专题三核酸电泳技术课件.ppt

1、l琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子克隆的核心琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，它用于分离、鉴定和纯化技术之一，它用于分离、鉴定和纯化DNA片段。片段。该技术操作简单而迅速，并且能分离用其他方法该技术操作简单而迅速，并且能分离用其他方法如密度梯度离心等不能满意分离的如密度梯度离心等不能满意分离的DNA片段。片段。此外，凝胶中此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或入染料如溴化乙锭或SYBRGold染色直接观察到，染色直接观察到，甚至含量少至甚至含量少至20pg的双链的双链DNA在紫外线激发下在紫外线激发下也能直接检测到。需要的话，这些

2、分离的也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。条带可以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。l琼脂糖凝胶的分离范围很大。琼脂糖凝胶的分离范围很大。50bp到百万到百万bp长长的的DNA都可以在不同浓度和构型的琼脂糖凝胶都可以在不同浓度和构型的琼脂糖凝胶中分离。小片段中分离。小片段DNA(5020 000bp)最适合在恒最适合在恒定强度和方向的电场中水平方位的琼脂糖凝胶定强度和方向的电场中水平方位的琼脂糖凝胶内电泳分离。在这些条件下，内电泳分离。在这些条件下，DNA泳动速率通泳动速率通常随常随DNA片段长度的增加而减少，但与电场强片段长度的增加而减少，但与

3、电场强度成正比。然而这一简明的相关性当度成正比。然而这一简明的相关性当DNA片段片段长度超过一个最大极限值时立即被破坏，这种长度超过一个最大极限值时立即被破坏，这种情况主要是由于凝胶的构成和电场强度决定的。情况主要是由于凝胶的构成和电场强度决定的。当线状双螺旋当线状双螺旋DNA的半径超过凝胶的孔径时就的半径超过凝胶的孔径时就达到它分辨率的极限。此时，达到它分辨率的极限。此时，DNA不再被凝胶不再被凝胶按其大小筛分，而必须以一端在前的方式在介按其大小筛分，而必须以一端在前的方式在介质中迁移，就像通过曲折而又空间有限的管子。质中迁移，就像通过曲折而又空间有限的管子。这种迁移模式称作这种迁移模式称作

4、“蠕行蠕行”。l聚丙烯酰胺凝胶最适合分离 小 片 段聚丙烯酰胺凝胶最适合分离 小 片 段DNA(5500bp)。它的分辨率非常强，。它的分辨率非常强，长度上相差长度上相差1bp或质量上相差或质量上相差0.1的的DNA都可以彼此分离。虽然它能很快地都可以彼此分离。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，上样量，但是与琼脂糖凝胶相比在制备和操作上但是与琼脂糖凝胶相比在制备和操作上还是更繁琐些。聚丙烯酰胺凝胶电泳是还是更繁琐些。聚丙烯酰胺凝胶电泳是在恒定电场中垂直方位上进行的。在恒定电场中垂直方位上进行的。vDNA分子的大小分子的大小 双链双链DNA分子在凝胶基质

5、迁分子在凝胶基质迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移得越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过迁移得越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。凝胶孔径的效率低于较小的分子。v琼脂糖浓度琼脂糖浓度 给定大小的线状给定大小的线状DNA片段在不同浓片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DNA电泳迁移率电泳迁移率的对数和凝胶浓度之间存在线状相关。的对数和凝胶浓度之间存在线状相关。vDNA的构象的构象 超螺旋环状超螺旋环状(I型型)、切口环状、切口环状(型型)和线状和线状(

6、型型)DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。上述三种类型在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。上述三种类型的相对迁移率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，但是的相对迁移率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，但是电流强度、缓冲液离子强度和电流强度、缓冲液离子强度和I型超螺旋绞紧的程度或密度型超螺旋绞紧的程度或密度也影响相对迁移率。在一些条件下，也影响相对迁移率。在一些条件下，I型型DNA比比型迁移得型迁移得更快；在另一些条件下，顺序可能颠倒。绝大多数情况下，更快；在另一些条件下，顺序可能颠倒。绝大多数情况下，区分不同构象区分不同构象DNA的需求都很简单，主要是区分未处理的的需求都很简单，主要是区分未处理的环状

7、环状DNA样品和单一位点经限制酶作用线状化的同一样品和单一位点经限制酶作用线状化的同一DNA样品。样品。v凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭插入双链溴化乙锭插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。因此线状造成其负电荷减少、刚性和长度增加。因此线状DNA-染料复合物在凝胶中的迁移率约降低染料复合物在凝胶中的迁移率约降低15。v所用的电压所用的电压 低电压下低电压下DNA片段迁移率与所用的电片段迁移率与所用的电压成正比。电场强度升高时，高分子质量片段的迁移压成正比。电场强度升高时，高分子质量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝率遂不成比例

8、的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kbDNA片片段的良好分辨率，则所用电压不应高于段的良好分辨率，则所用电压不应高于58Vcm。v电泳缓冲液电泳缓冲液 DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子子强度的影响。缺乏离子(如用水替代电泳槽及凝胶中如用水替代电泳槽及凝胶中的缓冲液的缓冲液)则电导率降至很低，则电导率降至很低，DNA不是全然不动，就不是全然不动，就是迁移极慢。高离子强度时，如错用了是迁移极慢。高离子强度时，如错用了10电泳缓冲电泳缓冲液，电导率升高，即使应用适中的电压也会

9、产生大量液，电导率升高，即使应用适中的电压也会产生大量的热能。最严重时凝胶会熔化，的热能。最严重时凝胶会熔化，DNA会变性。会变性。材料材料q水平电泳槽及制胶模具水平电泳槽及制胶模具q琼脂糖琼脂糖q电泳缓冲液电泳缓冲液 q6凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液 qDNA样品样品qDNA大小标准品大小标准品q溴化乙锭溴化乙锭/SYBRGold q紫外透射仪紫外透射仪l标准标准(高熔点高熔点)琼脂糖琼脂糖 制造它的原料是两种海藻，制造它的原料是两种海藻，Gelidium和和Gracilaria。这两种琼脂糖的凝点和熔点有所不同，但是在实际应用中每。这两种琼脂糖的凝点和熔点有所不同，但是在实际应用中每种来源

10、的琼脂糖都可以用于分析或分离种来源的琼脂糖都可以用于分析或分离1-25kb范围的范围的DNA片段。新类型片段。新类型的标准琼脂糖具有高凝胶强度和低电内渗的标准琼脂糖具有高凝胶强度和低电内渗(EEO)，可以灌制浓度低至，可以灌制浓度低至0.3的凝胶。这种凝胶用于电泳能方便地分离高分子质量的凝胶。这种凝胶用于电泳能方便地分离高分子质量DNA(直到直到60kb)。它在任何浓度下它在任何浓度下DNA迁移速度均比通用的标准琼脂糖快迁移速度均比通用的标准琼脂糖快10-20。这一。这一增加在百万碱基大小增加在百万碱基大小DNA的的PFGE中将明显地节省时间。中将明显地节省时间。l低熔点凝点琼脂糖低熔点凝点琼

11、脂糖 通过羟乙基化修饰的琼脂糖在较低的温度熔化，通过羟乙基化修饰的琼脂糖在较低的温度熔化，羟乙基化替代的程度决定准确的熔化和凝结温度。低熔点凝点琼脂糖羟乙基化替代的程度决定准确的熔化和凝结温度。低熔点凝点琼脂糖主要用于主要用于DNA的快速回收，因为大多数该类型琼脂糖在的快速回收，因为大多数该类型琼脂糖在65熔化，这个熔化，这个温度远低于双链温度远低于双链DNA的解链温度。这种特性使它还可以用于的解链温度。这种特性使它还可以用于DNA的简单的简单纯化和酶处理；在熔化的凝胶中用核酸直接进行细菌转化。化学修饰的纯化和酶处理；在熔化的凝胶中用核酸直接进行细菌转化。化学修饰的琼脂糖比等浓度的标准琼脂糖有

12、更高的筛分能力。该发现使琼脂糖的分琼脂糖比等浓度的标准琼脂糖有更高的筛分能力。该发现使琼脂糖的分辨力接近聚丙烯酰胺凝胶，因此可用于辨力接近聚丙烯酰胺凝胶，因此可用于PCR产物、小片段产物、小片段DNA和小和小RNA(lkb)的分离。现在它能分辨少至的分离。现在它能分辨少至4bp的的DNA和分离和分离200-800bp范围范围内相差内相差2的的DNA片段。片段。载样缓冲液有三个作用载样缓冲液有三个作用：增加样品密度以保证增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内；沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；使样品带有颜色便于简化上样过程；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。其中的染料在

13、电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的的2.2倍，这倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。在一特性与琼脂糖浓度无关。在0.5TBE琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝迁移速率约与长溴酚蓝迁移速率约与长300bp的线状双链的线状双链DNA相同，而二甲相同，而二甲苯氰苯氰FF约与长约与长4000bp的的DNA相同。上述关系在浓度范围相同。上述关系在浓度范围0.51.4的琼脂糖凝胶中基本不受浓度变化的影响。用哪的琼脂糖凝胶中基本不受浓度变化的影响。用哪种载样缓冲液是个人的习惯。种载样缓冲液是个人的习惯。l通常使用已知分子质量

14、的通常使用已知分子质量的DNA样品，它们是经限制样品，它们是经限制性酶消化已知序列的质粒或噬菌体性酶消化已知序列的质粒或噬菌体DNA获得的。琼获得的。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳用的分子质量标准可以脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳用的分子质量标准可以从市场购得，或者实验室自己制备。一般最好有两从市场购得，或者实验室自己制备。一般最好有两套分子质量范围的标准，一个是套分子质量范围的标准，一个是1kb到大于到大于20kb的的高分子质量标准，一个是高分子质量标准，一个是100-1000bp的低分子质量的低分子质量标准。标准。分子质量标准贮备液用凝胶载样缓冲液稀释分子质量标准贮备液用凝胶载样缓冲液稀释后用于每次

15、电泳实验。后用于每次电泳实验。l溴化乙锭首先于溴化乙锭首先于20世纪世纪50年代合成成功，主要是作年代合成成功，主要是作为一种有效的杀锥虫制剂而发展起来的菲啶化合物。为一种有效的杀锥虫制剂而发展起来的菲啶化合物。溴化乙锭在筛选过程中脱颖而出。它的杀锥虫效能溴化乙锭在筛选过程中脱颖而出。它的杀锥虫效能是其母化合物的是其母化合物的1050倍，并对小鼠无毒，且与早倍，并对小鼠无毒，且与早期的菲啶化合物不同，对牛不具有光致敏作用。直期的菲啶化合物不同，对牛不具有光致敏作用。直到最近，溴化乙锭在热带及亚热带国家仍被广泛应到最近，溴化乙锭在热带及亚热带国家仍被广泛应用于牛锥虫病的治疗和预防。用于牛锥虫病的

16、治疗和预防。溴化乙锭包含一个平面的三环菲啶环，它能插入到双链溴化乙锭包含一个平面的三环菲啶环，它能插入到双链DNA堆叠的碱基对之间。当它插入到螺旋结构中，将保持与螺旋堆叠的碱基对之间。当它插入到螺旋结构中，将保持与螺旋结构纵轴垂直的位置，并在其上下方与碱基对形成范德华接结构纵轴垂直的位置，并在其上下方与碱基对形成范德华接触。尽管其平面三环结构被包埋，其外围苯基及乙基基团却触。尽管其平面三环结构被包埋，其外围苯基及乙基基团却伸出插入到伸出插入到DNA双螺旋结构的大沟中。在高离子强度的溶液双螺旋结构的大沟中。在高离子强度的溶液中，大约每中，大约每2.5个碱基对中插入一个分子的溴化乙锭，且与个碱基对

17、中插入一个分子的溴化乙锭，且与DNA的碱基组成无关。除沿螺旋纵轴方向发生的碱基组成无关。除沿螺旋纵轴方向发生3.4A的位置偏的位置偏移外，碱基对的几何结构和位置相对于螺旋结构并未发生改移外，碱基对的几何结构和位置相对于螺旋结构并未发生改变。这使得与溴化乙锭结合达到饱和的双链变。这使得与溴化乙锭结合达到饱和的双链DNA的长度增加的长度增加了了27。溴化乙锭也同样可以通过不同的化学作用方式与溴化乙锭也同样可以通过不同的化学作用方式与RNA以及热以及热变性或单链变性或单链DNA链内碱基对所形成的螺旋结构区相结合。链内碱基对所形成的螺旋结构区相结合。溴化乙锭平面基团的固定位置以及它与碱基的高度临近溴化

18、乙锭平面基团的固定位置以及它与碱基的高度临近使被结合的染料所产生的荧光与在自由溶液状态的染料使被结合的染料所产生的荧光与在自由溶液状态的染料相比增强相比增强2025倍。倍。254 nm的紫外线首先被的紫外线首先被DNA吸收，吸收，然后被传送到染料；而然后被传送到染料；而302nm以及以及366 nm的射线直接被的射线直接被染料自行吸收。这些被吸收的能量将在染料自行吸收。这些被吸收的能量将在590nm的橙红色的橙红色可见光谱区以可见光谱区以0.3的量子产额被重新释放出来。的量子产额被重新释放出来。大部分商品化的紫外线光源产生大部分商品化的紫外线光源产生302 nm的紫外线。溴化的紫外线。溴化乙锭

19、乙锭-DNA复合物在受到紫外线照射激发所产生的荧光，复合物在受到紫外线照射激发所产生的荧光，在在302nm的紫外线下明显要比的紫外线下明显要比366nm的要强，但要比短的要强，但要比短波紫外线波紫外线(254nm)的稍弱。然而，的稍弱。然而，302 nm紫外线所造成紫外线所造成染料的光褪色效应以及造成染料的光褪色效应以及造成DNA的断裂和缺口明显要较的断裂和缺口明显要较254nm紫外线少得多。紫外线少得多。溴化乙锭被广泛地用于琼脂糖凝胶中溴化乙锭被广泛地用于琼脂糖凝胶中DNA片段的定位，通常将它以片段的定位，通常将它以0.5g/ml的浓度被加入到胶中以及电泳缓冲液中。尽管加入溴化乙锭的浓度被加

20、入到胶中以及电泳缓冲液中。尽管加入溴化乙锭会导致线性双链会导致线性双链DNA的电泳迁移率减慢的电泳迁移率减慢15，但却可在紫外灯下直，但却可在紫外灯下直接检查凝胶。由于溴化乙锭接检查凝胶。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光强度要比未结合的染复合物的荧光强度要比未结合的染料强很多，少量的料强很多，少量的DNA(10 ng条带条带)也能从存在游离状态溴化乙锭也能从存在游离状态溴化乙锭的凝胶中被检测出来。的凝胶中被检测出来。当需要知道当需要知道DNA片段的准确大小片段的准确大小(如如DNA限制酶酶切图谱的鉴定限制酶酶切图谱的鉴定)，凝，凝胶应该在无胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用情况下电泳，电泳

21、结束后用EB染色。染色时，将凝胶染色。染色时，将凝胶浸入含有浸入含有EB(0.5g/ml)的电泳缓冲液中，室温下染色的电泳缓冲液中，室温下染色3045 min。染。染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量DNA(10 ng)片段时，片段时，通常要将染色后的凝胶浸入水中或通常要将染色后的凝胶浸入水中或1mmol/L MgSO4中，室温脱色中，室温脱色20min更易观察到。更易观察到。l一种快捷和灵敏的方法是应用溴化乙锭分子的插入一种快捷和灵敏的方法是应用溴化乙锭分子的插入可通过紫外线照射产生荧光。由于荧光的亮度与可通过紫外线照射产生荧光。由于荧光的亮度与

22、DNA的含量成相关，的含量成相关，DNA的含量可通过样品在的含量可通过样品在590 nm处的光量度与一系列标准品的对照来估算。处的光量度与一系列标准品的对照来估算。SYBRGold是由是由MolecularProbes公司开发的一种新型的极敏感的染料的商公司开发的一种新型的极敏感的染料的商品名称。其与品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大的增强荧光信号。结合的亲和力高，并且结合后，能够极大的增强荧光信号。SYBRGold-DNA复合物产生光子的量比复合物产生光子的量比EB-DNA复合物要大的多，同时其激复合物要大的多，同时其激发的荧光信号强度是发的荧光信号强度是EB-DNA复合

23、物的复合物的1000多倍。因此用多倍。因此用SYBRGold染色可染色可以检测出琼脂糖凝胶中小于以检测出琼脂糖凝胶中小于20pg的双链的双链DNA(是是EB染色最低检测量的染色最低检测量的1/25)。此外，利用此外，利用SYBRGold染色可以检测出广个条带少至染色可以检测出广个条带少至100pg的单链的单链DNA或或300pg的的RNA。SYBRGold染料的最大激发波长为染料的最大激发波长为495nm。同时在。同时在300nm有有第二个激发峰。其发射的荧光波长为第二个激发峰。其发射的荧光波长为537nm。DNA片段经过凝胶电泳分离后，用片段经过凝胶电泳分离后，用SYBRGold贮存液的稀释

24、液贮存液的稀释液(1：10 000)浸浸染凝胶。不能将染凝胶。不能将SYBR Gold加入熔化的凝胶中或电泳前加入凝胶，这是由于加入熔化的凝胶中或电泳前加入凝胶，这是由于在在SYBRGold存在的情况下，凝胶中核酸的电泳条带会产生严重变形。存在的情况下，凝胶中核酸的电泳条带会产生严重变形。当用当用SYBRGold染色的凝胶在波长为染色的凝胶在波长为300nm的紫外照射下具有最高的灵敏度。的紫外照射下具有最高的灵敏度。由于由于SYBR Gold对荧光敏感，所以其工作液对荧光敏感，所以其工作液(1：10 000稀释的贮存液稀释的贮存液)应该当应该当天用电泳缓冲液新鲜配制，室温存放。天用电泳缓冲液新

25、鲜配制，室温存放。准备好制胶用的模具，置于水平支架或台面上。准备好制胶用的模具，置于水平支架或台面上。配制足量的电泳缓冲液配制足量的电泳缓冲液(1TAE或或0.5TBE)用以灌满电用以灌满电泳槽和配制凝胶泳槽和配制凝胶 配胶和灌满电泳槽使用同一批缓冲液很重要。因为离子强度或pH很小的差别也会在凝胶前部产生紊乱，严重影响DNA片段的泳动。根据欲分离根据欲分离DNA片段大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼片段大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的电脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。在沸水浴或微

26、波炉内加热至琼脂糖熔化。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。警惕：微波炉加热过长，琼脂糖溶液会变得过热或剧烈沸腾。仅加热所有琼脂糖颗粒完全溶解需要的最短时间。通常未溶解的琼脂糖呈小透明体或半透明碎片悬浮在溶液中。溶解较高浓度的琼脂糖需要较长的加热时间。要查看煮沸后是否由于蒸发而溶液体积减少，如有必要用水恢复原体积。用隔离手套或夹子转移三角烧瓶或玻璃瓶到用隔离手套或夹子转移三角烧瓶或玻璃瓶到55水浴。待熔化的凝胶稍冷却后加入溴化乙锭，终水浴。待熔化的凝胶稍冷却后加入溴化乙锭，终浓度为浓度为0.5g/ml。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。液。琼脂糖溶液正在冷却时，用一个合

27、适的梳子形琼脂糖溶液正在冷却时，用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置应在托盘底面上成加样孔。梳齿的位置应在托盘底面上0.51.0mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。要求的加样孔。多数凝胶托盘都有适宜放梳子的侧壁或外侧支架。如果没有或不合适，梳齿可能会太接近托盘底面，在拔出梳子时易穿透加样孔的底部。样品液将从凝胶和加样孔之间泄漏。应用低浓度琼脂糖(0.6)或低凝点琼脂糖时这种问题尤其容易发生。浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。凝胶适宜厚度为3-5mm。需检查在梳齿下或梳齿间应无气泡。让凝胶溶液完全凝结，室温下让凝胶溶液

28、完全凝结，室温下30-45 min。加少量电泳缓冲液。加少量电泳缓冲液于凝胶顶部，小心拔出梳子。倒出电泳缓冲液。轻轻撕去封于凝胶顶部，小心拔出梳子。倒出电泳缓冲液。轻轻撕去封边胶带，将凝胶安放到电泳槽内。边胶带，将凝胶安放到电泳槽内。向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。混合混合DNA样品和样品和0.2倍体积倍体积6载样缓冲液。载样缓冲液。加样孔能加入DNA的最大量取决于样品中DNA片段的大小和数目。溴化乙锭染色的凝胶图像可以观测到的最小量DNA在5mm宽(通用加样孔宽度)条带中为2 ng。使用更敏感的染料，如SYBRGold可以检测出少至20pg

29、的DNA。若一个5mm宽条带含有500ng以上的DNA时，说明加样孔过载，会导致拖尾和模糊不清等现象。如果DNA长度增加上述现象变得更为严重。分析单一DNA样品，如噬菌体或质粒DNA，每个5mm宽加样孔可加100-500ngDNA。如果样品由不同大小的许多DNA片段组成，如哺乳动物DNA酶切样品，则每个加样孔加入20-30g的DNA也不会造成分辨率明显下降。能 加 样 的 最 大 体 积 是 由 加 样 孔 容 积 决 定 的。通 用 的 加 样 孔0.5cm0.5cm0.15cm可容纳约40l。切忌将加样孔加得太满，甚至溢出。为避免溢出污染邻孔样品，最好凝胶稍厚些增加孔容积或通过乙醇沉淀浓缩

30、DNA减少加样体积。用微量移液器及一次性吸头，将样品混合液缓慢加至浸没凝用微量移液器及一次性吸头，将样品混合液缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。分子质量标准应分别加至样品孔的左侧和右胶的加样孔内。分子质量标准应分别加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。侧的两个孔内。关上电泳槽盖，接好电极插头。关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA应向阳极应向阳极(红色插头红色插头)侧侧泳动。泳动。给予给予15V/cm的电压，其中距离以阳极至阴极之间的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。的测量为准。如电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡，并且几分钟内溴酚蓝从加样孔迁移进入胶体内。待溴酚蓝和二甲苯氰FF迁移

31、到适当距离后再停止电泳。溴化乙锭的存在使电泳的任何阶段都可以在紫外灯下观察凝胶。当当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔出电极插头和打开电泳槽盖。若凝胶和缓冲液有溴化乙锭拔出电极插头和打开电泳槽盖。若凝胶和缓冲液有溴化乙锭即用紫外灯观察凝胶和照相。否则凝胶在含溴化乙锭即用紫外灯观察凝胶和照相。否则凝胶在含溴化乙锭(0.5g/ml)的电泳缓冲液中室温浸染的电泳缓冲液中室温浸染3045min，或者用电泳，或者用电泳缓冲液缓冲液1：10 000稀释的稀释的SYBRGold贮备液浸染。贮备液浸染。l不必过于恐慌。不必过于恐慌。l注意个人防护。注意个人防护。l关心他人身心健康，尽可能减小污染范关心他人身心健康，尽可能减小污染范围！严格遵守实验操作规范！围！严格遵守实验操作规范！责任重于泰山责任重于泰山！