Chapter-2-蛋白质-3-蛋白质分离技术课件.ppt

1、Chapter 2 Chapter 2 蛋白质蛋白质Chapter 2 蛋白质蛋白质2.1 2.1 蛋白质的概念、重要性及分类蛋白质的概念、重要性及分类2.2 2.2 氨基酸氨基酸2.3 2.3 蛋白质的结构蛋白质的结构2.4 2.4 蛋白质的结构和功能的关系蛋白质的结构和功能的关系2.5 2.5 蛋白质的性质蛋白质的性质2.6 2.6 蛋白质的提取、分离和纯化蛋白质的提取、分离和纯化2.6 蛋白质的分离、纯化蛋白质的分离、纯化 研究一个新的蛋白质首先要从它的研究一个新的蛋白质首先要从它的基本基本性质性质作为突破口，然后作为突破口，然后根据它的基本性质进根据它的基本性质进行分离纯化行分离纯化，

2、最终用，最终用纯品纯品对其进行分析鉴定。对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。起来将会困难重重。因此，蛋白质研究技术主要是因此，蛋白质研究技术主要是对蛋白质对蛋白质的基本性质进行的分析鉴定的基本性质进行的分析鉴定。研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。得到纯的蛋白质样品。(1)(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；胞；(2)2)分离和纯化过程都必须分离和纯化过程都必须0 04 4的低温的低温下进行。下进行。蛋白质

3、的分离、纯化蛋白质的分离、纯化1蛋白质的分离步骤蛋白质的分离步骤(1)(1)生物组织的生物组织的机械破碎机械破碎。常用的方法有。常用的方法有研磨研磨法、超声波法、冻融法和酶解法法、超声波法、冻融法和酶解法等。等。(2)(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提抽提。水溶性蛋白用水溶性蛋白用中性缓冲溶液中性缓冲溶液抽提；抽提；酸性蛋白用酸性蛋白用稀碱性溶液稀碱性溶液抽提；抽提；脂溶性蛋白用脂溶性蛋白用表面活性剂表面活性剂抽提等。抽提等。(3)(3)粗提粗提:离心除去固体杂质后，可通过盐析、离心除去固体杂质后，可通过盐析、沉淀法、凝胶滤法、超过滤等处理，得到

4、蛋白沉淀法、凝胶滤法、超过滤等处理，得到蛋白质粗制品。质粗制品。(4)(4)精制精制：可用层析法、电泳法等进行精制。：可用层析法、电泳法等进行精制。(5)(5)成品成品加工加工：测定蛋白质的性质并干燥成成：测定蛋白质的性质并干燥成成品。品。2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 透析是利用透析是利用蛋白质分子不能透过半透蛋白质分子不能透过半透膜膜，而使它与，而使它与其它小分子化合物其它小分子化合物，如，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及水等分离。以及水等分离。常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢纸、火棉纸和其它合成材料。膜有纸、火棉纸和其

5、它合成材料。膜有玻璃纸玻璃纸或或高分子合成材料高分子合成材料，截止分，截止分子量一般为子量一般为1 1万万。（1）透析法（）透析法（dialysis)透析法透析法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。网状结构。凝胶层析介质：凝胶层析介质：SephadexSephadex-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G10-G200G10-G200SepharoseSepharose-琼脂糖凝胶琼

6、脂糖凝胶2 2B,4B,6BB,4B,6BSephacrylSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400S100,S200,S300,S400 凝胶过滤原理凝胶过滤原理 当不同大小的蛋白质颗粒流经凝胶柱当不同大小的蛋白质颗粒流经凝胶柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠内的网状结构，时，比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠内的网状结构，而被排阻在凝胶珠外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下而被排阻在凝胶珠外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外

7、。出入凝胶珠的内外。大分子大分子小分小分子子 凝胶颗粒凝胶颗粒凝胶排阻凝胶排阻示意图解示意图解 蛋白质分子一般有两种形状，一种是蛋白质分子一般有两种形状，一种是球形分球形分子子，另一种是，另一种是线性分子线性分子。线性蛋白质分子与球形。线性蛋白质分子与球形分子比较，同样大小分子量的蛋白质，线性分子分子比较，同样大小分子量的蛋白质，线性分子体积大流速快，球形分子体积小流速慢。因此，体积大流速快，球形分子体积小流速慢。因此，在凝胶色谱柱中无论是球形分子还是线性分子都在凝胶色谱柱中无论是球形分子还是线性分子都可进行分离，但球形分子比线性分子的分离度好。可进行分离，但球形分子比线性分子的分离度好。此法

8、是利用此法是利用离子交换剂离子交换剂作为柱层析支持物，将带作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。离子交换树脂可以分为离子交换树脂可以分为阳离子阳离子交换树脂（如羧甲交换树脂（如羧甲基纤维素等），基纤维素等），阴离子阴离子交换树脂（如二乙基氨基交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。乙基纤维素等）。带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓度的用不同浓度的阳离子洗脱液阳离子洗脱液，如，如NaClNaCl溶液进行溶液进行梯度洗脱，通过梯度洗

9、脱，通过Na+Na+的离子交换作用，或是改变的离子交换作用，或是改变流动相的流动相的PHPH值值，或是同时采用这两种方法，可，或是同时采用这两种方法，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。离子交换层析离子交换层析2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法离子交换层析离子交换层析这是一种这是一种高效分离纯化蛋白高效分离纯化蛋白的方法。其原理的方法。其原理是不同是不同的蛋白质分子的蛋白质分子对于固定化在载体上的对于固定化在载体上的特殊配基特殊配基具有具有不同的识别不同的识别和和结合能力结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的选择与待纯化蛋白质具有特殊识别

10、和结合作用的配配基基，然后应用化学方法将该，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接配基与载体共价连接。将这种将这种连接有配基的载体连接有配基的载体装入层析柱中，当含有装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液或高盐溶液洗脱。配体洗脱液或高盐溶液洗脱。2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法+CCC配基配基蛋白质蛋

11、白质1.配基固相化配基固相化2.亲和吸附亲和吸附固体载体固体载体3.解吸附解吸附在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为性相反的电极移动，这种现象称为电泳电泳。带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v v）取决于电场强度取决于电场强度(E)E)，所带的净电荷所带的净电荷(q)q)以及以及与介质的摩擦系数与介质的摩擦系数(f)f)。常用的电泳方法有常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳电聚焦电泳、双向电泳等。等。2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 SD

12、S-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，也称为十二烷基酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，也称为十二烷基酸钠-聚聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺凝胶电泳(sodium(sodium dodecyldodecyl sulphate-sulphate-polyacrylamidepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)gel electrophoresis,SDS-PAGE)。主要用于蛋白质亚基分子量的测定。主要用于蛋白质亚基分子量的测定。(1)(1)原理：原理：a.a.蛋白质分子状态蛋白质分子状态在自然状态下

13、蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子。在电场下向自身电荷相反的方向移动。定净电荷的分子。在电场下向自身电荷相反的方向移动。b.b.还原剂的解聚作用还原剂的解聚作用 在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂-巯基乙巯基乙醇醇(-mercaptoethanolmercaptoethanol)或二硫苏糖醇或二硫苏糖醇(DithiothretiolDithiothretiol

14、,DTT)DTT)。蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形成长短聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形成长短不一的单链亚基。不一的单链亚基。c.SDSc.SDS的包裹作用的包裹作用 SDSSDS分子中含有大量的带负电的磺酸基。蛋白质分子解聚后形分子中含有大量的带负电的磺酸基。蛋白质分子解聚后形成的氨基酸侧链与成的氨基酸侧链与SDSSDS结合，在结合，在SDSSDS的重量达到蛋白重量的的重量达到蛋白重量的3-43-4倍时倍时蛋白质分子表面完全被蛋白质分子表面完全被SDSSDS包裹，形成包裹，形成带负电荷的

15、蛋白质亚基分子带负电荷的蛋白质亚基分子，称之为蛋白质称之为蛋白质-SDS-SDS复合物复合物(protein-SDS micelles)(protein-SDS micelles)。由于蛋白质由于蛋白质-SDS-SDS复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的净电荷，这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异。净电荷，这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异。d.d.聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用 不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白质质-SDS-SDS复合物具有阻滞作

16、用。在电场下，复合物具有阻滞作用。在电场下，分子量大的亚基受阻大，分子量大的亚基受阻大，电泳速度慢，走在小分子的后面；电泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亚基受阻小，电泳速分子量小的亚基受阻小，电泳速度快，度快，走在大分子的前面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现走在大分子的前面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现出不同的电泳速度，这样就把同一样品中不同大小分子量的亚基分出不同的电泳速度，这样就把同一样品中不同大小分子量的亚基分开。开。(2)2)操作过程操作过程制胶制胶 加样加样 电泳电泳 固定固定 染色染色 脱色脱色 计算计算(3)3)结果处理结果处理a.a.电泳图谱电泳图谱1 2 3b

17、 b.标准曲线标准曲线绘制标准曲线：以标准蛋白质分子量的对数绘制标准曲线：以标准蛋白质分子量的对数log(M)log(M)为纵坐标，为纵坐标，RfRf值值为横坐标，绘制标准曲线。为横坐标，绘制标准曲线。44.24.44.64.855.200.20.40.60.81mRlgMr兔肌动蛋白牛血清白蛋白兔磷酸化酶牛碳酸酐酶胰蛋白酶抑制剂鸡蛋清溶菌酶c.c.未知蛋白分子量计算：未知蛋白分子量计算：将未知蛋白的将未知蛋白的RfRf值查到值查到log(M)log(M)值，便可知其分子量。计算分子量。值，便可知其分子量。计算分子量。(4)4)影响因素影响因素 影响影响SDS-SDS-复合物形成的主要因素。复

18、合物形成的主要因素。SDS-SDS-电泳成败关之一，是在电泳成败关之一，是在制备样品的过程中，蛋白质与制备样品的过程中，蛋白质与SDSSDS结合的程度直接影响电泳分离效结合的程度直接影响电泳分离效果。影响结合的因素主要有三个果。影响结合的因素主要有三个:A.A.溶液中溶液中SDSSDS单体的浓度单体的浓度 SDSSDS在水溶液中以单体和在水溶液中以单体和SDSSDS复合物混合存在的，能与蛋白质结复合物混合存在的，能与蛋白质结合的只能是单体。单体的浓度与合的只能是单体。单体的浓度与SDSSDS总浓度，温度和离子强度有关。总浓度，温度和离子强度有关。在一定温度和离子强度下，在一定温度和离子强度下，

19、SDSSDS处于一饱和值，即单体浓度不再随处于一饱和值，即单体浓度不再随SDSSDS中浓度增加而增加。为了使中浓度增加而增加。为了使SDSSDS与蛋白质结合充分，与蛋白质结合充分，SDSSDS和蛋白和蛋白质结合的重量比一般是质结合的重量比一般是4:14:1或或3:13:1。B.B.样品缓冲液离子强度样品缓冲液离子强度 因为因为SDSSDS结合到蛋白质分子上的量取决于平衡时结合到蛋白质分子上的量取决于平衡时SDSSDS单体浓度，单体浓度，而不是总浓度，只有在较低的离子强度溶液中，而不是总浓度，只有在较低的离子强度溶液中，SDSSDS单体才具有较单体才具有较高的平衡浓度，所以样品缓冲液应选用低离子

20、强度，通常是高的平衡浓度，所以样品缓冲液应选用低离子强度，通常是10-10-100mmol/l100mmol/l之间。之间。C.C.二硫键是否完全打开二硫键是否完全打开 只有蛋白质分子中的二硫键完全被打开，蛋白质分子完全解聚，只有蛋白质分子中的二硫键完全被打开，蛋白质分子完全解聚，SDSSDS充分与亚基分子结合，才能准确测定出亚基分子量。二硫键完充分与亚基分子结合，才能准确测定出亚基分子量。二硫键完全被打开要取决于巯基乙醇的质量和使用的剂量。若蛋白质分子的全被打开要取决于巯基乙醇的质量和使用的剂量。若蛋白质分子的二硫键只是部分被打开，这是测出的分子量是蛋白质分子和亚基分二硫键只是部分被打开，这

21、是测出的分子量是蛋白质分子和亚基分子的混合物。子的混合物。等电聚焦电泳等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF）a.原理原理:通常是指聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳。它是通常是指聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳。它是6060年代初建立起年代初建立起来的一种蛋白质分离手段，现在已经成为单向蛋白质电泳分辨率最来的一种蛋白质分离手段，现在已经成为单向蛋白质电泳分辨率最高的一种分离技术。高的一种分离技术。它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的差异进行电泳它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的差异进行电泳分离和分析。分离和分析。蛋白质在一个稳定的线性蛋白质在一个稳定的线性pHpH梯度

22、的凝胶中电泳，蛋白梯度的凝胶中电泳，蛋白质朝着与自身电荷相反的方向移动，在移动的过程中不断被凝胶中质朝着与自身电荷相反的方向移动，在移动的过程中不断被凝胶中的反离子中和，最后静电荷完全被中和而停止运动，聚焦在等电点的反离子中和，最后静电荷完全被中和而停止运动，聚焦在等电点的位置。的位置。b.b.蛋白质与两性电解质蛋白质与两性电解质(1)(1)蛋白质的等电点蛋白质的等电点 蛋白质属于一种两性电解质。在不同的蛋白质属于一种两性电解质。在不同的pHpH环境中所带的正负电环境中所带的正负电荷不同。若在某特定的荷不同。若在某特定的pHpH环境中其净电荷为零，此时的环境中其净电荷为零，此时的pHpH为该蛋

23、白为该蛋白质的等电点，在电场下不泳动。质的等电点，在电场下不泳动。(2)(2)载体两性电解质：载体两性电解质：在等电聚焦电泳中，载体两性电解质具有以下两种功能：在等电聚焦电泳中，载体两性电解质具有以下两种功能：A 中和功能：中和功能：两性电解质的性质在分离系统中形成一个平衡稳定的两性电解质的性质在分离系统中形成一个平衡稳定的pHpH梯度，提供中和蛋白质电荷的离子，具有梯度，提供中和蛋白质电荷的离子，具有pHpH缓冲能。缓冲能。B 载电功能：载电功能：两性电解质作为电的载体，具有运载两性电解质作为电的载体，具有运载“电流电流”的能力，的能力，有良好的导电性能有良好的导电性能水平板式电泳槽水平板式

24、电泳槽垂直板式电泳槽垂直板式电泳槽等电聚焦等电聚焦时，蛋白质混合物的分离是在具有时，蛋白质混合物的分离是在具有PHPH梯度的介质梯度的介质中进行的。在电场中，每种蛋白质成分将移向并中进行的。在电场中，每种蛋白质成分将移向并“聚焦聚焦”（停留在等于其等电点的（停留在等于其等电点的PHPH梯度处，形成一个很窄的区带。梯度处，形成一个很窄的区带。它的分辨率很高，可以把人的血清分成它的分辨率很高，可以把人的血清分成4040多个区带。适于多个区带。适于做同工酶的鉴定。做同工酶的鉴定。方法方法:制胶制胶 加样加样 电泳电泳 固定固定 染色染色 脱色脱色 计算计算等电聚焦等电聚焦 双向电泳（双向电泳（two

25、-dimensional electrophoresistwo-dimensional electrophoresis）双向电泳是双向电泳是等电聚焦电泳等电聚焦电泳和和SDS-PAGESDS-PAGE的组合，即先进的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照行等电聚焦电泳（按照pIpI分离），然后再进行分离），然后再进行SDS-PAGESDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。蛋白质图。肽的化学合成（了解）肽的化学合成（了解）五、六十年代，世界上，包括我国主五、六十年代，世界上，包括我国主要是从动物器脏获取肽。如：胸腺肽

26、这种要是从动物器脏获取肽。如：胸腺肽这种胸腺肽主要用于人体免疫。目前，这种肽胸腺肽主要用于人体免疫。目前，这种肽已处于淘汰状态已处于淘汰状态。世界上有固相合成法、液相合成法生产的世界上有固相合成法、液相合成法生产的肽。用这种方法生产肽的企业在美国硅谷就肽。用这种方法生产肽的企业在美国硅谷就有一家。他们主要是购买世界上一些精细化有一家。他们主要是购买世界上一些精细化工厂生产的氨基酸为原料，用工厂生产的氨基酸为原料，用固相合成法固相合成法、液相合成法液相合成法，定向合成某种单肽。属医药原，定向合成某种单肽。属医药原料中间体，其用途主要用于西药配方，以增料中间体，其用途主要用于西药配方，以增强药效、增强人体对药的吸收速度和吸收率强药效、增强人体对药的吸收速度和吸收率。