植物细胞工程课程2课件.ppt

1、第三章第三章植物离体细胞发育的细胞学基础V均等分裂均等分裂单倍体愈伤组织单倍体愈伤组织近年来在蔓陀近年来在蔓陀罗、水稻、玉罗、水稻、玉米中发现了此米中发现了此途径。途径。大孢子母细胞大孢子母细胞(胚囊母细胞胚囊母细胞)单倍性的四单倍性的四分体分体减数分裂减数分裂只有远离珠孔端只有远离珠孔端的一个细胞发育的一个细胞发育胚囊细胞胚囊细胞8细胞胚囊细胞胚囊3次有丝分裂次有丝分裂 芽芽-芽型芽型桃桃 单芽茎段单芽茎段大樱桃大樱桃 单芽茎段单芽茎段桃儿七桃儿七 抱窝鳞茎抱窝鳞茎大蒜茎尖培养大蒜茎尖培养种子或胚种子或胚 芽（带芽原球茎芽（带芽原球茎)植株。植株。桃幼胚培养桃幼胚培养桃儿七幼胚培养桃儿七幼胚

2、培养 非芽-芽型四四.器官发生型器官发生型（Organogenesis)叶片、花药叶片、花药茎尖、根茎尖、根未授粉胚珠植株原胚原胚多细胞原胚多细胞原胚球形胚球形胚鱼雷胚鱼雷胚成熟胚成熟胚 2 2、体细胞胚的第一次分裂虽多为不均等、体细胞胚的第一次分裂虽多为不均等分裂，但也有近似的均等分裂。分裂，但也有近似的均等分裂。双子叶植物胚胎发生的细胞学特征（拟南芥）双子叶植物胚胎发生的细胞学特征（拟南芥）不同线条表示胚胎与幼苗之间结构上的对应关系不同线条表示胚胎与幼苗之间结构上的对应关系胚性细胞胚性细胞寡细胞原胚寡细胞原胚多细胞原胚多细胞原胚球形胚球形胚心形胚心形胚子叶胚子叶胚(mitochondrio

3、n)愈伤组织圆形薄壁细胞的核增大愈伤组织圆形薄壁细胞的核增大,核仁着色深核仁着色深,一般具一般具 有两个以上的核仁，大液有两个以上的核仁，大液泡消失，细胞质电子密度明显加强，质体泡消失，细胞质电子密度明显加强，质体plastid),核糖体核糖体(ribosome)，特别是线，特别是线 粒体粒体(mitochondrion)数数 量明显增加量明显增加,同时核糖体不仅数量增加同时核糖体不仅数量增加,而且聚集成多聚而且聚集成多聚核糖体核糖体(polyri-Bosome or polysome)。早期胚性细胞与周围细胞间还存在广泛的胞间连丝通过胞间连丝传递物早期胚性细胞与周围细胞间还存在广泛的胞间连丝

4、通过胞间连丝传递物质和信号，为胚性细胞的进一步分化与发育奠定了基础。质和信号，为胚性细胞的进一步分化与发育奠定了基础。红豆衫细胞聚集体红豆衫细胞聚集体 随着胚性细胞的发育随着胚性细胞的发育,细胞拉长，核偏移细胞拉长，核偏移,细胞壁加厚，线粒体（细胞壁加厚，线粒体（M）数目）数目进一步增加进一步增加,常连片分布于细胞质中常连片分布于细胞质中,既有大量游离核糖体既有大量游离核糖体,又有多聚核糖体存又有多聚核糖体存在在,并出现高尔基体并出现高尔基体(golgibody)和微管和微管(microtu-bule)等。等。推测：胚性细胞是通过外推测：胚性细胞是通过外源激素的诱导而启动的。因源激素的诱导而启

5、动的。因为外源激素作用的部位是质为外源激素作用的部位是质膜，首先诱导膜蛋白的合膜，首先诱导膜蛋白的合成，于是导致成，于是导致膜膜ATPATP酶酶活性活性提高。提高。推测：处于推测：处于“生理隔离生理隔离”晚期的胚性细胞或胚性细胞晚期的胚性细胞或胚性细胞团一直处于一个团一直处于一个厚壁包围厚壁包围之之中，与其周围细胞之间的胞中，与其周围细胞之间的胞间连丝也消失。间连丝也消失。ATPATP酶的广泛酶的广泛存在和保持较高活性为胚性存在和保持较高活性为胚性细胞或原胚的一系列代谢提细胞或原胚的一系列代谢提供了能量保证。供了能量保证。球形胚球形胚 梨形胚梨形胚 香蕉形胚香蕉形胚 子叶分化期胚子叶分化期胚

6、成熟胚成熟胚1.401103 0.932 103 1.093 103 1.294 103 1.109 103 8822培养基成分，尤其是培养基成分，尤其是激素的种类与水平，激素的种类与水平，决定了外植体基因活决定了外植体基因活动的水平。动的水平。基因活动的水平基因活动的水平决定生理生化变决定生理生化变化的范围与程度。化的范围与程度。生理生化变化的范生理生化变化的范围与程度，决定外围与程度，决定外植体形态发生的质植体形态发生的质量。量。预定阶段预定阶段表达阶段表达阶段通过调节培养基成通过调节培养基成分、激素组成与配分、激素组成与配比继续进行诱导比继续进行诱导60.6460.6464.3064.3

7、0如核融合、核内有丝分裂、核内染色体如核融合、核内有丝分裂、核内染色体复制等产生整倍多倍体；一些不正常的有丝分裂则复制等产生整倍多倍体；一些不正常的有丝分裂则导致产生非整倍体，如多极分裂、落后染色体、染导致产生非整倍体，如多极分裂、落后染色体、染色体后期桥等；色体后期桥等；结构变异：结构变异：分裂过程中染色体的重复、缺失、易位分裂过程中染色体的重复、缺失、易位和倒位等。和倒位等。易位易位2n2n1414在合适的培养条件下，离体的组织或细胞可以在合适的培养条件下，离体的组织或细胞可以脱分化、再分化形成任何我们所需的芽、根、叶、脱分化、再分化形成任何我们所需的芽、根、叶、花，并逐步发育成完整的植株

8、。花，并逐步发育成完整的植株。植物器官再生的种类受内、外两种因素控制，植物器官再生的种类受内、外两种因素控制，即外植体的来源和所处生理状态与培养时使用的激即外植体的来源和所处生理状态与培养时使用的激素种类和浓度。素种类和浓度。调节植物体内激素调节植物体内激素 的分布和时间的分布和时间腋芽和茎尖分生组织发育腋芽和茎尖分生组织发育 的时间和腋芽形成数目的时间和腋芽形成数目 腋芽分生组织及腋芽分生组织及其后的发生发育过程其后的发生发育过程中央区中央区 (CZ)(CZ)周围区周围区(PZ)(PZ)肋区（肋区（RZRZ）茎端形态发生区茎端形态发生区侧生形态侧生形态发生区发生区L1L2L3原套原体表皮层皮

9、层原中柱原SAM结构结构周围区的细胞通常较小周围区的细胞通常较小,细胞分裂速度较快细胞分裂速度较快,位于位于SAM的的侧翼边缘侧翼边缘,发育过程中分化为叶、侧芽和茎外层组织。肋发育过程中分化为叶、侧芽和茎外层组织。肋区促成茎的伸长。区促成茎的伸长。中心区由分裂慢、体积大的细胞组中心区由分裂慢、体积大的细胞组成成,构成了一个自我更新的干细胞构成了一个自我更新的干细胞库库,是形成茎、侧生器官是形成茎、侧生器官(叶和花叶和花)以及叶腋分生组织的细胞源。以及叶腋分生组织的细胞源。自体调节/反馈调节原套原体czPZRZSTMCUC2出生侧枝出生侧枝GA STM(KNOX)CKARRWUSHighCK/A

10、uxinRatioLow GAAUXIN STM(KNOX)CKCUCLow CK/Auxin RatioHigh GA转录水平：转录水平：mRNAmRNA含量含量翻译水平：翻译水平：蛋白质含量蛋白质含量(1)Northern杂交杂交(2)mRNA差别显示技术差别显示技术(DDRT-PCR技术技术)(3)mRNA的体外翻译的体外翻译(1)蛋白质的双向电泳蛋白质的双向电泳(2)Western杂交杂交(3)ELLSA检测技术检测技术(酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法)表达与鉴定表达与鉴定:1、顺式作用元件及其鉴出、顺式作用元件及其鉴出:启动子、增强子启动子、增强子2、反式作用因子、反式作用因子转录因子

11、转录因子DNA结合区转录激活区螺旋-转角-螺旋结构,锌指(Zinc finger)结构 亮氨酸拉链(leucine zipper)结构酸性功能区谷氨酰胺丰富功能区脯氨酸丰富功能区mm7 7G G5 5pppppp5 5NPNPNPNPA 从一对不同组织或器官中分离总从一对不同组织或器官中分离总RNA，分别为，分别为A、B两组：两组：B 5-NMAAAAAAAAAAA AA A(A)3n NMTTTTTTTTT TT 3 5 反转录酶反转录酶 3端锚定引物端锚定引物(5-T11MN-3)5-NMAAAAAAAAAAA AA A(A)3n NMTTTTTTTTT TT 3 5 a b 5端随机引物

12、端随机引物C NMTTTTTTTTT TT 3端锚定引物端锚定引物(5-T11MN-3)PCR 5随机引物随机引物 放射性标记放射性标记dNTPs NMTTTTTTTTT TTD cDNAcDNA转录因子转录因子DNA结合区转录激活区螺旋-转角-螺旋结构,锌指(Zinc finger)结构 亮氨酸拉链(leucine zipper)结构酸性功能区谷氨酰胺丰富功能区脯氨酸丰富功能区左图左图右图右图锌指锌指(Zinc finger)结结构构由多个重复的结构组成，每个分子中结合有7-11个锌原子，每2个半胱氨酸（Cys）和2个组氨酸（His）与一个Zn原子结合形成锌指，一个完整的分子可形成多个“指头

13、”，这有利于DNA结合。由亮氨酸丰富区组成两个由亮氨酸丰富区组成两个-螺旋：螺旋：每每7个氨基酸就有个氨基酸就有1个亮氨酸，螺旋个亮氨酸，螺旋中每两圈出现一个亮氨酸；二个蛋中每两圈出现一个亮氨酸；二个蛋白质因子的白质因子的-螺旋通过亮氨酸的疏螺旋通过亮氨酸的疏水作用形成一个拉链（二聚体）水作用形成一个拉链（二聚体）,其其作用只是使两个蛋质分子能形成双作用只是使两个蛋质分子能形成双体，从而有助于碱性功能区与体，从而有助于碱性功能区与DNA结合。结合。亮氨酸拉链亮氨酸拉链(leucine zipper)结构结构AGTAAi p反密码子反密码子tRNA133位丝氨酸位丝氨酸CREB转转录因子录因子133位丝氨酸位丝氨酸 磷酸化磷酸化CREB转转录因子录因子蛋白质激酶蛋白质激酶AcAMPmRNA激活功能区激活功能区被子植物生活史被子植物生活史