第五章工业微生物基因育种课件.ppt

1、王陶 2012年2月l了解和掌握基因工程育种的原理与方法；l了解基因工程的主要载体与基因定位诱变的原理与方法。l教学重点：质粒的特性与基因工程操作原理l教学难点：基因定位诱变的原理l1、概述l 基因工程在微生物育种中的地位和作用，原理l2、基因工程载体l 几种常见的载体l3、基因工程所用的酶l 限制性内切酶，核酸酶，连接酶，聚合酶等l4、基因工程的主要步骤l5、基因定位诱变一、基因工程概述多利和它的孩子 沃尔小组成功克隆两只恒河猴 吴明杰小组：5只克 隆猪隆猪 基因操作，是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上、于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。它的创立和发展，直接依赖于基

2、因工程或称分子生物学的进步，两者之间有着密不可分的联系。基因的研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础，基因工程的诞生是基因研究发展的必然结果；而基因工程技术的发展和应用，又深刻并有力地影响着基因的研究，使我们对基因的研究提到了空前的高度。因此，对基因研究发展的过程，以及基因的现代概念进行一下回顾是十分必要的。基因工程与基因基基 因（因（genegene）一段可以编码具有某种生物学功能物一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。质的核苷酸序列。A brief history of genetics.1866年，孟德尔（G.J.Mendel）提出了遗传因子（hereditary facto

3、r）的概念。他将控制豌豆性状的遗传因素称之为遗传因子形成了基因的雏形。豌豆杂交操作孟德尔研究的七对性状孟德尔分离律孟德尔自由组合律 黄圆 绿圆 黄皱 绿皱1909年，丹麦的遗传学家W.Johanssen根据希腊语“给予生命”之义，创造了“gene”一词。但它只是一个抽象的单位，并不代表物质实体。同源染色体分别带着控制同一性状的两个等位基因显性等位基因 纯合子隐性等位基因 纯合子杂合子1910年，美国遗传学家摩尔根（T.H.M.organ）以果蝇为研究材料，发现了连锁交换定律并提出遗传粒子学说，第一次将代表某一特定性状的基因与某一特定的染色体联系起来，即基因位于染色体上。野生果蝇没有现成的成对性

4、状 摩根在长期饲养中找到各个性状的突变株。控制不同性状的等位基因在2#染色体上的位置触须 长/短身体 灰/黑眼睛 红/紫翅 长/短1944年，美国微生物学家O.T.Avery首次证实遗传物质的基础是DNA，基因位于DNA上。DNA is the genetic material35S 标记外壳蛋白质,感染后放射标记不进入大肠杆菌细胞32P 标记 DNA,感染后放射标记进入大肠杆菌细胞 1953年，J.Watson和F.Crike创立DNA双螺旋模型，证实基因是具有一定遗传效应的DNA片段。1955年，Benzer在T4噬菌体的顺反互补实验中，正式使用“顺反子（cristron）”这个术语，并将

5、顺反子与基因在意义上和功能上统一起来。同时证实了基因不是最小单位。它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，只有其中某一特定的核苷酸区段才是基因的编码区。19601960年，年，F.JacobF.Jacob和和J.MonmdJ.Monmd提出了操纵元提出了操纵元（操纵子）的概念，揭示了原核生物基因表达（操纵子）的概念，揭示了原核生物基因表达调控的重要规律调控的重要规律。基因的现代概念基因的现代概念移动基因（movable gene）断裂基因（split gene）假基因（假基因（pseudogene）重复基因（repeated genes）重叠基因（overlapping genes）或嵌

6、套基因（nested genes）基因的特点基因的特点:不同基因具有相同的物质基础不同基因具有相同的物质基础 在原则上，所有生物的在原则上，所有生物的DNADNA都是可以重组都是可以重组互换的，因为地球上的一切生物，无论是高等互换的，因为地球上的一切生物，无论是高等还是低等，他们的基因都是一个具有遗传功能还是低等，他们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的的特定核苷酸序列的DNADNA片断，而所有生物的片断，而所有生物的DNADNA结构都是一样的。结构都是一样的。有些病毒的基因定位在有些病毒的基因定位在RNARNA上，但这些病毒上，但这些病毒RNARNA可以通过反转录产生可以通过反转录产

7、生CDNACDNA，并不影响不，并不影响不同基因的重组互换。同基因的重组互换。基因是可以切割的基因是可以切割的 基因在染色体上的存在形式是基因在染色体上的存在形式是直线排列。大多数基因彼此之间直线排列。大多数基因彼此之间存在这间隔，少数基因是重叠排存在这间隔，少数基因是重叠排列的。列的。基因是可以转移的基因是可以转移的 生物体内有的基因是可以在染色生物体内有的基因是可以在染色体上移动的，甚至可以在不同的染体上移动的，甚至可以在不同的染色体上跳跃，插入到靶色体上跳跃，插入到靶DNADNA分子中分子中。基因在转移的过程中就完成了基。基因在转移的过程中就完成了基因间的重组。（转座子、反转座子因间的重

8、组。（转座子、反转座子）多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系 现在普遍认为，一种多肽就有一现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。的性质来检查。多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系 现在普遍认为，一种多肽就有一现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。的性质来检查。基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代 经重组的基因一般来说

9、是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。目前世界许多国家将生物技术，信息技术和新材料技术作为三大重中之重技术，而生物技术可以分为传统生物技术，工业生物发酵技术和现代生物技术。现在人们常说的生物技术实际上就是现代生物技术。现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技术。其中基因工程技术是现代生物技术的核心技术。基因工程（genetic engineering）也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。一般说来所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。技术

10、基础 20世纪60年代末70年代初，限制性内切酶和DNA连接酶等的发现，使DNA分子进行体外切割和连接成为可能。70年代中期，DNA分子的核苷酸序列分析技术问世。v这两项技术，使这两项技术，使DNADNA的结构分析问题得到了根本的解的结构分析问题得到了根本的解决。决。1972年首次构建了一个重组DNA分子，并提出了体外重组的DNA分子进入宿主细胞的过程，以及在其中进行复制和有效表达等问题。在60年代还发展出了琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交技术，这对于DNA片断的分离、检测十分有用，并很快被应用于基因操作实验。基因工程研究的主要基因工程研究的主要内容或步骤内容或步骤 从复杂的生物有机体

11、基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖；从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆；从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。基因工程的应用 基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。在医学上的应用 基因工程

12、被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质肽类药物。转基因动物和植物 转基因动物首先在小鼠获得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/羊 奶中可以生产蛋白质药物。称为“乳腺反应器”工程。转基因植物亦已在大田中广为播工程菌在环境工程中应用 美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。喷洒工程菌清除石油污染 二、基因工程在微生物育种中的应用1,提高代谢产物产量:例如所有的氨基酸合成酶基因都可以在不同系统中克隆与表达.其中苏氨酸,色氨酸,脯氨酸和组氨酸等工程菌已达到工业化生产水平.苏氨酸工程菌在前苏联和日本都已用于工业生产,苏氨酸产量可达60g

13、/L以上,我国苏氨酸产量可达20g/L.2,生产新的抗菌素 天蓝链霉菌合成蓝色的多酮肽抗菌素-放线紫红素,麦迪霉素产生菌合成褐色的麦迪霉素.经过两级克隆,麦迪霉素产生菌产生一种新的紫色化合物,是麦迪霉素与放线紫红素的杂种化合物,为一种新的抗菌素,命名为MederhodinA.l3,改良工业酶生产菌株:蛋白酶,木糖异构酶,纤维素酶,葡萄糖淀粉酶以及凝乳酶等均进行了研究.研究较多的是-淀粉酶和青霉素酰化酶.1981年起,在枯草杆菌或大肠杆菌中克隆和表达了来自枯草杆菌,淀粉液化芽孢杆菌,凝结芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等菌种的-淀粉酶基因,比野生株最高的可达30倍.目前美国已用基因工程菌

14、生产.德国首先克隆大肠杆菌青霉素G酰化酶基因.我国青霉素G酰化酶的产量可达3000单位/L以上.l一),目的基因的取得:选择适宜的给体细胞,从中采集分离有生产意义的目的基因;通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA);用化学方法合成特定功能的基因.l二),选择载体:原核受体细胞的载体,主要是细菌质粒(松弛型)和噬菌体.动物细胞,主要是SV40病毒.植物细胞主要是TI质粒l三),目的基因与载体DNA的体外重组:采用限制性内切酶处理目的基因与载体DNA,获得互补粘性末端或人工合成粘性末端.把两者放在较低的温度(56)下混合退火.由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段和粘性未端有相

15、同的核苷酸组分,所以当两者相混时,凡粘性末端上碱基互补的片段,就会因氢键的作用而彼此吸引,重新形成双链,这时,在外加连接酶的作用下,供体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被缝合,形成一个完整的有复制能力的环状重组体嵌合体.l四),重组载体引入受体细胞:微生物,动物或植物细胞.使用最广泛的是E.coli.其次为枯草杆菌和酿酒酵母.以重组质粒作载体,用转化方法;以病毒DNA作重组载体,用感染方法.理想情况,重组载体进入受体细胞,通过自主复制而大量扩增,使受体细胞表达出供体基因所提供的部分遗传性状,受体细胞就成为工程菌.载体（载体（vectorvector）是由在细胞中能）是由在细胞中能够自主复制

16、的分子构成的一种够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的遗传成分，通过实验手段可使其它的片段连接在它的上面，而进行片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：备以下几个性能：1 1、分子较小，可携带比较大的片段。、分子较小，可携带比较大的片段。2 2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。3 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multi

17、ple cloning sites ，MCSMCS）。4 4、有适合的标记，易于选择。、有适合的标记，易于选择。5 5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。并且尽可能是高效的表达。6 6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。种内才可复制等等。载体载体功能功能克隆载体克隆载体（cloning vector）:克隆一个基因或克隆一个基因或DNADNA片断片断表达载体（表达载体（expression vect

18、orexpression vector）:用于一个基因的蛋白表达用于一个基因的蛋白表达整合载体整合载体:把一个基因插入到染色体组中把一个基因插入到染色体组中载载 体体来源：来源：质粒载体质粒载体 噬菌体载体噬菌体载体 柯斯质粒载体柯斯质粒载体 真核细胞克隆载体真核细胞克隆载体质粒*受体细胞结构插入片断举例 E.coli环状 8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等 噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，gt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状 10 kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCV BAC

19、(Bacterial Artificial Chromosome)E.coli环状300 kbPel oBAC系列PAC(P1-derived Artificial chromosome)E.coli环状100-2000 kbPCYPAC1YAC(Yeast Artificial chromosome)酵母细胞线性染色体100-2000 kbMAC(Mammalian Artificial Chromosome)哺乳类细胞线性染色体 1000 kb病毒载体动物细胞环状SV40 载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载体的种类和特征载体的种类和特征 质粒

20、（质粒（plasmidplasmid）载体）载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNADNA，一般大小约，一般大小约10106 610108 8D D，可自身复制和表，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。好的载体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。质粒载体。质粒（质粒（plas

21、midplasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNADNA 分子。大小约为分子。大小约为 数千碱基对。常数千碱基对。常 有有1 31 3个抗药个抗药 性基因，以利于性基因，以利于 筛选。筛选。质粒载体质粒载体1.1.克隆的质粒载体克隆的质粒载体 允许外源的允许外源的DNADNA插入，储存。主要插入，储存。主要是是DNADNA水平上的操作。水平上的操作。2.2.基因表达的质粒载体基因表达的质粒载体 允许外源允许外源DNADNA的插入、储存和表达。的插入、储存和表达。一、一、质粒的生物学特性：1、质粒DNA的构型：SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA

22、）OC型 开环DNA（ocDNA）L 型 线性DNA（cDNA）2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：106108D 3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点 LOCSC4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等5、质粒DNA的类型：接合型和非接合型；含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌 素抗性基因的R质粒；F因子和F因子等。按接合转移功能分类主要基因按抗性记号分类非接合型质粒自主复制基因，长生大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，抗菌素抗性基

23、因R质粒(R因子)接合型质粒自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段F质粒（F因子）自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子)自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Ent质粒6 6、质粒、质粒DNADNA的复制类型：的复制类型：低拷贝的质粒（低拷贝的质粒（1 13 3）：严紧型复制控制的质粒）：严紧型复制控制的质粒 （接合型）（接合型）高拷贝的质粒（高拷贝的质粒（10601060）：松弛型复制控制的质粒（）：松弛型复制控制的质粒（非接合型）非接合型）7 7、质粒的不亲合性、质粒的不亲合性 在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不在同

24、一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒的不相容性。同的。也称为质粒的不相容性。是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。存的现象。质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。功能之间的相互干扰造成的。（二（二）、质粒、质粒DNADNA的分离与纯化的分离与纯化 1 1、氯化铯密度梯度离心法；、氯化铯密度梯度离心法；2 2、碱变性法；、碱变性法；3 3、微量碱变性法

25、。、微量碱变性法。1.氯化铯密度梯度离心法 1、质粒DNA占总DNA的1%2%；2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。流程：流程：首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDSSDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。）来促进大肠杆菌的细胞裂解。将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，大肠杆菌裂解液中，EBEB会嵌入到会嵌入到DNAD

26、NA链链的碱基中去。的碱基中去。在在EBEB达到饱和时，进行氯化铯密度达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。梯度离心。2.2.碱变性法：碱变性法：根据共价闭合环状质粒根据共价闭合环状质粒DNADNA与线性染色体与线性染色体DNADNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。的。在在PHPH值值12.012.012.512.5范围内时，线性的范围内时，线性的DNADNA会被变性而共价闭合环状质粒会被变性而共价闭合环状质粒DNADNA却不会被变却不会被变性。性。通过冷却或恢复中性通过冷却或恢复中性PHPH值使之复性，线性值使之复性，线性染色体形成网状结构，而染色体

27、形成网状结构，而cccDNAcccDNA可以准确迅可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNAcccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒粒DNADNA（三）、质粒载体的构建与类型（三）、质粒载体的构建与类型 1.1.天然质粒：没有经过以基因克隆为目标天然质粒：没有经过以基因克隆为目标 的体外修饰改造的质粒。的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有的天然质粒有EolE1、RSF2124和和pSC101等，但存在一定的局限性。等，但存在一定的局

28、限性。第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101pSC101，它含有一个，它含有一个EcoREcoR酶切位点，酶切位点，一个四环素抗性选择记号（一个四环素抗性选择记号（TetTetr r ），插），插入外源片断后不影响其复制功能，但该入外源片断后不影响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活素抗性基因，无法使用插入失活技术选技术选择重组分子。择重组分子。ColE1 ColE1质粒在其唯一的单切割位点质粒在其唯一的单切割位点EcoRlEcoRl中克隆外源中克隆外源DNADNA片断后，可根据对大片断后

29、，可根据对大肠杆菌素肠杆菌素E1E1的免疫性选择转化子，不能合成的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素大肠杆菌素E1E1的菌落是具有重组质粒的转化的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌素子。但对大肠杆菌素E1E1的免疫筛选，在化学的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。上是相当麻烦的。2.2.质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件 (1)、具有复制起点；、具有复制起点；自我增值的基本条件，一般具一个复制子。自我增值的基本条件，一般具一个复制子。(2)、具有抗菌素抗性；、具有抗菌素抗性；理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。(3)、具有若干限制酶

30、切单一位点（、具有若干限制酶切单一位点（CMS）；）；(4)、具有较小的分子量和较高的拷贝数。、具有较小的分子量和较高的拷贝数。低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断 后仍能有效的转化给受体细胞同时低分子后仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。（4363bp）3.质粒载体的选择记号质粒载体

31、的选择记号 新陈代谢特性；新陈代谢特性；对大肠杆菌素对大肠杆菌素E1的免疫性；的免疫性；抗菌素抗性；抗菌素抗性；四环素抗性、氨苄青霉素抗性、四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素抗性链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因；大多数质粒本身带有抗菌素基因；抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。4.4.不同类型的质粒载体不同类型的质粒载体高拷贝的质粒载体高拷贝的质粒载体克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因低拷贝的质粒载体低拷贝的质粒载体 有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严有些克隆的编码基因，其产物

32、含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。调节蛋白质编码基因等。(1)(1)失控的质粒载体失控的质粒载体 复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。ExampleExample：pBEU1pBEU1和和pBEU2pBEU2质粒，在质粒，在3030度下，每个寄主细度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过胞只含有适量的拷贝数

33、，当培养温度超过3535度时度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续质的合成可按正常的速率持续2323小时。最后得到小时。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒力，积累的质粒DNADNA占细胞总占细胞总DNADNA的的50%50%。(2)(2)插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体 将外源将外源DNA片断插入在质粒上会片断插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点

34、，就有可导致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。高获得阳性克隆的机会。ExampleExample：在在pBR329质粒载体的质粒载体的EcoR1位点插位点插入外源片断，会使氯霉素抗性基因失活入外源片断，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片断的重组体质粒的几体中，含有插入片断的重组体质粒的几率会显著上升。率会显著上升。(3)(3)正选择的质粒载体正选择的质粒载体正向选择：应用只有突变体或重组体才能正向选择：应用只有突变体或重组体才能 正常生长

35、的培养条件进行选择。正常生长的培养条件进行选择。这种质粒载体具有直接选择记号这种质粒载体具有直接选择记号 并可并可 赋予寄主细胞相应的表型。赋予寄主细胞相应的表型。ExampleExample：质粒质粒pKN80pKN80有来自有来自MuMu噬菌体噬菌体DNADNA的的EcoR1-CEcoR1-C的片断，编码一种致的片断，编码一种致死功能的死功能的kilkil基因。基因。该质粒在该质粒在MuMu噬菌体的溶噬菌体的溶源菌株中正常复制；源菌株中正常复制；在非溶源菌株中是致在非溶源菌株中是致死的。死的。在在HindHind 或或HpaHpa 位点位点插入外源插入外源DNADNA片断后片断后，会产生具

36、，会产生具AmpAmpr表型表型的的MuMu噬菌体的非溶源噬菌体的非溶源的转化子菌株。的转化子菌株。（四）、重要的大肠杆菌质粒（四）、重要的大肠杆菌质粒载体载体 1 1、pSC101pSC101质粒载体；质粒载体；2 2、ColEColE 质粒载体；质粒载体；3 3、pBR322pBR322质粒载体；质粒载体；4 4、pUCpUC质粒载体；质粒载体；5.5.其它的重要的质粒载体其它的重要的质粒载体1.1.pSC101pSC101质粒载体质粒载体 一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有1212个拷贝

37、；分子量个拷贝；分子量9.09kb9.09kb，编码有一个，编码有一个四环素抗性基因（四环素抗性基因（tettetr r ）。有）。有HindHind 、EcoREcoR、BamH BamH 、Sal Sal 、Xho Xho 、PvuPvu、SmaSma 7 7种核酸内切限制酶。其种核酸内切限制酶。其中在中在HindHind 、BamH BamH、SmaSma 3 3个位点个位点克隆外源克隆外源DNADNA，都会导致，都会导致tettetr r 基因失活。基因失活。是第一个真核生物的克隆载体。是第一个真核生物的克隆载体。（1）应用pSC101质粒作基因克隆载体 葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的

38、表达 金黄色葡萄球菌的质粒p1258,编码若干种能 在大肠杆菌检测的结构基因；能被核酸限制酶 EcoR 切割成4段。（2）应用pSC101质粒作基因克隆载体 在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA 用核酸内切酶EcoR 消化非洲爪蟾的核糖体DNA（rDNA），与EcoR 消化的pSC101质粒进行重组。在挑取的55个转化子中，经 EcoR 酶切，电泳后13个转化子含有外源片断。转化率23.63.pBR322质粒载体“P”表示是一种质粒；“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。四环素抗性基因氨苄青霉素 抗性基因O r i Ps

39、t Sal Pvu Ava Bam HHind Eco RpBR322(amp(ampr r)(ter(terr r)pBR322pBR322的构建：的构建：为改进转化子筛选技术，并具有相对小的为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能力）的结合转移能力）pBR322pBR322的结构来源的结构来源pBR322pBR322质粒载体的优点：质粒载体的优点：1 1、具

40、有较小的分子量；、具有较小的分子量；它的分子量为它的分子量为4363bp4363bp。克隆载体的分子量大小。克隆载体的分子量大小不要超过不要超过10kb10kb。2 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。选择记号。pBR322 DNApBR322 DNA分子中总共有分子中总共有2424种核酸内切酶只具有种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中单一的酶切识别位点。其中7 7种内切酶的识别位点种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，在四环素抗性基因内部，2 2种识别位点在于这个基种识别位点在于这个基因的启动区内，所以因的启动区内，所以9 9个限制酶

41、切位点插入外源片个限制酶切位点插入外源片断可以导致断可以导致tettetr r 基因的失活；另外有基因的失活；另外有3 3种限制酶在种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，Example:a.在pBR322质粒的BamH或Sal位点插入外源DNA片断，切断了tettetr r基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出Ampr rTets s表型的重组pBR322质粒，转化入Amps sTets s的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr r菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上

42、生长。b.在Pst或Sca识别位点插入外源片断会导致Ampr r基因的失活，产生Amps sTetr r表型的质粒。转化大肠杆菌之后，获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Ampr r表型的细胞可以合成 内酰胺酶，它能使青霉素转变成青霉酮酸，而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子，经37度培养过夜后，在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素 内酰胺酶Ampr r的菌落，其周围的碘指示剂溶液变得明亮，而Amps s菌落无此反应。3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累10003000个拷贝。pBR322pBR322质粒载体的改良质粒载

43、体的改良 为了更加实用，人们对为了更加实用，人们对pBR322pBR322质粒进行质粒进行了改良，得到许多了改良，得到许多pBR322pBR322质粒衍生质粒，质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。它们各自具有不同的特点。应用应用pBR322pBR322质粒作为基因克隆载体质粒作为基因克隆载体 水稻叶绿体光诱导基因水稻叶绿体光诱导基因psbApsbA的结构分析的结构分析 基因基因psbApsbA编码的蛋白质，与光合作用系编码的蛋白质，与光合作用系统统相关，并且它能与除草剂阿特拉津结合，相关，并且它能与除草剂阿特拉津结合，它的第它的第264264位氨基酸发生取代反应，由丝氨酸位氨基酸发生取代反应

44、，由丝氨酸变为甘氨酸，可导致其失去与变为甘氨酸，可导致其失去与除草剂阿特拉津除草剂阿特拉津结合的能力结合的能力，推测是三维结构发生了改变，推测是三维结构发生了改变 ；在；在原生生物衣藻、蓝色细菌中，此蛋白质在同一原生生物衣藻、蓝色细菌中，此蛋白质在同一位置由丝氨酸变为丙氨酸的取代反应，会使他位置由丝氨酸变为丙氨酸的取代反应，会使他们获得对除草剂的抗性功能。们获得对除草剂的抗性功能。而且，非竞争条件下，对除草剂阿特拉而且，非竞争条件下，对除草剂阿特拉津抗性的千里光属和苋属，干物质产量比敏感津抗性的千里光属和苋属，干物质产量比敏感植物下降了植物下降了25%25%和和40%40%。通过对基因通过对基

45、因psbApsbA的体外操作，有可能创的体外操作，有可能创造出抗除草剂的或高光效的转基因植株。用造出抗除草剂的或高光效的转基因植株。用pBR322pBR322质粒作为载体，成功的克隆了水稻的质粒作为载体，成功的克隆了水稻的psbApsbA基因。基因。首先将水稻叶绿体首先将水稻叶绿体DNADNA，用，用EcoREcoR内切酶消内切酶消化，经含有溴化乙锭的熔点琼脂糖电泳，回收化，经含有溴化乙锭的熔点琼脂糖电泳，回收分子大小为分子大小为1.81.82.5kb2.5kb之间的之间的DNADNA片断。片断。再与经过再与经过EcoREcoR内切酶切割并用碱性磷酸酶内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的作

46、了脱磷酸处理的pBR322pBR322质粒质粒DNADNA连接。连接。然后转化给大肠杆菌，在氨苄青霉素的选择然后转化给大肠杆菌，在氨苄青霉素的选择培养基上，形成培养基上，形成AmpAmpr r转化子菌落群体。转化子菌落群体。用经用经32p32p标记的玉米标记的玉米psdADNApsdADNA探针作菌落杂探针作菌落杂交，从交，从10001000多个菌落中筛选出多个菌落中筛选出8 8个阳性克隆。个阳性克隆。对这8个阳性克隆进行进一步的Southern分析，表明6个片断带有长度为2.2kb的编码水稻叶绿体psdA基因。实际上其中1.2kb的片断编码着水稻psdA基因的全部序列。通过dna序列分析表明

47、与高等植物的同原性在92%，与蓝色细菌同源性75%3.3.pUCpUC质粒载体质粒载体 人们应用多克隆位点技术，人们应用多克隆位点技术，在在pBR322pBR322的基础上，组入了一的基础上，组入了一个在其个在其5-5-端带有一段多克隆位端带有一段多克隆位点的点的lacZlacZ基因，而发展的具有基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体双功能检测特性的新型质粒载体系列。系列。一种典型的一种典型的pUCpUC系列的质粒载体，包括以下系列的质粒载体，包括以下四个部分：四个部分：1 1、来自、来自pBR322pBR322质粒的复制起点（质粒的复制起点（oriori）；）；2 2、氨苄青霉素抗性

48、基因（、氨苄青霉素抗性基因（ampampr r ）,但它的但它的DNADNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。来的核酸内切限制酶的但识别位点。3 3、大肠杆菌、大肠杆菌-半乳糖基因（半乳糖基因（lacZlacZ）的启动子）的启动子及编码及编码-肽链的肽链的DNADNA序列，此结构称之为序列，此结构称之为lacZlacZ基因；基因；4 4、位于、位于lacZlacZ基因中的靠近基因中的靠近5-5-端的一段多端的一段多克隆位点（克隆位点（MCSMCS）区段。但它并不破坏该基因）区段。但它并不破坏该基因的功能。的功能。Ampror

49、ipUC18(3 kb)MCS(Multiple cloning sites,多科隆位点）Lac promoterlacZpUCpUC质粒载体的形体图质粒载体的形体图pUC质粒载体的优点第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500700个拷贝。第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。第三

50、，具有多克隆位点MCS区段 方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。4.4.其它的重要的质粒载体其它的重要的质粒载体丧失迁移功能的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体穿梭质粒载体（1 1）丧失迁移功能的质粒载体）丧失迁移功能的质粒载体第一：拥有较高水平的拷贝数第一：拥有较高水平的拷贝数,平均平均每个大肠杆菌寄主细胞可达每个大肠杆菌寄主细胞可达30453045份份;第二第二:失去了失去了bombom位点，即便在共存位点，即便在共存的的F F质粒提供转移装置的条件下，也不质粒提供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。可能发生迁移作用。（2）能在体外转录克隆基因的质粒载体 pGEM-3Z是一种与p