HIV艾滋病抗体实室检测方法HIV上岗证培训 课件.ppt

1、艾滋病抗体实验室检测方法艾滋病抗体实验室检测方法主要内容 HIV检测一般情况：窗口期、检测样本及流程 关于样本实验室操作：采集、处理、检测、转运 常用筛查方法艾滋病检测意义艾滋病：影响人类健康的全球性灾难 我国艾滋病的流行形势也日趋严峻 据估算，我国大约只有10%艾滋病病毒感染者被发现，其余90%处于未知状态，这对相关的预防、治疗和关怀工作带来极大挑战 要找到尚未发现的感染者，实验室检测工作必不可少感染HIV后的血清学变化HIV RNA浓度浓度窗口期 窗口期：机体感染HIV到能检出抗体之间的时期 第三代HIV抗体检测试剂盒能使大部分感染者在4-8周后检测出HIV抗体 如果到如果到1212周（即

2、周（即3 3个月）仍检测不出抗体，基本可个月）仍检测不出抗体，基本可以排除以排除HIVHIV感染，对抗体检测呈不确定反应或高危感染，对抗体检测呈不确定反应或高危行为后高度怀疑有感染危险者，可再随访行为后高度怀疑有感染危险者，可再随访3 3个月后个月后复检。必要时可做复检。必要时可做HIV-1 p24HIV-1 p24抗原或抗原或HIVHIV核酸检测核酸检测作为辅助诊断作为辅助诊断 检测样品：血液、组织液、排泄物、组织、器官、精液以及有关血液制品、生物组织或其它物品等 进行艾滋病病毒HIV或其相应标志物的实验室测定，包括HIV分离、抗原检测、核酸检测和抗体检测抗体检测等 目前用于HIV诊断的常规

3、方法为血液中HIV抗体检测，我国目前检测血液中HIV抗体的常规检测程序分为筛查试验筛查试验（包括初筛和复检）和确认试验确认试验 HIV抗体筛查实验流程图样本样本阳性反应阳性反应一阴一阳一阴一阳阴性反应阴性反应筛查检测筛查检测均阳性反应均阳性反应重复检测重复检测均阴性反应均阴性反应送确认实验室进行确认送确认实验室进行确认阴性报告阴性报告筛查试剂筛查试剂原有试剂加另外一种筛查试剂原有试剂加另外一种筛查试剂设备要求设备要求 主要仪器设备包括 生物安全柜、离心机、酶标读数仪、洗板机、移液器、温箱/水浴箱、冰箱、高压蒸汽灭菌器 所用的仪器应该校准，每次使用后应做记录 为保证人员安全，实验室内的耗材最好使

4、用塑料制品标本要求标本要求 1种类：血清或血浆(肝素、枸橼酸钠或EDTA抗凝)。2量：静脉血2ml，常规分离血清或血浆。3.3000转分离心10分钟。4保存：分离后7d之内测定的血清或血浆标本可放置于 28C保存，超过7d在-20C保存。试剂要求试剂要求我国规定HIV抗体筛查试剂必须是：HIV-1/2混合型 经国家食品药品监督管理局注册批准 批批检合格 在有效期内 推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂 （chinaids.org）常用筛查方法目前，国内常用的HIV抗体筛查试验方法有：酶联免疫吸附试验（ELISA）颗粒凝集试验（PA）快速试验双抗原夹心法原理固相包被抗原待测抗体（IgG、I

5、gM）酶标记抗原底物试剂盒组成（双抗原夹心法ELISA）1.HIV酶标板 2.HIV-1型阳性对照 3.HIV-2型阳性对照 4.HIV阴性对照 5.HIV酶标试剂 6.浓缩洗涤液 7.显色剂A液 8.显色剂B液 9.终止液操作程序-1 阅读标准操作程序，严格按照试剂说明书操作严格按照试剂说明书操作将试剂盒及样品放置在室温半小时以上1）准备酶标板，小心撕去酶标板条上的封条2）配液：将50ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释至1000ml备用。3）编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照3孔、阳性对照1型,2型各1孔、空白1孔。4）加样：分别在相应孔中加入加入100 l待检样品及阴、

6、阳性对照、外部质控对照。操作程序-25）温育：用封板膜封板后置371温育601分钟。6）洗涤：小心将封板膜揭掉，使用洗板机吸干孔内液体，用洗涤液洗涤5遍，拍干。7）加酶：每孔加入酶标试剂100l，空白孔除外。8）温育：用封板膜封板后置371温育301分钟。9)洗涤：小心将封板膜揭掉，使用洗板机吸干孔内液体，用洗涤液充分洗涤5遍，最后一次尽量拍干。操作程序-310）显色：每孔加入显色剂A、B液各50l，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置371避光显色301分钟。12）测定：每孔加终止液50l，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长于450nm处（建议用双波长检测，可不设空白），在15分钟内测定各孔OD值。13

7、）用酶标仪测定OD值，打印结果实验结果判断（1）检查阴性对照和阳性对照的OD值是否符合要求，判断本次实验是否成立，并计算cut off值结果判定:1.阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔OD值0.10。2.阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔OD值0.80。3.临界值（CUTOFF）计算：临界值=阴性对照孔OD均值Nc+0.12。实验结果判断（2）4.阳性判定：样品OD值临界值（CUTOFF）者为HIV 抗体阳性（注意：初试阳性标本应重新取样进行双孔复检，复试阳性者应按“全国HIV检测管理规范”送HIV确证实验室进行确证实验）。5.阴性判定：样品OD值临界值（CUTOFF）者为HI

8、V抗体阴性。质控要求质控要求 一.室内质控：1.在每次HIV实验中必须包含内部对照质控血清（试剂盒配套质控）:HIVI抗体、HIV2抗体阳性质控、HIV阴性质控及外部对照质控血清（自制或购买）。2.所有质控品与标本同时加入HIV试剂的微孔板内，最终质控结果符合实验要求，则实验结果可报告；否则应重新检测标本。检测过程中的问题及对策检测过程中的问题及对策ELISA实验所有的孔均无色 漏加阳性对照漏加阳性对照 酶标记物失效酶标记物失效 底物失效：应避光保存底物失效：应避光保存 酶联板抗原失效酶联板抗原失效ELISA实验所有的孔均显色 洗板不彻底，孔内残留未结合的酶标记物。洗板不彻底，孔内残留未结合的酶标记物。容器不清洁，有残留物质：酶受污染。容器不清洁，有残留物质：酶受污染。底物失效，在加入之前就已经显色。底物失效，在加入之前就已经显色。HIVHIV抗体筛查检测及报告程序抗体筛查检测及报告程序1.筛查（-）出具“HIVHIV抗体阴性抗体阴性”报告2.筛查（+）复检：原有试剂另外一种不同原理（或厂家）试剂或另外两种不同原理（或厂家）试剂 1）两种试剂均阴性：报告“HIVHIV抗体阴性抗体阴性”2）一阴一阳或两种均阳性：出具“HIVHIV抗体抗体待复检待复检”报告，不能出阳性报告不能出阳性报告，应送确证实验室。谢谢大家！