第二十二章免疫学检测技术的基本原理课件.ppt

1、 第二十二章第二十二章 免疫学检测技术的基本原理免疫学检测技术的基本原理第一节 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素（一）抗原抗体反应的特点1.高度特异性2.表面化学基团之间的可逆结合3.适宜的抗原抗体浓度和比例4.抗原抗体反应的两个阶段1.高度特异性 抗原表位与抗体分子的超变区互补结合抗体检测抗原：抗伤寒杆菌的抗体：检测伤寒杆菌抗原检测抗体：乙肝病毒：检测乙肝病毒抗体 2.表面化学集团之间的可逆结合 抗原抗体之间：非共价键结合 结合不稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响。3.适宜的抗原抗体浓度和比例 抗原或抗体过剩，形成的IC复合物体积小，数量少，肉眼不可见；抗原抗体浓度和比例适当：IC复

2、合物体积大，数量多，肉眼可见。4.抗原抗体反应的两个阶段 第一阶段：数秒至数分，形成小的IC；第二阶段：数分、数小时至数日，形成 较大IC复合物。（二）抗原抗体反应的影响因素1.电解质2.温度3.酸碱度1.电解质：离子强度 在适当浓度的电解质中：抗原抗体易结合为肉眼可见的凝聚物或沉淀物。实验中常用0.85%的NaCl等离子溶液作稀释液。2.温度 体温或稍高于体温 37C是抗原抗体反应的最适温度。3.酸碱度 最适酸碱度：pH 6-8第二节 检测抗原和抗体的 体外实验（体液免疫检测）血清学试验：抗原和其相应的抗体在体外相遇可发生特异性结合，用已知的抗体（或抗原）检测未知的抗原（或抗体），用于疾病的

3、诊断。因为实验所采用的抗体常存在于血清或体液中（关节液、脑脊液、胸水及腹水），将体外的抗原-抗体反应称为血清学反应。1.凝集反应 2.沉淀反应 3.免疫标记技术 4.蛋白质芯片技术 1.凝集反应 细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒状物质与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。（1）直接凝集反应 （2）间接凝集反应（1）直接凝集反应：颗粒性抗原直接与相应的 抗体反应出现的凝集现象，如红细胞的凝 集（ABO血型）、细菌凝集。玻片法：定性，ABO血型、菌种鉴定 试管法：半定量，检测Ab的效价（2）间接凝集反应：将可溶性抗原或抗体先吸 附在某些颗粒载体上，然后与相应抗体

4、或 抗原进行反应产生的凝集现象。类风湿因子检测：人变性IgG（抗原）吸附于 乳胶颗粒，检测待检血清中的RF。2.沉淀反应：毒素、组织浸液及血清中的蛋白 等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼 可见的沉淀物。液相：环状、絮状沉淀反应，比浊法（检测 血浆蛋白、IgG、M、A和补体）半固相：单向、双向琼脂扩散、免疫电泳 3.免疫标记技术：是将抗原抗体反应与标记技 术相结合，检测抗原或抗体的一类试验方法。将已知的抗体或抗原标记上示踪物质，通过 检测标记物间接测定抗体或抗原的量。常用标记物：酶、荧光素、放射性核素、胶 体金、化学发光物等。定性、精确定量、定位 （1）免疫酶测定法：是一种用酶标记一抗或 二

5、抗检测特异性抗原或抗体的方法。常用标记酶：辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶(ALP)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)：(1)双抗体夹心法(sandwich ELISA)(2)间接ELISA免疫组织化学技术(immunohistochemistry technique):对组织抗原进行定位、定性、定量的检测技术。酶、化学发光、荧光技术。ELISA法将抗原和抗体的免疫反应和酶的法将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合，具有特异性而且极为敏感，催化反应相结合，具有特异性而且极为敏感，可以在细胞或亚细胞水平上检测抗原或抗体所可以

6、在细胞或亚细胞水平上检测抗原或抗体所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。定量。ELISA ELISA法是目前广泛应用于临床检测和生物法是目前广泛应用于临床检测和生物制药等领域的免疫学技术，具有微量、特异、制药等领域的免疫学技术，具有微量、特异、高效、经济、方便和安全等特点。高效、经济、方便和安全等特点。l结合物和相应的抗体或抗原反应后，结合物和相应的抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的结合在免疫复合物上的酶酶在遇到相应在遇到相应的底物时，可的底物时，可催化底物水解、氧化或催化底物水解、氧化或还原，还原，从而从而产生有色物质产生有色物质。l因为

7、颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，因为颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，l所以可以借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。所以可以借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。ELISA 检测抗体检测抗体v洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。(2)免疫荧光技术(immunofluorescence technique)常用荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC)藻红蛋白(PE)1)直接荧光法 2)间接荧光法(3)放射免疫测定

8、法(radioimmunoassay,RIA)(4)化学发光免疫技术(5)免疫胶体金技术(6)免疫印迹技术(Western blotting)通常采用不连续电泳通常采用不连续电泳系统，通过系统，通过电荷效应电荷效应，浓浓缩效应缩效应和和分子筛效应分子筛效应，达，达到蛋白质高分辨率的分离到蛋白质高分辨率的分离效果。效果。v SDSSDS：十二烷基硫酸钠，一种阴离子表面活性剂，可使蛋白质的：十二烷基硫酸钠，一种阴离子表面活性剂，可使蛋白质的氢键和疏水健打开，与之形成氢键和疏水健打开，与之形成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物。由于。由于SDSSDS带有负带有负电荷，消除了不同蛋白质间原有的电荷差

9、异，使蛋白质分子在凝胶电荷，消除了不同蛋白质间原有的电荷差异，使蛋白质分子在凝胶中的迁移率主要取决于它的分子量。中的迁移率主要取决于它的分子量。4.蛋白质芯片技术 快速、准确、高通量的检测技术第三节 免疫细胞功能的检测（细胞免疫检测）一、免疫细胞的分离 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法 二、免疫细胞功能的测定 1.T细胞功能测定 2.B细胞功能测定(1)抗凝抗凝静脉血静脉血(2)加等加等量量NS(4)密度梯度离心密度梯度离心血浆血浆分离液分离液RBCPBMCPMN(3)混匀后，缓混匀后，缓慢加于分离液上慢加于分离液上1.T细胞功能测定 （1）T细胞增殖试验 1）形态计数法：T细胞受到有丝分裂原刺

10、激，出现体积增大、细胞形态不规则、胞质增多、细胞核松散并出现多个核仁等形态变化。2）3H-TdR掺入法 3）MTT法 PHA刺激4872小时培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性淋巴细胞增殖试验（淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图掺入法）示意图E-玫瑰花结试验示意图玫瑰花结试验示意图（2）迟发型超敏反应(DTH)的检测 常用于检测：病原微生物感染、免疫缺陷病和肿瘤患者的免疫功能测定。常用皮试制剂：结核菌素、念珠菌素等。2.B细胞功能测定 （1）各类Ig的测定：单扩、试管法、比 浊法、ELISA等；（2）抗体形成细胞测定：溶血空斑试验、ELISPOT法 3.细胞毒

11、试验 检测CTL、NK等细胞杀伤靶细胞活性的一种细胞学技术。(1)51Cr释放法(2)乳酸脱氢酶释放法(3)细胞染色法(4)凋亡细胞检测法：1）形态学检测法 2）琼脂凝胶电泳 3）FACS(流式细胞术:FCM)4）TUNEL法4.吞噬功能测定 （1）中性粒细胞吞噬试验 （2）巨噬细胞吞噬试验5.细胞因子的检测 （1）生物活性检测法 （2）免疫学检测法免疫学预防与治疗免疫学预防与治疗第二十三章第二十三章 根据免疫学原理，利用物理、化学和生物学根据免疫学原理，利用物理、化学和生物学的手段人为地增强或抑制机体的免疫功能，达的手段人为地增强或抑制机体的免疫功能，达到预防和治疗疾病目的的措施。到预防和治

12、疗疾病目的的措施。免疫学防治免疫学防治免疫学防治免疫学防治How to get immunity to the diseases?How to get immunity to the diseases?自然免疫自然免疫主动主动被动被动人工免疫人工免疫主动主动被动被动特异性免疫获得的方式特异性免疫获得的方式自然免疫自然免疫人工免疫人工免疫自动免疫自动免疫 被动免疫被动免疫显性感染显性感染隐性感染隐性感染胎儿或新生胎儿或新生儿从母体获儿从母体获得得抗体抗体主动免疫主动免疫 被动免疫被动免疫注射疫苗注射疫苗注射抗体或注射抗体或细胞因子细胞因子获得免疫的途径获得免疫的途径n主动免疫主动免疫（Artif

13、icial active immunity）给机体输入给机体输入抗原性物质抗原性物质，激活机体的免疫应答，使机体自身，激活机体的免疫应答，使机体自身产生抵抗疾病的能力。产生抵抗疾病的能力。n被动免疫被动免疫（Artificial passive immunity）将对疾病有免疫力的供者的将对疾病有免疫力的供者的免疫应答产物免疫应答产物转移给受者，或自转移给受者，或自体免疫细胞体外处理后回输自身，以预防或治疗疾病。体免疫细胞体外处理后回输自身，以预防或治疗疾病。自然主动免疫自然主动免疫人工主动免疫人工主动免疫自然被动免疫自然被动免疫人工被动免疫人工被动免疫第一节 免疫预防疫疫 苗苗概念：疫苗是利

14、用微生物及其代谢产物，概念：疫苗是利用微生物及其代谢产物，经过人工减毒或灭活或基因工程等经过人工减毒或灭活或基因工程等 方法制成，用于预防疾病的人工主方法制成，用于预防疾病的人工主 动免疫制剂。动免疫制剂。疫疫 苗苗疫苗的基本要求疫苗的基本要求 安全安全 有效有效 实用实用包括：细菌疫苗、病毒疫苗、原虫疫苗、包括：细菌疫苗、病毒疫苗、原虫疫苗、避孕疫苗、肿瘤疫苗等。避孕疫苗、肿瘤疫苗等。疫苗的主要保护机制疫苗的主要保护机制中和抗体中和抗体Th B7MHC-II TCR CD4 ICAM LFA-1APCThThBCD40L CD40分泌细胞因子ThBBB浆细胞BCR抗原Bm CD28Vacci

15、nation疫苗的分类疫苗的分类n减毒活疫苗减毒活疫苗n灭活疫苗灭活疫苗n类毒素疫苗类毒素疫苗 n亚单位疫苗亚单位疫苗nDNADNA疫苗疫苗n可食用疫苗可食用疫苗减毒活疫苗减毒活疫苗 是用减毒或无毒力的是用减毒或无毒力的活病原微生物活病原微生物制成。制成。卡介苗、口服小儿麻痹疫苗（糖丸）卡介苗、口服小儿麻痹疫苗（糖丸）优点：优点：模拟自然感染，一般只需接种一次。模拟自然感染，一般只需接种一次。免疫原性强、免疫效果好免疫原性强、免疫效果好 缺点：缺点：可能出现毒力回复突变可能出现毒力回复突变减毒活疫苗减毒活疫苗牛型结核杆菌牛型结核杆菌 Mycobacterium bovis 置于含胆汁的置于含胆

16、汁的培养基，逐渐培养基，逐渐增加胆汁的浓增加胆汁的浓度度卡介苗卡介苗 Bacillus Calmette-Guerin （BCG）在胆汁中适应性生在胆汁中适应性生长，充分减毒成为长，充分减毒成为预防肺结核的疫苗。预防肺结核的疫苗。13年年230次传代次传代法国科学家法国科学家CalmetteGuerin灭活疫苗灭活疫苗 选用免疫原性强的病原体，经人工大量培养后，选用免疫原性强的病原体，经人工大量培养后，用理化方法灭活制成。又称用理化方法灭活制成。又称“死疫苗死疫苗”。如：流感疫苗、甲肝疫苗如：流感疫苗、甲肝疫苗 优点：优点：安全安全 缺点：缺点：免疫原性较差，主要诱导特异性抗体的免疫原性较差，

17、主要诱导特异性抗体的 产生；需加强免疫。产生；需加强免疫。流感疫苗制备流程流感疫苗制备流程死疫苗和活疫苗的比较 区别点制剂特点接种剂量及次数副作用保存及有效期免疫效果 灭活疫苗死、强毒株较多，2-3次较大易保存，较稳定较差，维持数月至2年 减毒活疫苗活、弱毒或无毒较少，1次较小易失效，4保存较好，维持3-5年或更长类毒素疫苗类毒素疫苗 类毒素是用细菌的外毒素经类毒素是用细菌的外毒素经0.30.4%甲醛处理制甲醛处理制成。如破伤风、百日咳、白喉类毒素疫苗成。如破伤风、百日咳、白喉类毒素疫苗亚单位疫苗亚单位疫苗提取或合成天然微生物某些成分的亚单位（如外壳的特殊提取或合成天然微生物某些成分的亚单位（

18、如外壳的特殊蛋白结构）制成的疫苗。如：乙肝疫苗、蛋白结构）制成的疫苗。如：乙肝疫苗、HPV（宫颈癌）（宫颈癌）疫苗；细菌荚膜多糖疫苗等。疫苗；细菌荚膜多糖疫苗等。优点：优点：副作用小、更为安全、稳定副作用小、更为安全、稳定缺点：缺点：免疫原性低，需与佐剂合用。免疫原性低，需与佐剂合用。乙肝病毒（乙肝病毒（HBsAg）HPV病毒（病毒（L1蛋白）蛋白）DNA疫苗的优缺点疫苗的优缺点n优点优点：可同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答：可同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答 制备工艺简单，生产成本低，适于大批量生产。制备工艺简单，生产成本低，适于大批量生产。比传统疫苗安全。比传统疫苗安全。性质稳定，易于

19、保存、运输。性质稳定，易于保存、运输。可生产多价疫苗，同时预防多种病原体感染。可生产多价疫苗，同时预防多种病原体感染。n缺点：缺点：是否整合至宿主基因组是否整合至宿主基因组,诱导癌变？诱导癌变？长期持续表达是否诱导免疫耐受？长期持续表达是否诱导免疫耐受？是否产生抗是否产生抗DNA抗体？抗体？我国推行的儿童基础免疫程序我国推行的儿童基础免疫程序 年年 龄龄出生时2个月3个月4个月5个月 疫疫 苗苗卡介苗、乙肝疫苗三价脊髓灰质炎疫苗1三价脊髓灰质炎疫苗2，百白破1三价脊髓灰质炎疫苗3，百白破2百白破3 年年 龄龄8个月1.5-2岁4岁7岁12岁 疫疫 苗苗麻疹疫苗百白破4三价脊髓灰质炎疫苗4卡介苗

20、、麻疹疫苗、白破二联疫苗卡介苗（农村）新疫苗的审核：新疫苗的审核：3期临床试验期临床试验 I I期：以新疫苗的的期：以新疫苗的的安全性安全性为主为主 ；期：以新疫苗的期：以新疫苗的有效性有效性为主；为主；期：证明新疫苗预防传染病的期：证明新疫苗预防传染病的免疫保护性免疫保护性为主。为主。疫苗的临床试验疫苗的临床试验第二节第二节 免疫治疗免疫治疗n抗体为基础的免疫治疗抗体为基础的免疫治疗n抗原为基础的免疫治疗抗原为基础的免疫治疗n细胞因子为基础的免疫治疗细胞因子为基础的免疫治疗n细胞为基础的免疫治疗细胞为基础的免疫治疗抗体为基础的免疫治疗抗体为基础的免疫治疗n抗毒素抗毒素(antitoxin(a

21、ntitoxin）用细菌外毒素多次免疫马后获得免疫马血清，血清中含有大用细菌外毒素多次免疫马后获得免疫马血清，血清中含有大量能中和该外毒素的量能中和该外毒素的IgGIgG类抗体，经浓缩纯化获得抗毒素。如：类抗体，经浓缩纯化获得抗毒素。如：白喉抗毒素、破伤风抗毒素白喉抗毒素、破伤风抗毒素 用途：治疗、紧急预防用途：治疗、紧急预防n人特异性免疫球蛋白人特异性免疫球蛋白 来源：恢复期病人、含高效价来源：恢复期病人、含高效价特异性抗体特异性抗体的供血者的供血者 接受类毒素和疫苗免疫者的血浆接受类毒素和疫苗免疫者的血浆n丙种球蛋白（丙种球蛋白（g g-globulin）胎盘丙种球蛋白、人血浆丙种球蛋白胎

22、盘丙种球蛋白、人血浆丙种球蛋白 来源：健康人静脉血来源：健康人静脉血 健康产妇胎盘血（脐血）健康产妇胎盘血（脐血）用途：用于多种病毒性疾病的防治，治疗先天性丙种用途：用于多种病毒性疾病的防治，治疗先天性丙种 球蛋白缺乏症，可提高对某些严重细菌性和病球蛋白缺乏症，可提高对某些严重细菌性和病 毒性疾病的疗效毒性疾病的疗效单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonal antibody)H2003PsoriasisRaptivaGenentech/XomaC1997Non-Hodgkins LymphomaRituxanBiogenIdec/Genentech/RocheM2003Non-Hodgki

23、ns Lymphoma BexxarCorixa/GlaxoSmithKlineC2004Colorectal CancerErbitux BMS/ImClone SystemsH2003Asthma XolairNovartis/Genentech/TanoxPD2002Rheumatoid ArthritisHumiraAbbott/CATH2001Chronic Lymphocytic LeukemiaCampathSchering/ILEX OncologyH2000Acute Myleoid LeukemiaMylotargWyethC1998Acute Transplant Rej

24、ectionSimulectNovartisC1998Crohns,Rheumatoid ArthritisRemicadeJ&JHH19982004Breast CancerColorectal CancerHerceptinAvastin Genentech/RocheH1998Viral Respiratory DiseaseSynagisMedImmune/AbbottH1997Acute Transplant RejectionZenapaxPDLIM2002Non-Hodgkins LymphomaZevalinBiogenIdecC1994Acute Cardiac Condit

25、ionsReoProJ&J/Eli Lilly M1986Organ Transplant RejectionOrthoclone-OKTOrtho BiotechAntibody Type(2)Date of FDA ApprovalIndicationsName of Product(1)Company Name美国美国FDA批准生产用于临床治疗的单克隆抗体批准生产用于临床治疗的单克隆抗体临床用单克隆抗体临床用单克隆抗体nAnti-molecule on the saface of cells antibodynAnti-cytokines monoclonal antibodynMono

26、clonal antibodies coupled with toxic agent.(抗抗体导向药物体导向药物/免疫毒素免疫毒素)一、抗细胞表面分子抗体一、抗细胞表面分子抗体nAnti-CD20 antibodies：Rituximab,Zevalin,BexxarnAnti-CD3 antibodies:Othoclone(OKT3)nAnti-Her-2 antibodies:Her-2/neu抗体导向药物抗体导向药物TumorMcAb-toxinMcAb-medicineMcAb-isotope 将化疗药物、毒素、放射性同位素等细胞毒性物将化疗药物、毒素、放射性同位素等细胞毒性物质偶联

27、到肿瘤单抗上，从而制备抗肿瘤单抗偶联物，质偶联到肿瘤单抗上，从而制备抗肿瘤单抗偶联物，也称免疫偶联物也称免疫偶联物 放射免疫偶联物放射免疫偶联物 90Y（钇），（钇），131I 化学偶联物化学偶联物 免疫毒素免疫毒素 植物毒素植物毒素 细菌毒素细菌毒素基因工程抗体基因工程抗体 通过DNA重组和蛋白质工程技术，在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，重新组装而成的新型抗体分子人鼠嵌和人鼠嵌和Ab人源化人源化Abn保留了天然抗体的特异性和主要生物学功能。保留了天然抗体的特异性和主要生物学功能。n减少鼠源成分，其免疫原性减弱，减少副作用。减少鼠源成分，其免疫原性减弱，减少副作用。n赋予抗体分子新

28、的生物学功能。赋予抗体分子新的生物学功能。n小分子抗体穿透实体瘤的能力大大增强。小分子抗体穿透实体瘤的能力大大增强。基因工程抗体优点基因工程抗体优点抗原为基础的免疫治疗抗原为基础的免疫治疗n合成肽表位疫苗合成肽表位疫苗n重组抗原疫苗重组抗原疫苗nDNA疫苗疫苗n重组病毒疫苗重组病毒疫苗增强免疫应答：肿瘤、病毒感染性疾病增强免疫应答：肿瘤、病毒感染性疾病诱导免疫耐受：诱导免疫耐受：AID、超敏反应、移植排斥、超敏反应、移植排斥 治疗性疫苗治疗性疫苗 针对机体异常的免疫状态，人工给予抗原以增强针对机体异常的免疫状态，人工给予抗原以增强免疫应答或诱导免疫耐受来治疗疾病免疫应答或诱导免疫耐受来治疗疾病

29、细胞为基础的免疫治疗细胞为基础的免疫治疗 将自体或异体的造血细胞、免疫细胞或肿瘤细胞经将自体或异体的造血细胞、免疫细胞或肿瘤细胞经体外培养、诱导扩增后回输机体，以激活或增强机体体外培养、诱导扩增后回输机体，以激活或增强机体的免疫应答。的免疫应答。造血干细胞移植：造血干细胞移植：骨髓移植、外周血干细胞、脐血干细胞骨髓移植、外周血干细胞、脐血干细胞 免疫效应细胞输注：免疫效应细胞输注：NK细胞、细胞、LAK细胞、细胞、CIK细胞、细胞、TIL细胞细胞 DC细胞：细胞：PBMC经经IL-4、GM-CSF诱导扩增为诱导扩增为DC细胞。细胞。肿瘤疫苗：肿瘤疫苗：自体或异体肿瘤细胞经物理、化学或生物学处自体或异体肿瘤细胞经物理、化学或生物学处 理，使肿瘤细胞失去分裂增殖能力，保留其免疫理，使肿瘤细胞失去分裂增殖能力，保留其免疫 原性，制成减毒或灭活的瘤苗原性，制成减毒或灭活的瘤苗教学要求n人工主动免疫的概念，优缺点，主要制剂（灭活人工主动免疫的概念，优缺点，主要制剂（灭活疫苗、减毒活疫苗、类毒素、亚单位疫苗，基因疫苗、减毒活疫苗、类毒素、亚单位疫苗，基因工程疫苗）。工程疫苗）。n人工被动免疫的概念，优缺点，主要制剂（抗毒人工被动免疫的概念，优缺点，主要制剂（抗毒素，正常人丙球和胎球，人特异性素，正常人丙球和胎球，人特异性Ig）。）。n治疗用单克隆抗体的分类。治疗用单克隆抗体的分类。