第三章固定化酶及反应动力学课件.ppt

1、第三章固定化酶及反应动力学概述概述固定化后酶性质变化及动力学影响因素固定化后酶性质变化及动力学影响因素外扩散限制效应外扩散限制效应内扩散限制效应内扩散限制效应扩散影响下的表观动力学参数扩散影响下的表观动力学参数内 容酶应用过程中的一些不足酶应用过程中的一些不足l酶的稳定性较差酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。l酶的一次性使用酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利

2、用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。l产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。固定化技术固定化技术什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术01 概 述固定化：将酶通过物理或化学方法固定在载体上或限制在一定空间内。固定化酶（固定化酶（immobilized enzyme）l亦称固相酶或水不溶酶。是用物理的或化学的方法使酶装变为在一定的空间内其运动受到完全约束，或受到局部约束的一种不溶于水，但仍

3、具有活性的酶。能以固相状态作用于底物进行催化反应。l水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。固定化酶的研究始于固定化酶的研究始于19101910年，正式研究于年，正式研究于2020世纪世纪6060年代、年代、7070年代已在全世界普遍开展。年代已在全世界普遍开展。19531953年德国的年德国的 GrubhoferGrubhofer和和SchleithSchleith采用聚氨基苯乙烯树脂采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。，制成固定化酶。6060年代后期，固定化技

4、术迅速发展起来。年代后期，固定化技术迅速发展起来。19691969年，日本的年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-DL-氨基酸连续生产氨基酸连续生产L-L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。在在19711971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为定化酶的统一英文名称为Immobilized enzymeImmobilized enzyme。随着固定化技术的发展，出现固定化菌体随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。197

5、31973年，日年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-L-天门冬氨酸。天门冬氨酸。在固定化酶和固定化菌体的基础上，在固定化酶和固定化菌体的基础上，7070年代后期出现了年代后期出现了固定化细胞技术。固定化细胞技术。19761976年，法国首次用固定化酵母细胞年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，生产啤酒和酒精，19781978年日本用固定化枯草杆菌生产淀年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。1982198

6、2年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。变革提供了新的方向。与游离酶相比与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控定性高、分离回收容易、可多

7、次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。境效应而符合可持续发展的战略要求。为什么固定化？为什么固定化？易从反应系统分离，简化产物纯化过程。稳定性增加，不易失活具有一定形状和机械强度，可以装填于反应器固定床反应器可连续生产，过程易控

8、制。简化了提取工艺，增加产物收率，提高产品质量更适合多酶反应酶使用效率提高，产品成本降低存在问题存在问题(1)制备困难，活性降低(2)增加了载体成本费及固定化操作费用；(3)增大了颗粒扩散阻力，使反应速度下降。固定化细胞01 概 述固定化细胞固定化细胞 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。特点：特点：1.无需进行酶的分离和纯化。2.细胞本身含有多酶体系，可催化一系列反应。3.酶的辅助因子可以再生，稳定性高。4.保持酶的原始状态，酶的回收率高。5.抗污染能力强。01 概 述工业规模的酶固定化方法应具备的条件：(1)载体价廉、固定

9、化费用低；(2)能反复利用，即对非一次性固定化酶，其载体要求能再生；(3)固定化收率高、制备简便、而且结合力强；(4)载体的机械强度高；(5)物理及化学性质稳定，使用于食品加工时要安全无毒01 概 述固定化酶制备方法固定化酶制备方法01 概 述l吸附（载体结合）法：物理吸附(活性碳，硅胶等)，离子结合（离子交换剂和离子交换树脂），共价结合。作用力增强，对酶影响加大。l交联法：利用多功能试剂使酶间交联（异氰酸酯，联苯胺，形成共价键）。l包埋法：包埋于高分子凝胶网格（网格型），高分子半透膜（微囊型）（医学应用多）化学偶联酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联包埋吸附间歇间歇连续连续酶的固定化技术和固

10、定化酶01 概 述l活性中心活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。l功能基团功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合l酶的高级结构酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。固定化酶操作的注意事项固定化酶操作的注意事项1 吸附法吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。物理吸附法:通过氢键、疏水作用和通过氢键

11、、疏水作用和电子亲和力等物理电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上从而制成固定化酶作用，将酶固定于水不溶载体上从而制成固定化酶。常用的载体有：有机载体。纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。比如用纤维素作为吸附剂，用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶。吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg/cm2。无机载休。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。比如用多孔硅为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的alpha-淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应。半衰期分别为14、35、60d。无机载体的吸附容量较低、而且

12、酶容易脱落。固定化酶制备方法固定化酶制备方法01 概 述l吸附（载体结合）法：物理吸附(活性碳，硅胶等)，离子结合（离子交换剂和离子交换树脂），共价结合。作用力增强，对酶影响加大。l物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用，因此对一些反应不适用。(2)离子交换吸附法:这是将酶与含有离子交换基的水不将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类

13、（ECTEDLA）-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、410、900等。阳离子交换剂，如羧甲基(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC50、IR200、Dowex50等。uDEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：将DEAE-SephadexA25充分溶胀用0.5mol/LNa0H和水洗涤后，加入pH7.07.5的米曲霉-粗酶液(水解乙酰DL-Ala活力为25umol/m1h)充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化

14、酶，置4备用。固定化酶活力回收50-60，水解乙酰DLA1a活力为600-800umol/gh湿固定化酶。氨基酰化酶也可固定于DEAE纤维素。u此外，DEAE纤维素吸附的淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷。能通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷。能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸。用水溶性乙烯顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE纤维素和DEAEScphadex载体有效的固定。这种固定几乎是不可逆的吸附。此外酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度

15、及酶和载体的特性相关。pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(1-2pH单位)吸附将明显减少，但也有个别例外。盐对吸附的影响较为复杂在一些特殊事例中、盐可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。对蛋对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。载体的表面积、多孔性及其顶处理都影响对酶的吸附。吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用。但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大，同时由于吸附法

16、制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性。共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的连接的方法。在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。常用的载体包括天然高分子（纤维素、琼脂糖、葡萄糖凝胶、胶原及其衍生物），合成高分子(聚酰胺、聚丙烯酰胺、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等)和无机支持物（多孔玻璃、金属氧化物等）。共价结合法制备的固定化酶，酶和载体的连接键结合牢固，使用寿命长，但制备过程中酶直接参与化学反应，常常引起酶蛋白质的结构发生变化，导致酶活力的下降，往往需要严格控制操作条

17、件才能获得活力较高的固定化酶。(1)酶分子和载体连接的功能基团 从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：酶蛋白N端的M氨基或赖氨酸残基的-氨基。酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基的-羧基和Glu残基-羧基。Cys残基的巯基。Ser、Tyr、Thr残基的羟基。Phe和Tyr残基的苯环。His残基的咪唑基。Trp残基的吲哚基。在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶失去活性。(2)载体的选择载体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是:一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定一般亲水载体在蛋白质结合

18、量和固定化酶活力及其稳定 性上都优于疏水载体。性上都优于疏水载体。载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。载休没有或很少有非专一性吸附。载休没有或很少有非专一性吸附。载体来源容易便便并能反复使用。载体来源容易便便并能反复使用。(3)偶联反应 酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行。现已有许多种偶联反应都能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定性作用，必须考虑到酶的偶

19、联效率固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素。现介绍如下：重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH89)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。可能与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的N端氨基或Lys的氨基形成双偶氮化合物。常用载体及其反应如下：a.多糖类的芳香族氨基衍生物。我国独创的使用对-硫酸脂乙砜基胺(ABSE)多糖(纤维素，葡聚糖，文联琼脂糖，交联琼脂及淀粉)属于此类载体。在碱性条件下用对硫酸脂乙砜基胺话化多糖，制得的醚键连接的乙砜基苯胺衍生物，经重氮化后偶联酶：b

20、.氮基酸共聚体。如LLeu和对氨基DL苯丙氨酸共聚物：待1mol/L的LLeu和对氨基DLPhe的N羧基酐的苯溶液在少量水存在及室温下进行反应制成。共聚物与亚硝酸作用转变为重氮盐，可供酶固定用。用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。c.聚丙烯酰胺衍生物。该类衍生物的商品名称为bioGel或Enzacry。如EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，经重氮化可固定酶。用此法制备的有氨基酰化酶，淀粉酶等固定化酶。d.苯乙酰树脂。这是聚氨基苯乙烯(a)和一种异丁烯一间一氨基苯乙烯(b)的共聚物，通过重氮化后可固定酶如胃蛋白酶、核糖核酸酶等。e.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。玻璃的

21、化学改造物多孔玻璃在丙酮中与Y氨基丙基三氧乙烷硅回流加热，生成烷基胺玻璃:烷基氨玻璃用对硝基苯酚氯处理后，再还原，转变为芳香基衍生物:此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合产生固定化酶。芳香烃化反应 具有卤素取代的芳香环或含有卤素取代的杂环的高聚物以及含有卤乙酰基的高聚物，可以通过烷基化、芳香基化，在碱性条件下，与酶分子上的氨基、酚基、巯基等反应，如：a.将纤维素在二恶烷(Diaxanc)-溴乙酸中与嗅乙酰溴反应，形成溴乙酰纤维素，可供胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化：常用载休有卤乙酰、卤异丁烯衍生物，如氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维索、碘乙酰纤维素等。b.纤维素等载体在碱性条件下和均三氯三嗪等反应

22、，引入活泼的卤素基后，能与酶的氨基、酚羟基、巯基反应，产生固定化酶。与纤维素共价结合的另一类芳香烃化功能基是3-F-4，6-二硝基苯。控制pH7，使它勺酶分子的氨基反应，产生固定化酶。c.四元缩合反应 利用四元化合物(羧酸、胺、醛和异氰酸)发生缩合反应，形成N取代的酰胺。在反应中，羧酸(R1)和胺化合物(R2)形成酰胺键，醛(R3)和异氰酸(R4)结合形成酰胺氮的侧链：当选择适当条件，适当的载体及控制反应液中的添加物，可以使连接键或通过酶的氨基或通过羧基，将酶固定并免除有害反应。例如：在乙醛和小分子的3(二甲氨基)丙基异氰酸存在下，用0.5mol/L HCl维持pH6.5，搅拌反应6h，用带氨

23、基的聚合物，可以与酶分子的羧基偶联。而带COOH的高聚物在醛和异氰酸存在下，可与酶分子的NH2偶联。d.巯基二硫基交换反应 带有SH或二硫基的载体，通过巯基二硫基的交换反应，和酶分子上非必需巯基偶联。若载体的功能基团为SH时，可先用2，2二吡啶二硫化物处理，生成的二硫基中间产物在酸性条件下能与酶分子的巯基发生交换反应，从而产生固定化酶。此法通过小分子巯基化合物的运转，使载体可以再生：e.金属偶联法 利用某些过渡金属盐溶液将载体(纤维素、尼龙、硼硅玻璃、滤纸及酵母细胞等)浸泡24h，洗除末反应的金属盐后，制得的活化载体放入酶溶液中，即可将酶固定化。如：f.缩合反应 一些带羧基或氨基的载体用羰二亚

24、胺活化后，与酶分子的氨基或羧基直接偶联，形成肽键，产生固定化酶。般在弱酸条件下(pH4.755)将酶、羰二亚胺、载体同时混合，羰二亚胺与载体的羧基反应生成活泼的O乙酰异脲衍生物，与酶分子的氨基缩合成肽键或者重排为酰基脲。例如以丙烯酰胺和丙烯酸共聚物为载体用缩合法制备固定化胰蛋白酶。0.95g丙烯酸用3mol/L NaOH调pH6.5，加入1.95g丙烯酰胺和0.1g N，N甲叉双丙烯酰胺，再加入0.1mol/L pH6.5磷酸缓冲液，使体积为10m1，加入25mg过硫酸铵和22ulN，N，N，N，N四甲基乙二胺，抽真空除气泡，4聚合30min，压挤成粒，搅拌下水洗丙酮干燥备用。70g干胶在20

25、m10.5mol/L HCl中搅拌30min，用水和 O.1mol/L pH 6.5磷酸缓冲液洗涤后转至小烧杯，加入3.5ml 0.1mol/L pH65磷酸缓冲液的8.75mg胶原蛋白酶后，搅拌5min，接着加1环己基3(2吗啉乙基)羰二亚胺甲基对甲苯磺酸，连续搅拌18h，洗涤后即为固定化酶。g.叠氮反应 带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理使之酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在HNO3作用下转变成叠氮衍生物。此衍生物在低温下可与酶蛋白的羟基、酚基或巯基等反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与一NH2反应。此法常用载体有羧甲基纤维素、CMSephadex、聚天冬氨酸

26、、BioGel.CM100、乙烯顺丁烯二酸酐共聚物、Amberlite IRC50等。叠氮法用途较广，举例如下：以CM一纤维素(CMC)叠氮衍生物为载体固定化胰蛋白酶。首先，载体的酯化与肼解：CMC依次用水、乙醇和乙醚洗涤，干燥后，悬于无水甲醇，在冰浴冷却下通入HCl气体，使之饱和。室温下过夜，并重复此过程(甲酯化)。然后用甲醇、乙醚充分洗涤，并空气干燥。将产物悬于甲醇中，加入80水合肼，回流1h。放置过夜，过滤，再用甲醇洗涤，干燥。其次为偶联：1g CMC酰肼和150m1 2HCl在冰浴中混合，搅拌下滴加9ml%3 NaNa2，冰水浴中搅拌20min。离心弃去上清液。沉淀用150m1二氧氯环

27、洗涤再用150m1冷的蒸馏水洗涤二次，并且悬于预冷的10ml 0.05mol/L pH87磷酸缓冲液的胰蛋白酶溶液中，5搅拌反应23h，用HCl凋PH4，冷0.001mol/L HCl洗三次，冷水洗一次，冻干，即为固定化酶。j.异硫氰酸反应 含有芳香氨基的载体，在碱性pH条件下，与光气或硫芥子气反应生成异硫氰酸或异琉氰酸衍生物，可在温和条件下与酶分子的氨基连接，产生固定化酶。用含有酰基叠氮的载体在加热下与HClI反应，亦得到异硫氰酸衍生物亦可用于固定化酶。k.溴化氰亚胺碳酸基反应 含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下，载体的羟基与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件

28、下，可与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。例如：用CNBr活化的琼脂糖固定化胰蛋白酶。将Sepharose 4B用蒸馏水洗净，含0.1g干物质的湿胶加5ml水和4ml现配溴化氰水溶液(25mg/m1)，搅拌下用2mol/LNaOH调pHll.0，2325反应6min，抽干立即用300ml 0.1mol/L NaHCO3洗净,(58min内完成)。活化的载体用0.025mol/L pH10.2（含0.02mol/L CaCl2）硼酸缓冲液液快速淋洗后，用5m1缓冲液转入烧杯内加16mg结晶胰蛋白酶，搅拌4h，用0.1mol/L pH8.5硼酸缓冲液(内含1mol/L NaCl)洗涤后，复用pH4.

29、1的醋酸缓冲液洗涤，便制成了固定化胰蛋白酶。酰氯化反应 含羧基载体如羧基树脂(Amberlite IRC50等)，可用氯化亚砜处理，生成酰氯衍生物，与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。m酸酐反应 乙烯或苯乙烯、甲代乙烯基与顺丁烯二酸酐的共聚物，在己二胺作用下，酸酐与酶蛋白的氨基起偶联反应，产生固定化酶。n活化酯法 含羧基的共聚物载体在二环己基碳二亚胺(DDC)存在下用N羟基琥珀酰亚胺活化，产生活化酯，再在温和条件下连接酶。n.含醛基高聚物 多糖类如淀粉、葡聚糖、纤维素等用高碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每葡萄糖产生两个醛基)高聚物，可与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶。例如：用甘蔗渣纤

30、维素衍生物固定化木瓜蛋白酶。载体制备：60g甘蔗渣纤维素浸于500ml 0.6NaOH溶液中85处理30min，水洗至中性，抽干。悬浮于NaI04溶液中，空温下搅拌12h，用水反复冲洗、抽干。置于IL脲溶液中，搅拌。产物用水反复洗涤，抽干后，置于12甲醛溶液中搅拌处理12h，用水洗涤，除去过量甲醛，反应过程如下：加酶固定:上述载体1g加入1mg/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液配制)搅拌下48固定18h后，用PH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液(合0.4mol/LNaCl)洗去多余酶液，抽干，即为固定化酶。交联法交联法 这是利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体

31、间，或酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的力法。最常用的交联试剂是戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮联苯胺-2，2二磺酸、1，5二氟2，4二硝苯、己二酰二胺甲脂等。用戊二醛交联制备固定化酶的反应如下：交联法有下列方法：(1)交联酶法 在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。这种反应与酶和试剂浓度、溶液PH和离子强度、温度、反应时间均有一定的关系。如木瓜蛋白酶在0.2酶蛋白浓度、2.3戊二醛、pH5.27.2、0下交联24h，可形成固定化酶。其中，FH的影响L分明显，随pH升高，闭定化速度增加5pH低于4不能形成固定化酶。其中，pH的影响十分显著，随pH升高，

32、固定化速度增加；pH低于4不能形成固定化酶。有人认为pH应控制在酶的等电点附近有利于固定化。在交联时，加入一定量中性盐如Na2SO4、（NH4)2SO4等和丙酮等有机溶剂有助于形成固定化酶。温度也有一定影响如木瓜蛋白酶和戊二醛在pH6.0、0长时间反应，只得可溶性固定化酶，若在室温下0一5h，即可形成不溶性固定化酶。这种情况对不同酶可能有不同结果。这种方法也用于制备交联的结晶酶。交联结晶酶仍具有一定酶活力。例如：将500mg酶溶于5m1 0.2mol/L pH6醋酸缓冲液中，在搅拌下滴加2m1 2.5戊二醛，在室温下放置1030min，会有沉淀析出，13h内反应结柬。形成的凝胶切碎后水洗，除多

33、余戊二醛，即为固定化酶。(2)酶与辅助蛋白交联法 用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶共交联从而制备固定化酶由于酶在交联反应过程中因化学修饰而引起失活，或因可得到的酶量有限时，因此，通常以一些辅助蛋白，如牛血清白蛋白、明胶、胶原、抗体等，与酶一起进行交联。例如：10mg脲酶与2.5ml含6白蛋自、0.2戊二醛的0.02mol/L pH8磷酸缓冲液混合，冷到30后，冉升温至4 下,放置4h将形成的泡沫聚合物彻底洗除后，冻干，即为固定化脲酶。(3)载体交联法 是用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法。例如：尼龙固定化木瓜蛋白酶的制备：尼龙布用含1

34、8.6CaC12和18.6水的甲醇溶液处理10min，洗净吸干，于3.65mol/LHCl中45水浴中水解45min，水洗至中性，吸干，用5戊二醛溶液(0.2mol/L pH8.5硼酸缓冲液配制)，于20搅拌交联20min，用PH7.8 0.1mol/L磷酸缓冲液洗去多余戊二醛。2g处理载体(尼龙)加入4ml酶溶液(1mg/ml）于45下固定3h后，用0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液(内含0.5mol/LNaCl)洗涤，除去多余酶液，抽干，即为固定化木瓜蛋白酶。单用戊二醛等试剂文联制备的固定化酶活力较低，常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。壳

35、聚糖微球固定化木瓜蛋白酶制备。壳聚糖微球制备：4g壳聚糖洛于100m12醋酸溶液，在搅拌下缓慢滴人烧杯中的透平油(酸性胶与透平油的比例为1：3)中，技4：35：1比例加入25戊二醛溶液，再用1mol/L NaOH溶液调pH910，置水浴(60一70)中3h，冷却后，弃去上层油液，依次用石油醚、丙酮、无水乙醇、水洗涤真空干燥备用。酶的固定化：0.5g载休于0.1mol/L pH7.2磷酸缓冲液浸泡24h，抽干，加入1.6mg/ml的木瓜蛋白酶溶液0.6mL，48下吸附12h，滴入0.6戊二醛溶液3m1于48交联3h后弃去上层溶液，用0.1mol/L pH72磷酸缓冲液(含NaCl 0.5mol/

36、L)洗多次，吸干水分，即得固定化酶。活力回收约60，在填充休反应器内连续水解酪蛋白(05)时半衰期为16d.包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂剂(包括交联剂包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化到固定化。包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。

37、包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。包埋法(1)凝胶包埋法 凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子中凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子中。聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法。一般的制备过程如下：将1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和40mgN，N甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中，再加0.5ml 15的二甲氨基丙腈(加速剂)，同时，加入1过硫酸钾(引发剂)，混合，于25T：保温10min，便得含酶凝胶。将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒于低温储存或冷冻干燥。为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有机溶液中，使分散成含

38、酶的珠状凝胶。聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。服。辐射包埋法辐射包埋法。酶溶于纯单体水溶液、单体加合物水溶液或纯聚合物溶液中在常温或低温下，用x射线、Y射线或电子束辐照。可得到包埋酶的亲水凝胶。如用X射线引发聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。1973年HMaeda等用聚乙烯水溶液辐照包埋了多种酶。运用弱水性或稍微疏水性的玻璃化载体，用低温过冷态的辐照聚和，可用于般生物物质的固定化。这些生物物质主要分布在载体表面层区域，固定化产物表面

39、具有生物活性，曾称这种方法为粘附法。这种方法可粘附酶、叶绿素、病毒等，长期使用后仍有较高的活性。可以使用玻璃化单体，玻璃化单体和非玻璃化单体混合物、单体和天然聚合物的混合物为载体。其他凝胶包埋法。其他凝胶包埋法。a.淀粉凝胶包埋法淀粉凝胶包埋法。将氨基甲酸乙酯的泡沫垫浸入温热的淀粉溶液和乙酰胆碱脂酶的混合物中，再经冷却、干燥，便制得固定化乙酰胆碱脂酶。，为增强机械强度和重新水合可加入定量的甘油。胶原有纤维性，易成膜，能在生理pH下自发的聚焦成束，胶束末端可以通过多种次级键与酶分子相互作用，通过酶和胶原分子形成网架而将酶固定化。其制备方法极为简单：将酶加到胶原悬浮液中、铺膜、干燥即得固定化酶。或

40、者经过透析的酶和胶原混合，插入电极，酶胶原复合物便在电极上沉淀。c.卡拉胶包埋法卡拉胶包埋法：卡拉胶(KCarrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。具体方法：将100gx酶在3750溶于水中，又将1.7g卡拉胶在40一60溶于34ml生理盐水中，二者混合后冷全10，所成凝胶浸在0.3mol/L KCl 溶液中硬化，作成适当大小的颗粒,即为固定化酶。d.天然血纤维包埋法天然血纤维包埋法：血纤维不会引起抗体形成，且无毒。在柠檬酸缓冲液中使酶和血纤蛋白原及凝血酶混合、便制得血纤蛋白包埋的固定化酶。酶分子的氨基和血纤蛋白的谷氨酰胺残基之间发生交联

41、而将酶固定化。e.大豆蛋白包埋法大豆蛋白包埋法。含葡萄糖异构酶的链霉菌菌株与大豆蛋白溶液混合，在60用碳酸镁处理使其凝结，过滤制球，干燥后用戊二醛和六甲叉二胺处理，硬化从而制得固定化葡萄糖异构酶。(2)微囊化法微囊化法 此法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触从而增加了酶的稳定性同时，小分子底物能通过膜与酶作用，产物经扩散而输出。微囊一般直径约1100um，膜厚约100nm，膜上孔径约3.6nm，表面积与体积之比极大，物质能很快达到平衡，能有效的包埋许多种酶。同时、可用不同类型、不同浓度的酶、细胞提取物或细胞，不同组成

42、和含量的膜包裹组建成人工细胞.因此，此法在医疗上极为有用。例如固定化天门冬酰胺酶(治疗白血病)就是用这种方法制成的微胶囊。微胶囊的制备方法有4种。界面沉淀法界面沉淀法。是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，从而将酶包埋的方法。如，含有高浓度血红蛋白的酶溶液在与水不互溶、沸点比水低的有机相中乳化，加入油溶性表面活性剂，形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物在搅拌下加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂使高聚物在油一水界面上沉淀形成膜，最后移于水相，从而制成固定化酶。作为高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。如“人造细胞”制备：25ml 10%血红蛋白

43、水溶液(内含适当酶、界面聚合法界面聚合法。界面聚合法是将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜,使酶包埋于半透膜微囊中。此法曾用来制备Asn酶、脲酶等。制备方法一般是：将酶水溶液与亲水单体(如乙二醇)用一种水不溶混的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同一有机溶剂疏水单体(如多异氰酸)溶液在搅拌下加入到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有机溶剂之间的界面发生聚合化 这样水相中酶便包埋在聚合体(聚脲)膜内。例如用含酶的10血红蛋白水溶液与己甲叉二胺的水溶液混合，立即在1Span85的氯仿-环已烷中分散乳化,加人癸二酰氯(有机相)后，便在油-水界面发生聚合反应，弃除上清液，加入Tween-20去乳化,

44、洗除有机溶剂，除去未聚合单体后，转入水相，制得固定化酶。液体干燥法液体干燥法。此法曾用乙基纤维素和聚苯乙烯包埋过氧化氢酶、脂肪酶等。它是将一种聚合物溶于一种沸点比水低，且与水不混溶的溶剂中加入酶液后，加入油溶性表面活性剂为乳化剂使之乳化。再把它分散于含有保护性胶质如明胶、聚丙烯醇和表面活性剂的水溶液中，第二次乳化.在不断搅拌下，低温真空除去有机溶剂，便得含酶微囊。常用聚合体有乙基纤维素、聚苯乙烯、氯橡皮等，有机溶剂有苯、环己烷和氯仿。红血球包埋法红血球包埋法。在高渗溶液中红细胞膨胀伸展后，细胞内血红蛋白漏出，同时胞外蛋白也能扩散进红血球再放进等渗溶液中，红血球膜又回复至正常状态和透性，进入的酶

45、不会漏出来.脂质休包埋法。脂质休包埋法。上述微囊法是一种半透性膜将酶包埋，近年来采用双层脂质体形成极细球粒包埋酶。例如将卵磷脂、胆甾醇和二鲸腊磷酯按7：2：1溶于氯仿中再加入酶液，混合物在旋转蒸发器中，在氮气下32转动乳化，然后在室温下保持2h，再在氮气气流中4用音波处理10s，在室温下保持2h，过Sepharose 6B柱，收集脂质体，离心分离脂质体，所得球粒悬浮于缓冲液中，继续音波处理，并过Sepharose 6B柱，可得含酶的微囊。这种微囊液膜当底物产物穿过时、与膜的径无关但与产物或底物对膜成分的溶解度有关。脂质体包裹脂质体包裹固定化酶制备方法固定化酶制备方法01 概 述l吸附（载体结合

46、）法：物理吸附(活性碳，硅胶等)，离子结合（离子交换剂和离子交换树脂），共价结合。作用力增强，对酶影响加大。l物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用，因此对一些反应不适用。l化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法.01 概 述酶固定化方法01 概 述CharacteristicCarrier Binding MethodsCross-linking MethodEntrapping MethodP

47、hysical adsorptionIonic Binding Covalent BindingPreparationEasyEasyDifficultDifficultDifficultEnzyme ActivityLowHighHighModerateHighSubstrate SpecificityUnchangeableUnchangeableChangeableChangeableUnchangeableBinding ForceWeakModerateStrongStrongStrongRegenerationPossiblePossibleImpossibleImpossible

48、ImpossibleGeneral ApplicationLowModerateModerateLowHighCost of ImmobilizationLowLowHighModerateLowComparison of the Characteristics of Different Methods of Enzyme Immobilization固定化酶在工业生产上的应用乙酰乙酰-(DL)-Ala L-Ala+乙酸乙酸乙酰乙酰-D-AlaAminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶固定化酶的应用固定化酶的应用01 概 述世界上第一种工业化生产的固定化酶。世界上第一种工业化生产的

49、固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala固定化酶在工业生产上的应用固定化酶的应用固定化酶的应用01 概 述高果糖浆的生产高果糖浆的生产淀粉液化液淀粉酶糖化酶糖化液喷雾干燥氢化还原结晶异构

50、酶粉状葡萄糖山梨醇结晶葡萄糖果葡糖浆果糖42%葡萄糖55%低聚糖分离混合高果糖浆果糖浆果糖80-90%果糖55%葡萄糖39%低聚糖世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶的放线菌细胞用6065热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。青霉素酰化酶转化流程图青霉素酰化酶转化流程图酶传感器酶传感器l酶传感器是由固定化酶与传感元件两部分组成的，其中酶是与适当的载体结合形成的不溶于水的固定化酶膜。l最常用的酶传感器是酶电极酶电极，即将固定化酶膜与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反应而生成电极活性物质后，电极