第二章蛋白质化学-课件.ppt

1、第二章 蛋白质化学 1838年，荷兰化学家格里特发现蛋白质 Gerardus Johannes Mulder1802-1880蛋白质，英文名Protein，源于希腊文，为“最原初的、第一重要”的意思。蛋白质定义 蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子。氨基酸通过肽键连接形成多肽链，一条或者多条多肽链通过折叠卷曲形成具有一定空间结构的蛋白质。第一节、蛋白质的元素组成 第二节、蛋白质的基本结构单位氨基酸 第三节、肽 第四节、蛋白质的分子结构 第五节、蛋白质结构与功能之间的关系 第六节、蛋白质的理化性质 第七节、蛋白质的分离和纯化 第一节、蛋白质的元素组成 分别约为分别约为:C：50%H：7%O：

2、23%N：16%S：0 3%其它：微量其它：微量凯氏定氮法测定蛋白质含量的理论基础蛋白质的元素组成三聚氰胺(C3H6N6)“三鹿奶粉事件三鹿奶粉事件”第二节、蛋白质的基本结构单位氨基酸 2.1 蛋白质的基本结构单位氨基酸 水解水解蛋白质 多肽链 氨基酸 羧基氨基H不同的氨基酸在于R基团的不同2.2 氨基酸的结构通式 2.3 氨基酸的分类 按照是否参与蛋白质组成，把氨基酸分为：非蛋白质氨基酸 蛋白质氨基酸 蛋白质常见氨基酸 蛋白质稀有氨基酸 迄今为止发现参与蛋白质组成的常见氨基酸只有二十种，被称为蛋白质基本氨基酸或常见氨基酸。2.3.1 蛋白质常见氨基酸 蛋白质常见氨基酸的分类 不带电荷（7）带

3、电荷（5）根据R基的极性进行分类 非极性R基氨基酸（8）极性R基氨基酸（12）丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸（1）非极性R基氨基酸 脯氨酸苯丙氨酸色氨酸甲硫氨酸（2）极性不带电荷R基氨基酸 甘氨酸 丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸 半胱氨酸 天冬酰胺 谷氨酰胺（3）极性带正电荷R基氨基酸 精氨酸 组氨酸 赖氨酸（4）极性带负电荷R基氨基酸 天冬氨酸 谷氨酸 通常是常见氨基酸的衍生物。2.3.2 蛋白质稀有氨基酸 比如：4-羟脯氨酸5-羟赖氨酸2.3.3 非蛋白质氨基酸 以游离或结合态存在于细胞或组织中，大部分是常见氨基酸的衍生物或异构型。如存在于细菌细胞壁内的D-谷氨酸和D-丙氨酸、花生中的-亚甲基谷

4、氨酸、甘蔗中的-氨基丁酸，刀豆中的刀豆氨酸等。习题：蛋白质常见氨基酸中，含有羟基的氨基酸是：含有S的氨基酸是：含有吲哚基团的氨基酸是：含有咪唑基团的氨基酸是：2.4 氨基酸的理化性质 2.4.1 氨基酸的带电形式以及等电点 问题：氨基酸在水溶液中的主要存在形式是什么？or 1、氨基酸熔点较高，一般在200以上，而普通有机化合物二苯胺的熔点为53。2、氨基酸溶于水后，增加水的导电性。两个实验现象：兼性离子 中性分子 在中性水溶液里面：实际上，由于羧基和氨基的可逆解离，氨基酸还能够以其它的带电形式存在 R+R0 R-pH越低，R+的数量就越多。pH越高，R-的数量就越多。R+R+R+R+R+R0R

5、0R-R+R0R+R+R+R0R0R0R-R-R0R-R+R0R0R-R-R0R-R-R-R-pH 溶液pH值决定了氨基酸整体所带电荷 等电点：使得氨基酸带电荷总数为零时候的溶液pH值，叫做等电点，简称pI。小结：1、氨基酸在水溶液中，能够以兼性离子形式存在。也能够以带正电或者负电形式存在。2、氨基酸的总电荷数量，由溶液pH值决定。3、使得氨基酸总电荷恰好为零的溶液pH值，叫做氨基酸的等电点。酸碱的基本概念？Bronsted-Lowry酸碱质子理论 HA A-H+酸碱凡是解离出H+的都是酸，凡是接受H+的都是碱。2.4.2 氨基酸的酸碱性 二元酸 二元碱 酸碱两性分子 R+R0 R-问题：氨基

6、酸是酸还是碱？R0R+R-R+可以看成二元酸，有两个可以解离H+的基团。这两个基团是分步解离的。2.4.3 氨基酸的分步解离及解离常数的求法 第一步解离第一步解离解离常数解离常数K K1 1 第二步解离第二步解离解离常数解离常数K K2 2 问题：两个解离常数如何求得？K1 =R0 H+R+K2 =R-H+R0注意：不是通过直接测浓度算出来，而是通过滴定法求得 以甘氨酸为例，从完全质子化的甘氨酸（R+）溶液开始，滴加标准NaOH溶液，以滴加NaOH的量为横坐标，以溶液pH值为纵坐标，绘制滴定曲线。甘氨酸的滴定曲线曲线在pH=2.34处出现第一个拐点，此时 R+=R0。NaOH R+R0R-甘氨

7、酸的滴定曲线继续滴定，在pH=9.6处滴定曲线出现第二个拐点，此时 R0=R-同样通过溶液的pH可以求到pK2。R0=R-NaOH 小结：1、氨基酸是既可以是酸，也可以是碱，也可以是酸碱两性分子，取决于其带电形式。2、完全质子化的氨基酸可以看成多元酸，有多个基团可以解离出H+，在滴加碱的条件下，这些基团将分步解离出H+。3、通过作酸碱滴定曲线的方法，可以求得各个基团的解离常数（拐点处的 pH值 即为 pK 值）。知识点：等电点与解离常数的关系 已知氨基酸的解离常数K1和K2，如何求等电点？等电点时：R+=R-K1K2=H+2pH=pI=2 pK1+pK2 K1=R0 H+R+K2=R-H+R0

8、而P42 R基团带负电的氨基酸的解离 更复杂一些的情况，如果R基团可解离，等电点如何求？R+R0R-R2-pk1 pkR pk2 R基团带正电的氨基酸的解离 R2+R+R0 R-pk1 pkR pk2 等电点是R0两端的pK值加起来除以2 习题：一、某R基团不解离的氨基酸羧基的解离常数（pK1）为2.32；氨基的解离常数（pK2）为9.62；请问：1、该氨基酸的等电点是多少？2、当溶液的pH值高于等电点的时候，该氨基酸总体带什么电荷？在电泳的过程中向哪一极移动？二、某碱性（即R基团带正电）氨基酸羧基的解离常数（pK1）为1.82；氨基的解离常数（pK2）为9.17；R基团的解离常数（pKR）是

9、6.00。请问其等电点等于多少？2.4.3 氨基酸的化学反应 （1）茚三酮反应（2）Sanger 反应（3）Edman反应在酸性条件下，氨基酸与茚三酮共热，生成紫色化合物P43 还原性茚三酮还原性茚三酮OOOHH NH3CO2 RCHO水合茚三酮水合茚三酮RCHCOOHNH2OOOH 2NH3OOOHH OOOONH4N O 2H2O蓝紫色化合物蓝紫色化合物OO反应分2步：(1)茚三酮反应OH 在弱碱溶液中，氨基酸的-氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB)反应，生成黄色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA）。DNFBO2NNO2FH2NCHCOOHR DNP-氨基酸O2NNO2 HNCHCOOHR H

10、F此反应最初被Sanger 用于测定肽链 N-端氨基酸(2)Sanger 反应(3)Edman反应NCS40，弱碱，弱碱COOHH2NCHRPITC异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯NCNHRCHCOS40，H+、硝基甲烷、硝基甲烷 PTH-氨基酸氨基酸苯硫乙内酰脲氨基酸苯硫乙内酰脲氨基酸 PTC-氨基酸氨基酸苯氨基硫甲酰氨基酸苯氨基硫甲酰氨基酸HNCNHRCHCOOHSPITC PTH-氨基酸 PTC-氨基酸 结合结合 环环化化 释释放放第三节、肽 3.1 肽的定义 肽是由多个氨基酸通过肽键连接而形成的链状分子。肽键是由氨基酸的羧基和另外一个氨基酸的氨基脱水缩合形成的酰胺键。肽键 二个氨基酸形成的肽称

11、作二肽，三个氨基酸形成的肽称作三肽；余类推。寡肽：aa 10 个 无分枝的长链 具有方向性。两个末端分别为N端(氨基端)和C端(羧基端)。3.2 肽的结构 肽键 氨基酸残基 侧链 氨基端 羧基端 主链 1、中文表示法：从肽链的N端开始，对氨基酸残基逐一命名 2、三字母表示法：aa1.aa2.aa3.aa4.3、单字母表示法（最常用）：ABCD 3.3 肽的表示方法 P36 其等电点是在所有可解离的基团的净电荷为0时的溶液pH值。肽链的一端含有一个游离的-氨基，另一端含有一个游离的-羧基，加上部分氨基酸可解离的R基团，因而与氨基酸一样具有酸碱两性的性质。3.4 肽的两性性质 3.5 一些重要短肽

12、的功能 下丘脑分泌，促腺垂体分泌促甲状腺素焦谷组脯-NH2促甲状腺素释放因子神经递质，传递痛觉H 精脯赖脯谷胺苯丙甘亮蛋OHP物质脑内存在的抑制疼痛的阿片样肽H 酪甘甘苯丙蛋 OH蛋氨酸脑啡肽 生理活性分子结构 生物活性肽 第四节、蛋白质的分子结构 4.1 蛋白质的结构决定了它的功能 4.2 蛋白质的结构是具有层次的 复杂物体的结构层次问题 一座房子由什么组成？1、由砖瓦、钢筋、水泥等组成3、由走廊、房间、阳台等组成2、由墙壁、地板、屋顶等组成 不同结构层次 蛋白质的结构同样分层次 一级结构：多肽链中氨基酸的排列顺序。二级结构：多肽链主链折叠、卷曲形成的有规则的重复的构象（也叫结构元件）。三级

13、结构：由二级结构元件进一步盘旋、折叠形成的三维空间构象。四级结构：多条多肽链通过非共价键聚合形成的聚集体。一级结构 初级结构（共价结构）二级结构 高级结构（空间结构）三级结构四级结构 在二级结构和三级结构之间还有另一些层次，如超二级结构和结构域。4.3 蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构（primary structure）是指蛋白质肽链中氨基酸的排列顺序以及二硫键的位置。以胰岛素为例，胰岛素是动物胰脏中胰岛细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白，它的主要功能是降低体内血糖含量。临床上用来治疗糖尿病。最先由Sanger于1953年完成测定胰岛素一级结构 蛋白质的二级结构指多肽链主链卷曲、折叠而形成

14、的有规则的构象。氢键是维持二级结构的主要作用力。4.4 蛋白质的二级结构 4.4.1 基本概念 4.4.2 多肽链折叠的空间限制 肽键 限制1：肽键具有半双键的性质，不可自由旋转 肽链可看成是由被C隔开的许多肽平面组成 限制2：C N和C C单键的旋转也是受限制的 F=0 y=0P50 天然蛋白质的二级结构包括：-螺旋 -折叠 -转角 无规则卷曲 这些限制促使多肽链会自然形成一些有规则的构象，我们称之为二级结构4.4.3-螺旋 F=-57 y=-48-螺旋主要特点 每3.6个氨基酸残基上升一圈，螺距0.54nm 上环羰基上O与下环氨基上的H形成氢键 氨基酸侧链伸向螺旋外侧，其大小、形状、电荷影

15、响螺旋的形成 为二级结构中最稳定形式4.4.4-折叠 -折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结而成的锯齿状片状结构。-折叠分平行式和反平行式，后者更为稳定。顺式 反式 区别点区别点 -螺旋螺旋 -折叠折叠形形 状状 螺旋状螺旋状 锯齿状锯齿状氢氢 键键 与长轴平行与长轴平行 与长轴垂直与长轴垂直延伸性延伸性 较大较大 较小较小升升1AA残基高度残基高度 0.15nm 0.36nm-螺旋和-折叠的区别 也称也称-回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回折折180180，使得氨基酸残基的，使得氨基酸残基的C=OC=O和与第四个残基的和与第四个残基的N-HN-H

16、形形成氢键。成氢键。-转角都在蛋白转角都在蛋白质分子的表面。质分子的表面。4.4.5-转角 4.4.6 无规则卷曲 又称自由又称自由卷曲，是指没有一定规律的松散肽卷曲，是指没有一定规律的松散肽链结构。酶的功能部位常常处于这种构象区域。链结构。酶的功能部位常常处于这种构象区域。无规卷曲常出现在无规卷曲常出现在-螺旋与螺旋与a-a-螺旋、螺旋、-螺旋与螺旋与-折叠、折叠、-折叠与折叠与-折叠之间。它是形成蛋白折叠之间。它是形成蛋白质三级结构所必需的。质三级结构所必需的。限制性内切核酸酶BamHI -转角-折叠无规卷曲-螺旋4.5 超二级结构和结构域 4.5.1 超二级结构 由若干相邻的二级结构单元

17、组合在一起，彼此相互作用，形成的有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体。结构域：指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。酵母己糖激酶的两个结构域Aniridia，一个与眼球虹膜发育有关的转录因子，具有两个保守结构域 HomeodomainPOU specific domain 三级结构：指的是多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠形成的、具有一定空间构象的结构。4.6 三级结构 具有三级结构的蛋白质分子含有多种二级结构单元。如具有三级结构的球状蛋白溶菌酶中含有螺旋、-折叠、-转角和无规卷曲四种

18、二级结构 肌红蛋白的三级结构 血红素 维持三级结构的作用力二硫键 共价键 疏水作用非共价键（次级键）氢键 离子键范德华力 具有三级结构的多肽链通过通过非共价键缔合在一起形成的聚集体，叫做蛋白质的四级结构。四级结构的每一个三级结构单位称为一个亚基。大多数情况下，亚基只是一条多肽链。4.7 四级结构 血红蛋白由四条多肽链组成，每条多肽链形成独立的三级结构，再彼此缔合成最后的四级结构，所以说血红蛋白由四个亚基组成。v 疏水作用v 氢键v 离子键(盐键)v 范德华力 维持四级结构的作用力总结：蛋白质的结构层次 第五节、蛋白质结构与功能之间的关系 一级结构是空间结构形成的基础,也是决定蛋白质功能的基础。

19、空间结构是蛋白质功能直接的、具体的承担者。5.1 蛋白质一级结构与功能的关系 5.1.1 一级结构与分子进化 分子进化：生物大分子的演化现象 生物名称生物名称 与人与人AAAA差异数差异数 生物名称生物名称 与人与人AAAA差异数差异数黑猩猩黑猩猩0鸡、火鸡鸡、火鸡13恒河猴恒河猴1响尾蛇响尾蛇14兔兔9乌龟乌龟15袋鼠袋鼠10金枪鱼金枪鱼21鲸鲸10狗鱼狗鱼23牛羊猪牛羊猪10蚕蛾蚕蛾31狗狗11小麦小麦43骡骡11面包酵母面包酵母45马马12红色面包霉红色面包霉48以细胞色素c为例，人的细胞色素c有104个氨基酸（AA）：根据不同物种细胞色素c一级结构绘制的分子进化树 5.1.2 一级结构

20、变异与分子病 蛋白质一级结构决定蛋白质功能，而蛋白质功能的缺陷可能导致生物体机能上的缺陷，即疾病。由于蛋白质一级结构的变化而导致的疾病叫分子病。HbA：N Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS：N Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys镰刀状细胞贫血病 原因是什么？Glu 和Val 分子的侧链在性质上有很大的不同。Glu 侧链带负电荷，而Val侧链是一个非极性基团，所以使得HbS分子表面的负电荷减少，这种变化使患者的血红蛋白容易发生聚集并形成杆状多聚体，这就是导致红细胞变形的原因。5.2 蛋白质高级结构与功能的关系 5.2.1 蛋白质的变

21、性和复性 别构效应亦称变构效应，是指一个蛋白质与它的配体结合后，蛋白质的构象发生变化，使它更适合于功能的需要，这一类变化称为别构效应5.2.2 别构效应 血红蛋白的别构效应 血红蛋白由四个亚基组成 在没有结合O时，亚基之间通过盐键紧密连接 在一个亚基结合氧之后，拉动肽链 亚基间的盐键打开，变成松弛构象，易与氧结合 血红素血红素总结：1、蛋白质结构决定并执行蛋白质功能。2、蛋白质一级结构是高级结构的基础，也是蛋白质功能的决定者。3、蛋白质高级结构是蛋白质功能的直接执行者。第六节、蛋白质的理化性质 6.1 蛋白质的相对分子量和胶体性质 蛋白质的相对分子量1万-100万之间，其分子直径1-100nm

22、之间，在胶体颗粒的范围。分子量10,000，直径1 nm 所以蛋白质具有胶体性质，如布朗运动、光散射、电泳、不能透过半透膜及具有吸附能力等。利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，这个方法称透析（dialysis）。6.2 两性解离及等电点 蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质。蛋白质分子中可解离的基团除肽链末端的-氨基和-羧基外，主要还是多肽链中氨基酸残基上的侧链基团。蛋白质的等电点（pI）：当某蛋白质在一定的pH的溶液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值叫做该蛋白质的等电点。蛋白质的带电性质与溶液的pH有关。利用蛋白

23、质的两性解离可以通过电泳分离纯化蛋白质。6.3 蛋白质的沉淀能使蛋白质沉淀的试剂有：1.高浓度中性盐 （NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl（中和蛋白质的电荷）这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析，用于分离制备蛋白质。2.有机溶剂 丙酮、乙醇 (破坏蛋白质水膜)+-+-H2OH2OH2OH2OH2OH2OH2OH2O+H2O+-+-H2OH2OH2OH2OH2OH2OH2OH2O+H2O-+-+-+-+-+-H2OH2OH2OH2OH2OH2OH2OH2O+H2O+-+-H2OH2OH2OH2OH2OH2OH2OH2O+H2O3.重金属盐 Hg2+、Ag+、Pb+（与蛋白质中带负电基团

24、形成不易溶解的盐,或改变蛋白质的空间结构）4.生物碱试剂 苦味酸、目酸、钨酸等 （与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐）蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种现象叫变性作用。蛋白质变性的概念6.4 蛋白质变性与复性 吴宪教授1931年：“天然蛋白质分子借助次级键连接而成一种紧密、有规则的空间结构，变性作用使次级键破坏从而使结构松散”。蛋白质变性的因素 物理因素：加热、紫外线、超声波、高压等化学因素：强酸、强碱、脲、盐酸胍、去垢 剂、重金属盐等蛋白的复性 蛋白质的变性作用若不过于剧烈，则是一种可逆过程。高级

25、结构松散了的变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠形成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为复性。大多蛋白质变性后，很难复性。6.5 蛋白质的颜色反应6.5.1 双缩脲反应 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。双缩脲反应 蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产物的颜色深浅在540nm处进行蛋白质的定量测定。6.5.2 酚试剂（Folin-酚试剂）反应 蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚羟基能将Folin-酚试剂

26、中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。这一反应常用来定量测定蛋白质含量。6.5.3 茚三酮反应 由于蛋白质多肽链两端有游离的-NH2和-COOH，所以蛋白质也可以和茚三酮发生反应。第七节、蛋白质的分离纯化7.1 分离纯化蛋白质的目的在科研和生产、医疗方面具有应用价值 蛋白质结构测定 医药产品 7.2 分离纯化的要求 1、具有活性 2、具有一定的纯度和浓度 7.3 分离纯化的一般步骤 材料处理 初步纯化 进一步纯化 结晶 1、维持蛋白质二级结构的主要作用力是（）A 肽键；B 二硫键；C 氢键；D 疏水作用。2、下列有关蛋白质在等电点时，不确定的性质是（）A 净电荷为零；B

27、溶解度最小；C 在电场中不移动；D 疏水基团暴露。3、下列有关蛋白质结构的叙述中错误的是（）A 氨基酸的疏水侧链很少埋在分子的内部B 极性的氨基酸侧链通常在分子的外侧，面向水相C 蛋白质的一级结构在决定其高级结构方面是重要的因素之一D 蛋白质的空间结构主要靠次级作用力维持4、根据肽键的存在而定量测定蛋白质的方法是（）A 凯氏定氮法；B 茚三酮法；C 双缩脲法；D 紫外吸收法。5、蛋白质溶液发生盐析作用的原理是（）A 构型改变；B 净电荷增大；C 扩散速度；D 破坏水膜结构，中和电荷。6、蛋白质变性不包括（）(A)肽链断裂；(B)离子键断裂；(C)疏水键断裂；(D)氢键断裂名词解释：1、盐析 2、蛋白质变性3、别构效应