石油醚，以上展开剂的极性由苯、甲苯、环己烷、石油醚，以上展开剂的极性由强至弱。强至弱。2.2.纸色谱中溶剂的选择纸色谱中溶剂的选择1.

37、1.电泳的概念和分类电泳的概念和分类五五 薄层电泳薄层电泳 电泳是指带电荷的粒子在直流电场中，向带符电泳是指带电荷的粒子在直流电场中，向带符号相反的电极的移动，是一种电动现象。号相反的电极的移动，是一种电动现象。蛋白质、核酸或其他多电解质则由其本身所具蛋白质、核酸或其他多电解质则由其本身所具有的功能团的解离而带电。蛋白质具有正负两类解有的功能团的解离而带电。蛋白质具有正负两类解离基，称为两性电解质。蛋白质在酸性介质中带正离基，称为两性电解质。蛋白质在酸性介质中带正电，在碱性介质中则带负电。在某一电，在碱性介质中则带负电。在某一pHpH值时，其正值时，其正负电荷相等，此时的负电荷相等，此时的pH

38、pH即称为该蛋白质的等电点。即称为该蛋白质的等电点。五五 薄层电泳薄层电泳1.1.电泳的概念和分类电泳的概念和分类按分离的原理区分按分离的原理区分区带电区带电泳泳移界电泳移界电泳等速电泳等速电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳五五 薄层电泳薄层电泳1.1.电泳的概念和分类电泳的概念和分类按电泳进行按电泳进行的介质区分的介质区分区带电区带电泳泳自由电泳自由电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳显微镜电泳显微镜电泳(细胞电泳细胞电泳)移界电泳移界电泳柱电泳柱电泳自由流动幕电泳自由流动幕电泳等速电泳等速电泳滤纸电泳滤纸电泳薄层电泳薄层电泳凝胶电泳凝胶电泳免疫电泳免疫电泳高压电泳高压电泳电泳动画电泳动画1 1、2 2、

39、3 3、4 4五五 薄层电泳薄层电泳1.1.电泳的概念和分类电泳的概念和分类区带电泳区带电泳：是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层：是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。不同的离子成分在均一的缓冲液中迁移。不同的离子成分在均一的缓冲液(或称载体电或称载体电解质解质)系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出示出来，如果用光密度计扫描可得出个个互相分离的个个互相分离的峰，与洗脱色谱的图形相似，电泳的区带随时间延长和峰，

40、与洗脱色谱的图形相似，电泳的区带随时间延长和距离加大而扩散严重，影响分辨率。加不同的介质可以距离加大而扩散严重，影响分辨率。加不同的介质可以减少扩散，特别是在凝胶中进行，它兼具分子筛的作用，减少扩散，特别是在凝胶中进行，它兼具分子筛的作用，分辨率大大提高，是应用最广泛的电泳技术。分辨率大大提高，是应用最广泛的电泳技术。五五 薄层电泳薄层电泳2.2.常用电泳分离技术常用电泳分离技术1 1）琼脂糖凝胶电泳）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是由琼脂经过反复洗涤除去含硫酸根的多糖琼脂糖是由琼脂经过反复洗涤除去含硫酸根的多糖之后制成的，将它加入一定缓冲液中，加热溶解，冷却之后制成的，将它加入一定缓冲液中，加热溶解

41、，冷却后则成胶，叫琼脂糖凝胶。后则成胶，叫琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶电泳法，主要用于分离、鉴定和纯化琼脂糖凝胶电泳法，主要用于分离、鉴定和纯化DNADNA片段。用溴化乙锭片段。用溴化乙锭(EB)(EB)染色，在紫外灯下，凝胶中染色，在紫外灯下，凝胶中1ng1ng的的DNADNA即能直接观察到。即能直接观察到。琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依赖它们的琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依赖它们的分子量及分子构型。而凝胶的类型及其浓度对被分离核分子量及分子构型。而凝胶的类型及其浓度对被分离核酸的分子大小关系重大。酸的分子大小关系重大。五五 薄层电泳薄层电泳2.2.常用电泳分离技术常用电泳分离技术1

42、1）琼脂糖凝胶电泳）琼脂糖凝胶电泳 利用琼脂糖凝胶电泳分离利用琼脂糖凝胶电泳分离DNADNA主要包括制胶、加样、主要包括制胶、加样、电泳、染色和检出五个步骤。电泳、染色和检出五个步骤。制胶制胶 称取琼脂糖粉末，以称取琼脂糖粉末，以pH 8.0pH 8.0的乙酸钠的乙酸钠-Tris-Tris缓冲液（缓冲液（0.4 mol/L 0.4 mol/L TrisTris、0.2 mol/L0.2 mol/L乙酸钠溶液、乙酸钠溶液、0.01 mol/L EDTA0.01 mol/L EDTA，用冰乙酸调到，用冰乙酸调到pH 8.0pH 8.0）配成）配成1%1%溶液。琼脂糖难溶，应于沸水浴中煮溶，或于溶液

43、。琼脂糖难溶，应于沸水浴中煮溶，或于高压锅中煮溶。将制胶模具垂直放置，周围用硅油（或其他密高压锅中煮溶。将制胶模具垂直放置，周围用硅油（或其他密封物质）密封，或用夹子夹紧，以免胶液泄漏。溶液从顶部灌封物质）密封，或用夹子夹紧，以免胶液泄漏。溶液从顶部灌注。灌胶完成后从顶部插入梳子，以形成加样孔。梳子宽度取注。灌胶完成后从顶部插入梳子，以形成加样孔。梳子宽度取决于玻璃板的宽度，梳子的厚度和凝胶的厚度取决于隔板的厚决于玻璃板的宽度，梳子的厚度和凝胶的厚度取决于隔板的厚度。室温下放置度。室温下放置1 12 2小时，待胶柱呈灰白色半透明状态则表明小时，待胶柱呈灰白色半透明状态则表明已聚合完毕。已聚合完

44、毕。五五 薄层电泳薄层电泳2.2.常用电泳分离技术常用电泳分离技术1 1）琼脂糖凝胶电泳）琼脂糖凝胶电泳 加样加样 加样前轻轻将梳子倾斜拔出，防止气泡陷入，用电极加样前轻轻将梳子倾斜拔出，防止气泡陷入，用电极缓冲液淋洗加样孔，吸出，再加适量电极缓冲液。取缓冲液淋洗加样孔，吸出，再加适量电极缓冲液。取0.5g0.5g左右的样品，如为质粒左右的样品，如为质粒DNADNA或它的或它的EcoRIEcoRI的酶解液，的酶解液，体积为体积为50L50L左右，加入左右，加入1/41/4体积的溴酚蓝体积的溴酚蓝-甘油指示剂混合甘油指示剂混合后，用微量注射器小心地将样品加成一细窄带，否则影响后，用微量注射器小心

45、地将样品加成一细窄带，否则影响电泳分辨率。如果没有足够数目的样品，应在加样孔中加电泳分辨率。如果没有足够数目的样品，应在加样孔中加样品缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近带的扩展。样品缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近带的扩展。五五 薄层电泳薄层电泳2.2.常用电泳分离技术常用电泳分离技术1 1）琼脂糖凝胶电泳）琼脂糖凝胶电泳 电泳电泳 按说明书先在电泳槽的下槽中装入电极缓冲液。将聚按说明书先在电泳槽的下槽中装入电极缓冲液。将聚合后的凝胶连同模具一起移入电泳槽中，在上槽中注入电合后的凝胶连同模具一起移入电泳槽中，在上槽中注入电极缓冲液，打开冷却循环系统，连接电源。一般起始电压极缓冲液，打

46、开冷却循环系统，连接电源。一般起始电压约为约为707080V80V，然后不断升高。起始电流可设置为，然后不断升高。起始电流可设置为202030mA30mA，取决于凝胶厚度、大小和样品数。待溴酚蓝前沿，取决于凝胶厚度、大小和样品数。待溴酚蓝前沿到达电泳槽底部（阳极时），切断电源，关掉冷却系统，到达电泳槽底部（阳极时），切断电源，关掉冷却系统，取出凝胶，准备染色。取出凝胶，准备染色。五五 薄层电泳薄层电泳2.2.常用电泳分离技术常用电泳分离技术1 1）琼脂糖凝胶电泳）琼脂糖凝胶电泳 染色染色 用菲啶溴红染色液浸泡凝胶用菲啶溴红染色液浸泡凝胶1010分钟，然后倒出染色液，分钟，然后倒出染色液，将凝胶

47、移到磨砂玻璃上。将凝胶移到磨砂玻璃上。检出检出 将凝胶板置于紫外灯下，约将凝胶板置于紫外灯下，约3 3分钟后可见到胶板中呈分钟后可见到胶板中呈现具有红色荧光的条带，该条带标志着现具有红色荧光的条带，该条带标志着DNADNA所在位置。所在位置。琼脂糖凝胶电泳动画琼脂糖凝胶电泳动画五五 薄层电泳薄层电泳2.2.常用电泳分离技术常用电泳分离技术2 2）醋酸纤维素膜电泳）醋酸纤维素膜电泳 醋酸纤维素膜电泳是以醋酸纤维素膜为支持介质，醋酸纤维素膜电泳是以醋酸纤维素膜为支持介质，其电泳原理与纸电泳基本相同。其电泳原理与纸电泳基本相同。醋酸纤维素膜电泳的优点：醋酸纤维素膜电泳的优点：对蛋白质样品的吸附对蛋白

48、质样品的吸附作用极小，几乎完全消除了作用极小，几乎完全消除了“拖尾拖尾观象，染色后背景观象，染色后背景清晰，分离带狭窄清楚，提高了定量测定的精确性。清晰，分离带狭窄清楚，提高了定量测定的精确性。醋酸纤维素膜的亲水性小，电泳时电流的大部分是由样醋酸纤维素膜的亲水性小，电泳时电流的大部分是由样品传导的，分离速度快、电泳时间短。品传导的，分离速度快、电泳时间短。样品用量少、样品用量少、灵敏度高。灵敏度高。可分离某些用纸电泳不易分离的蛋白质，可分离某些用纸电泳不易分离的蛋白质，例如溶菌酶、胰岛素、组蛋白等。例如溶菌酶、胰岛素、组蛋白等。电泳图谱经冰醋酸电泳图谱经冰醋酸乙醇溶液或其他透明液处理后可使膜质

49、透明化，从而有乙醇溶液或其他透明液处理后可使膜质透明化，从而有利于光吸收扫描测定和膜的长期保存。利于光吸收扫描测定和膜的长期保存。五五 薄层电泳薄层电泳2.2.常用电泳分离技术常用电泳分离技术3 3）聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶有一定的网状结构，它是由丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶有一定的网状结构，它是由丙烯酰胺和胺和N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺（简称亚甲基双丙烯酰胺（简称BisBis或亚甲基双丙烯酰或亚甲基双丙烯酰胺）聚合交联而成的。形成凝胶是胺）聚合交联而成的。形成凝胶是种化学聚合过程，种化学聚合过程，可人为控制聚合成具有一定大小孔径的凝胶。若形成的可人为控制聚合成具有

50、一定大小孔径的凝胶。若形成的孔径大小接近于所分离样品分子的平均半径，在电泳过孔径大小接近于所分离样品分子的平均半径，在电泳过程中，样品分子在通过凝胶孔洞时，所受到的阻力就会程中，样品分子在通过凝胶孔洞时，所受到的阻力就会和样品分子的大小及形状密切相关。这样，就为净电荷和样品分子的大小及形状密切相关。这样，就为净电荷很相近的物质的分离又提供了一种可变的分离因素。通很相近的物质的分离又提供了一种可变的分离因素。通常我们称这种有利因素为分子筛作用。常我们称这种有利因素为分子筛作用。五五 薄层电泳薄层电泳2.2.常用电泳分离技术常用电泳分离技术3 3）聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺